相關(guān)申請本申請要求于2014年6月26日提交的第62/017,699號美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。本發(fā)明涉及一種組合物和使用該組合物向受試個體口服遞送生物活性劑的方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含基質(zhì)和層疊(layered)在該基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑的組合物以及減少人畜共患傳染病的方法。本發(fā)明還涉及制備該組合物的方法。
背景技術(shù)：
：控制人畜共患傳染病和抗菌劑耐藥性有助于降低疾病的傳播性。當(dāng)前控制人畜共患傳染病的策略包括部署殺蟲劑作為消除地方性動物病循環(huán)的媒介的手段。然而，殺蟲劑的使用對受試個體和環(huán)境具有毒性脫靶效應(yīng)。預(yù)防性和治療性抗生素的使用會不經(jīng)意地一起導(dǎo)致在人畜共患傳染病循環(huán)中得以留存的致病原的抗菌劑耐藥性菌株的進化。此外，盡管易感宿主預(yù)防劑或治療劑的施用通常采用腸胃外給藥，但是這些給藥方法帶來了成本和物流方面的挑戰(zhàn)。此外，與腸胃外方法相比，口服遞送的預(yù)防劑或治療劑的制造更加經(jīng)濟，提供顯著的易用性，并且引起的副作用較少。技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明內(nèi)容部分描述了本發(fā)明的幾個實施方案，并且在許多情況下列出了這些實施方案的變型和變換。
發(fā)明內(nèi)容部分僅僅是許多不同實施方案的示例。提及指定實施方案的一個或多個代表性特征同樣是示例性的。這樣的實施方案通?？梢跃哂谢虿痪哂兴峒暗奶卣?；同樣地，這些特征可以適用于本發(fā)明的其他實施方案，無論該實施方案是否在
發(fā)明內(nèi)容部分中列出。為了避免過度重復(fù)，
發(fā)明內(nèi)容部分沒有列出或暗示這些特征的所有可能的組合。本發(fā)明涉及一種組合物和使用該組合物向受試個體口服遞送生物活性劑的方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含基質(zhì)和層疊在該基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑的組合物以及減少人畜共患傳染病的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過將該組合物施用給受試個體來降低抗菌劑耐藥性的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一種組合物。所述組合物包括基質(zhì)、層疊在該基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑和交聯(lián)劑。在一些實施方案中，在有利于脫水生活(anhydrobiosis)的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑。在一些實施方案中，所述組合物通過以下步驟制備：(1)在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定至少一種生物活性劑，(2)將經(jīng)過穩(wěn)定的至少一種生物活性劑施用于基質(zhì)表面，(3)通過將交聯(lián)劑施加到基質(zhì)上來交聯(lián)該經(jīng)過穩(wěn)定的至少一種生物活性劑，和(4)在一定溫度范圍的環(huán)境溫度下以及強制通風(fēng)(forcedair)的條件下干燥。在一些實施方案中，該溫度為約20℃至約35℃。在一些實施方案中進一步提供的組合物還包括組合物的外表面上的包衣。在一些實施方案中，該外表面上的包衣為蟲膠包衣。在一些實施方案中，所述包衣為腸溶包衣。在一些實施方案中，基質(zhì)的平均直徑為約100μm至約2cm。在一些實施方案中，穩(wěn)定劑包括但不限于水膠體聚合物或增塑糖。在一些實施方案中，增塑糖包括蔗糖、海藻糖的非限制性實例。在一些實施方案中，水膠體聚合物的非限制性實例為藻酸鈉。在一些實施方案中，交聯(lián)劑為鈣鹽。交聯(lián)劑的實例包括但不限于乳酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、乙酸鈣或抗壞血酸鈣。在本發(fā)明的一些實施方案中，基質(zhì)的實例包括但不限于顆粒(pellet)、可咀嚼物(chewable)、珠粒(bead)和粉末。在一些實施方案中，珠粒包括微晶纖維素珠粒的非限制性實例。在一些實施方案中，基質(zhì)包括植物基物質(zhì)或土基(earthen-based)物質(zhì)。在一些實施方案中，土基物質(zhì)包括但不限于土壤或水。在一些實施方案中，生物活性劑為被改造(engineered)成表達一種或多種抗原的重組全細胞細菌。在一些實施方案中，全細胞細菌包括但不限于乳桿菌(lactobacillus)，包括嗜酸乳桿菌(l.acidophilus)、短乳桿菌(l.brevis)、干酪乳桿菌(l.casei)、卷曲乳桿菌(l.crispatus)、發(fā)酵乳桿菌(l.fermentum)、加氏乳桿菌(l.gasseri)、植物乳桿菌(l.plantarum)、羅伊氏乳桿菌(l.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(l.rhamnzosus)和唾液乳桿菌(l.salivarius)。在一些實施方案中，一種或多種抗原為一種或多種伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)抗原。在一些實施方案中，進一步提供的基質(zhì)的量為組合物的約85％w/w至約99％w/w。在一些實施方案中，基質(zhì)為本發(fā)明組合物的約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％w/w和約99％w/w。在一些實施方案中，穩(wěn)定劑的量為組合物的約1％w/w至約15％w/w。穩(wěn)定劑為本文公開的組合物的約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％w/w和約15％w/w。在一些實施方案中，生物活性劑的有效量是最小免疫劑量(mid)為約5×103cfu至約5×107cfu的致免疫有效量(immunogenicallyeffectiveamount)。在一些實施方案中，mid為約5×103cfu、5×104cfu、5×105cfu、5×106cfu和約5×107cfu。在一些實施方案中，交聯(lián)劑的量為組合物的約0.5％w/w至約7.5％w/w。交聯(lián)劑為組合物的約0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％w/w和約7.5％w/w。此外，在一些實施方案中，包衣的量為組合物的約1.5％w/w至約22.5％w/w。包衣為本文公開的組合物的約1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％和約22.5％。在本發(fā)明的一些實施方案中，還提供了用于口服遞送生物活性劑的組合物。所述組合物包括基質(zhì)、涂覆或?qū)盈B在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑和促進抗原(antigenic)在基質(zhì)表面上穩(wěn)定劑中的包封的交聯(lián)劑。在一些實施方案中，在選自水膠體聚合物、增塑糖和海藻糖的穩(wěn)定劑中穩(wěn)定至少一種生物活性劑。在一些實施方案中，生物活性劑為抗原劑。此外，在一些實施方案中，還提供了制備用于口服遞送生物活性劑的組合物的方法。該方法包括以下步驟：(1)在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定至少一種抗原劑；(2)將經(jīng)過穩(wěn)定的至少一種抗原劑涂覆在基質(zhì)上；(3)施加交聯(lián)劑；(4)進行交聯(lián)以促進抗原劑的凝膠化或包封；以及(5)在環(huán)境溫度下以及強制通風(fēng)條件下干燥。在一些實施方案中，該溫度在約20℃至約35℃的范圍內(nèi)。該溫度為約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和約35℃。在一些實施方案中，借助風(fēng)扇達到環(huán)境溫度。在一些實施方案中，該方法還包括在外表面上涂覆糖果釉層(confectionaryglazelayer)用作防潮層或用作調(diào)味引誘劑的步驟。在一些實施方案中，該方法還包括在外表面上涂覆蟲膠層用作防潮層的步驟。本發(fā)明在一些實施方案中提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括向受試個體口服施用本文公開的組合物。在一些實施方案中進一步提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括向受試個體口服施用組合物。該組合物包括層疊在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑，其中在有利于脫水生活的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑；和交聯(lián)劑。本發(fā)明在一些實施方案中提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括將組合物以適于飲用的懸浮液直接加入水源中。該組合物包括層疊在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑，其中在有利于脫水生活的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑；和交聯(lián)劑。在一些實施方案中，受試個體為人畜共患傳染病循環(huán)的儲存宿主。在一些實施方案中，受試個體為人畜共患傳染病的易感宿主。在一些實施方案中，受試個體為異體接種診斷攜帶者(xenodiagnosticcarrier)。在某些實施方案中，受試個體為節(jié)肢動物或昆蟲。在一些實施方案中，受試個體為哺乳動物。在一些實施方案中，哺乳動物為包括小鼠、花栗鼠、松鼠、鼩鼱、田鼠、大鼠、浣熊、負鼠、臭鼬、兔子和鹿中的一種或多種的野生動物。在一些實施方案中，受試個體為鳥。在一些實施方案中，受試個體為魚。在一些實施方案中，受試個體為馴養(yǎng)動物或伴生動物。在一些實施方案中，馴養(yǎng)動物包括狗、貓、牛和馬中的一種或多種。在研究了本文中的描述、附圖和非限制性實施例之后，本發(fā)明的優(yōu)點對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會變得顯而易見。附圖說明圖1為載有ospa的pet9c質(zhì)粒的限制性消化圖像。圖2為dna堿基對梯狀分子量標(biāo)準品(ladder)的圖像。圖3為對質(zhì)粒載有的ospa在正向方向進行測序分析所得的結(jié)果的圖像。圖4為對質(zhì)粒載有的ospa在反向方向進行測序分析所得的結(jié)果的圖像。圖5為對載有ospa(ospa-vectored)的大腸桿菌的ospa蛋白表達進行的蛋白質(zhì)印跡分析圖像。圖6為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物標(biāo)準品的圖像。圖7為顯示疫苗涂覆、交聯(lián)和分層(layering)過程的圖。圖8為顯示使用鼓涂覆(drum-coating)處理和配制的當(dāng)前操作實例的圖。圖9顯示作為儲存時間的函數(shù)的、通過疫苗產(chǎn)生的cfu計數(shù)測定的本文公開的疫苗實施方案的保質(zhì)期。圖10顯示響應(yīng)于疫苗施用的ospa抗體滴度負荷(load)，所述疫苗施用使用載有ospa的大腸桿菌。圖11顯示與確立疫苗效能的研究相對比的本文公開的實施方案的效能。數(shù)據(jù)確立了等同于疫苗效能的血清保護性ospa抗體滴度的閾值水平。序列表簡要說明seqidno:1為t7啟動子引物序列。seqidno:2為t7終止子引物序列。seqidno:3為ospa基因參照序列的核酸序列。具體實施方式本文件中闡述了本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)。在研究了本文件中提供的信息之后，對本文件中描述的實施方案的修改和其他實施方案對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文件中提供的信息，特別是所描述的示例性實施方案的具體細節(jié)，主要是為了清楚理解本發(fā)明而提供，不應(yīng)將其理解為是不必要的限制。為了防止出現(xiàn)沖突，以本文件中的包括定義在內(nèi)的詳細描述為準。提供的每個實施例都被當(dāng)作對本發(fā)明的解釋，而不是對本發(fā)明的限制。實際上，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以對本發(fā)明的教導(dǎo)做出各種修改和變化。例如，作為一個實施方案的一部分進行說明或描述的特征可與另一個實施方案一起使用，以再得到一個實施方案。雖然認為本文使用的術(shù)語對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是很好理解的，但是仍然在本文中給出了定義以便于解釋本發(fā)明。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管與本文所描述的方法、裝置和材料類似或等同的任何方法、裝置和材料均可用于本發(fā)明的實踐或測試，但現(xiàn)在仍然對代表性的方法、裝置和材料進行了描述。根據(jù)長期存在的專利法慣例，當(dāng)在本申請(包括權(quán)利要求)中使用時，術(shù)語“一種(a、an)”和“該(the)”指“一個或多個”。因此，例如，提及“一種細胞”時，其包括多個這樣的細胞，等等。本發(fā)明中所有提及的單數(shù)特征或限制應(yīng)包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)特征或限制，反之亦然，除非另有說明或提及之處的上下文清楚地暗示了相反的情形。本文使用的方法或工藝步驟的所有組合可以以任何順序進行，除非另有說明或做出所提及的組合之處的上下文清楚地暗示了相反的情形。本發(fā)明的方法和組合物(包括其組分)可包括或由下述組成或基本組成：本文所述的實施方案的基本要素和限制，以及本文所述的任何額外或任選的組分或限制或其他有用的要素或限制。除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的量、性質(zhì)(例如反應(yīng)條件)等的所有數(shù)字都應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。因此，除非有相反說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中所述的數(shù)值參數(shù)為近似值，該近似值可以根據(jù)本發(fā)明尋求獲得的期望性質(zhì)而變化。當(dāng)涉及質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分比的值或量時，如本文所用的術(shù)語“約”，在一些實施方案中意在涵蓋與指定的量相比±20％的變化，在一些實施方案中該變化為±10％，在一些實施方案中該變化為±5％，在一些實施方案中該變化為±1％，在一些實施方案中該變化為±0.5％，在一些實施方案中該變化為±0.1％，因為這樣的變化適于實施所述公開的方法。如本文所用，范圍可以表示為從“約”一個特定值和/或至“約”另一個特定值。還應(yīng)理解，本文公開了多個值，并且除了該值本身之外，每個值還在本文中被公開為“約”該特定值。例如，如果公開數(shù)值“10”，則還公開了“約10”。還應(yīng)當(dāng)理解，兩個特定單元之間的每個單元也被公開了。例如，如果公開了10和15，則也公開了11、12、13和14。本發(fā)明涉及一種組合物和使用該組合物向受試個體口服遞送生物活性劑的方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含基質(zhì)和通過在基質(zhì)上分層包封(layeredencapsulation)而被穩(wěn)定的有效量的至少一種生物活性劑的組合物，以及通過向受試個體施用該組合物來減少人畜共患傳染病的方法。本發(fā)明還涉及制備該組合物的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了一種組合物。所述組合物包含基質(zhì)、層疊在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑和交聯(lián)劑。在一些實施方案中，在有利于脫水生活的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定該至少一種生物活性劑。術(shù)語“生物活性劑”是指具有醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)方面的治療、預(yù)防或診斷效用的任何物質(zhì)。在一些實施方案中，生物活性劑包括治療劑。如本文所用，治療劑是指當(dāng)施用于患病個體時將治愈或至少在一定程度上緩解疾病或病癥的一種或多種癥狀的生物活性劑。在一些實施方案中，生物活性劑包括預(yù)防劑。如本文所用，預(yù)防劑是指一種生物活性劑，當(dāng)其施用于患病個體時預(yù)防疾病或病癥發(fā)生，或者如果其在治療劑之后施用，則預(yù)防或延遲疾病或病癥復(fù)發(fā)。在一些實施方案中，生物活性劑是指引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原，或可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，用以增強治療功效潛力。在一些實施方案中，生物活性抗原劑的施用可引發(fā)預(yù)防性免疫應(yīng)答以預(yù)防疾病感染和傳播或引發(fā)治療性免疫應(yīng)答以消除已存在的疾病感染。在某些實施方案中，組合物包含基質(zhì)和涂覆或?qū)盈B在基質(zhì)上的有效量的至少一種活性劑。如本文所用，術(shù)語“基質(zhì)”是指疫苗組合物可施用于其上的固體支撐組合物，例如載體。基質(zhì)的非限制性實例包括顆粒、可咀嚼物、珠粒例如微晶纖維素(mcc)。在一些實施方案中，基質(zhì)具有約100μm至約2cm的平均直徑。在一些實施方案中，組合物可以具有約100μm(mcc)至約2cm(顆粒形式)的尺寸范圍以適應(yīng)目標(biāo)動物物種的消耗。在一些實施方案中，穩(wěn)定劑包括但不限于水膠體聚合物或增塑糖。在一些實施方案中，增塑糖包括蔗糖、海藻糖的非限制性實例。在一些實施方案中，水膠體聚合物的非限制性實例為藻酸鈉。在一些實施方案中，交聯(lián)劑為鈣鹽。交聯(lián)劑的實例包括但不限于乳酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、乙酸鈣或抗壞血酸鈣。此外，在本發(fā)明的一些實施方案中，基質(zhì)的實例包括但不限于顆粒、可咀嚼物、珠粒和粉末。在一些實施方案中，珠粒包括微晶纖維素珠粒的非限制性實例。在一些實施方案中，基質(zhì)包括植物基物質(zhì)或土基物質(zhì)。在一些實施方案中，土基物質(zhì)包括但不限于土壤或水。在一些實施方案中，生物活性劑是被改造為表達一種或多種抗原的重組全細胞細菌。如本文所用，“全細胞細菌”是指在保持細菌細胞結(jié)構(gòu)完整性(即，全細胞結(jié)構(gòu)完整性和抗原性)的條件下維持的細菌細胞，其在某些實施方案中作為用于穩(wěn)定呈遞抗原的生物活性載體。有利于這種全細胞結(jié)構(gòu)完整性的條件將被定義為“穩(wěn)定的”。在某些實施方案中，全細胞將保持穩(wěn)定，不被分解成細胞碎片和/或其他生物材料和/或細胞器。在維持穩(wěn)定的全細胞結(jié)構(gòu)架構(gòu)中，一些實施方案可涵蓋被定義為活的全細胞細菌單位的“活性制劑”；其他實施方案可包括被定義為滅活的全細胞細菌單位的“無活性制劑”。在一些實施方案中，全細胞細菌包括大腸桿菌的脫水生活制劑(anhydrobioticpreparations)，而在其它實施方案中，全細胞細菌包括但不限于乳桿菌，包括嗜酸乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、加氏乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌。在一些實施方案中，全細胞細菌為被改造成表達一種或多種抗原的重組細菌。在一些實施方案中，重組細菌被改造成表達用作萊姆病疫苗的布氏疏螺旋體的至少一種外表面蛋白(參見第8,821,893號美國專利，其通過引用整體并入本文)。在一些實施方案中，重組細菌被凍干/冷凍干燥。在一些實施方案中，基質(zhì)還包括但不限于包括植物和/或飼料材料(包括草、草本豆科植物、豆科樹木，青貯飼料)或作物殘余物(包括諸如玉米的谷?；虼蠖菇斩?或其他土基物質(zhì)(例如土壤、堆肥)或直接添加到水中。在某些實施方案中，基質(zhì)是可食用的，并且適于與疫苗制劑形成組合物喂給動物。在一些實施方案中，基質(zhì)可以包括干燥的顆?；虼至＃缤ㄟ^壓縮原始材料產(chǎn)生的顆粒，該原始材料可在咀嚼時破碎為顆粒材料；和/或可咀嚼顆粒，其具有柔軟和柔韌的性質(zhì)使得其在咀嚼時不容易破碎或分解為顆粒物質(zhì)，但可容易地溶解；微晶纖維素珠?；蛴糜诜勰┲苿┬问降囊呙绲闹苽浜蛻?yīng)用的其它基質(zhì)，該粉末制劑經(jīng)鼻吸入給藥或直接加入水中通過飲用口服給藥；植物；食物來源，例如在野外可獲得的食物來源；和/或另一種泥土物質(zhì)、土壤或其它活性疫苗組合物可施用于其上然后進行干燥以達到穩(wěn)定的物質(zhì)，或水，活性疫苗組合物可施用于水以供飲用消耗。在一些實施方案中，活性疫苗劑的非限制性實例包括作為抗原劑的生物載體的全細胞細菌。在一些實施方案中，對活性劑進行滲透預(yù)處理用于脫水生活和穩(wěn)定化(stabilization)。如本文所用，術(shù)語“滲透預(yù)處理”是指在干燥至完全干燥前使用特定溶質(zhì)以在物理上穩(wěn)定和保護完整細菌中的膜和蛋白質(zhì)。非限制性滲透預(yù)處理劑包括增塑劑，例如糖(包括蔗糖和/或海藻糖)，或羥基四氫嘧啶。如本文所用，術(shù)語“脫水生活”是指對干燥的生物耐受性的物理狀態(tài)。生物干燥有助于在沒有水的條件下維持生物活性組合物，從而提高保存期穩(wěn)定性以延長疫苗效力。在一些實施方案中，在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定活性劑。非限制性穩(wěn)定劑包括水膠體的使用。如本文所用，術(shù)語“水膠體”是指分散在水溶液中的親水性聚合物膠體家族的任何物質(zhì)。在一些實施方案中，水膠體作為具有約1nm至約1000nm的直徑的小顆粒存在，并用于包封和穩(wěn)定生物材料。本發(fā)明的水膠體可以包括但不限于瓊脂、藻酸鹽、角叉菜膠、殼聚糖、明膠和/或樹膠。合適的水膠體還包括一種或多種天然和合成聚合物，其在含水體系中形成膠體溶液。合適的水膠體包括聚乙烯吡咯烷酮；淀粉；多糖，例如藻酸、藻酸鈉和藻酸鈣；纖維素和纖維素衍生物，例如乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥丙基纖維素(hpc)和羧甲基纖維素(cmc)；聚乙二醇(peg)；或其混合物。在一些實施方案中，某些水膠體聚合物(例如藻酸鈉)可以在鈣鹽的存在下交聯(lián)。在諸如鈣的二價陽離子的存在下的交聯(lián)是指將水膠體聚合物(藻酸鈉)的聚合鍵在結(jié)構(gòu)上連接至鈣以產(chǎn)生具有藻酸鈣交聯(lián)鍵的聚合物的能力；鈣離子替代了藻酸鹽聚合物中的鈉離子。交聯(lián)有利于穩(wěn)定活性疫苗劑的包封。在一些實施方案中，組合物還包括組合物的外表面上的包衣。在一些實施方案中，外表面上的包衣為蟲膠包衣。在一些實施方案中，所述包衣為腸溶包衣。在一些實施方案中，一旦交聯(lián)就順序地逐層施加基質(zhì)外表面上的包衣作為表面處理(top-dressing)，并且所述基質(zhì)外表面上的包衣包括腸溶包衣。在一些實施方案中，基質(zhì)的量為組合物的約85％w/w至約99％w/w。在一些實施方案中，穩(wěn)定劑的量為組合物的約1％w/w至約15％w/w。在一些實施方案中，生物活性劑的有效量為致免疫有效量，其最小免疫劑量(mid)為約5×103cfu至約5×107cfu。在一些實施方案中，交聯(lián)劑的量為組合物的約0.5％w/w至約7.5％w/w。此外，在一些實施方案中，包衣的量為組合物的約1.5％w/w至約22.5％w/w。此外，不管根據(jù)本發(fā)明方法使用的具體的給藥模式和時間如何，細菌(包括本文所述的基于細菌的組合物和抗原劑)通常以有效實現(xiàn)期望的反應(yīng)(即，實現(xiàn)針對抗原劑的保護)的量給予。因此，術(shù)語“有效量”在本文中用于指足以產(chǎn)生可測量的生物反應(yīng)(例如，針對伯氏疏螺旋體感染的免疫應(yīng)答)的治療組合物的量。從這個意義上說，在一些實施方案中，術(shù)語“治療有效”與短語“致免疫有效”在本文中可互換使用，用以指表達本發(fā)明公開的至少一種或多種抗原劑的全細胞細菌的量，其足以在宿主中誘導(dǎo)針對強致病性(virulent)細菌的有效免疫應(yīng)答。本發(fā)明的治療組合物中活性成分(例如細菌)的實際劑量水平可以變化，以便施用有效地在特定受試個體和/或應(yīng)用中實現(xiàn)期望的治療反應(yīng)的量的組合物。當(dāng)然，對這種組合物中的細菌和其它組分的劑量水平和量的選擇會取決于多種因素，包括細菌的活性、制劑、施用途徑、與其它藥物或治療的組合、所治療的病癥的嚴重程度，以及所治療的受試個體的身體狀況和先前的病史。優(yōu)選地，施用最小劑量，并且在不存在劑量限制性毒性的情況下將劑量遞增至最低有效量。治療有效劑量的確定和調(diào)整以及評估何時和如何進行這種調(diào)整是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。如本文所用，例如，在一些實施方案中，至少一種抗原劑的治療有效劑量為最小免疫劑量(mid)，以表達活性抗原的菌落形成細菌單位(cfu)計為約5×103cfu至約5x107cfu。在一些實施方案中，本申請中公開的組合物還包含佐劑。如本文所用，術(shù)語“佐劑”或“佐劑化的”是指能夠增強動物中疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。在一些實施方案中包含(embodying)全細胞細菌單位的組合物、分子工程抗原性融合蛋白或生物化學(xué)免疫調(diào)節(jié)劑作為天然佐劑。大腸桿菌細菌全細胞單位通過脂多糖(lps)的呈遞具有免疫原反應(yīng)性；lps為激活toll樣受體4(tlr4)的配體，其是對革蘭氏陰性細菌感染的免疫監(jiān)視和先天免疫系統(tǒng)的激活所必需的(flanaganetal.,j.endotoxinres.6:481,1996)。ospa氨基末端的22個氨基酸解釋了蛋白質(zhì)(ospa脂蛋白)的脂化部分，并且作為能夠誘導(dǎo)促炎細胞因子的天然免疫原性疏水信號肽(erdileetal.,infect.immun.61:81,1993)存在。在一些實施方案中，ospa脂蛋白可以在近端與其他抗原性蛋白框內(nèi)融合作為表達的分子佐劑融合蛋白構(gòu)建體。當(dāng)與大腸桿菌細菌全細胞單位混合時，使用霍亂毒素(ct)的制劑作為腸道粘膜免疫應(yīng)答的有效生物化學(xué)免疫調(diào)節(jié)劑(bowmanandclements,infect.immun.69:1528,2001)。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了用于口服遞送生物活性劑的組合物。所述組合物包含基質(zhì)、涂覆或?qū)盈B在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑以及促進抗原劑在基質(zhì)表面上穩(wěn)定劑中的包封的交聯(lián)劑。在一些實施方案中，在選自水膠體聚合物、增塑糖和海藻糖的穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑。在一些實施方案中，生物活性劑為抗原劑。此外，在一些實施方案中，提供了制備用于口服遞送生物活性劑的組合物的方法。該方法包括以下步驟：在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定至少一種抗原劑；將經(jīng)過穩(wěn)定的至少一種抗原劑涂覆到基質(zhì)上；施加交聯(lián)劑；進行交聯(lián)以促進抗原劑的凝膠化或包封；以及在環(huán)境溫度下以及強制通風(fēng)的條件下干燥。在一些實施方案中，溫度在約20℃至約35℃的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，借助風(fēng)扇達到環(huán)境溫度。在一些實施方案中，所述方法還包括在外表面上涂覆糖果釉層用作防潮層或調(diào)味引誘劑的步驟。在一些實施方案中，該方法還包括在外表面上涂覆蟲膠層用作防潮層的步驟。目前生成藻酸鈣包封的生物材料的方法需要生成水凝膠或藻酸鈣珠粒。通過將藻酸鈉加壓分配到一定體積的鈣鹽中生成包封生物材料的珠粒，該方法采用特定的包封設(shè)備(包封器，encapsulator)(mazzitellietal.,j.biomat.appl.23:123,2008)?？梢允占砂馄鳟a(chǎn)生的藻酸鈣珠粒并干燥用于下游應(yīng)用。珠粒形式本身并不有利于在限定的基質(zhì)上均勻施用以實現(xiàn)靶向分布或給藥，也不會使限定的基質(zhì)上均勻施用以實現(xiàn)靶向分布或給藥變得高效。id.用于口服施用的抗原的包封實例包括以下授權(quán)專利。例如，第5,352,448號美國專利描述了水凝膠的配制和產(chǎn)生，該水凝膠可以作為硬的透明珠粒負載用于口服施用的抗原。此外，第5,900,238號美國專利類似地描述了用于粘膜疫苗接種的包封抗原的水凝膠微珠的配制和產(chǎn)生。其他實例包括：wo2013/096883，其提供了在通過多價離子交聯(lián)的聚合物中產(chǎn)生噴霧干燥的微膠囊化生物部分和化學(xué)品的方法。本發(fā)明提供了制備用于口服遞送生物活性抗原劑的組合物的方法。例如，該方法包括以下步驟：通過滲透處理穩(wěn)定至少一種抗原劑，使用藻酸鈉懸浮液作為用于進行分層施用的液體載體將至少一種抗原劑涂覆到基質(zhì)上，通過再施加鈣鹽層進行交聯(lián)，從而通過藻酸鈣對抗原載體的包封促進分層凝膠化，以及在環(huán)境溫度下和強制通風(fēng)條件下風(fēng)干，得到生物活性抗原劑的分層脫水生活制劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括在抗原載體和/或基質(zhì)的外表面上涂覆釉層以提供防潮層和/或調(diào)味引誘劑的步驟。此外，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括在抗原載體和/或基質(zhì)的外表面上涂覆蟲膠層以提供防潮層的步驟。因此，采用更簡化的順序噴涂和包封的生物材料的分層施用提供了將經(jīng)穩(wěn)定的生物活性材料作為基質(zhì)上的分層包衣施用的有效且商業(yè)上可行的方法。在基質(zhì)上分層包封(encapsulatedlayering)提供了用于使生物活性劑靶向分布的載體方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于粘膜施用的抗原的穩(wěn)定表達的組合物和方法，更具體地，涉及向諸如哺乳動物的受試個體口服施用。在本發(fā)明的一些實施方案中，活性疫苗劑首先在約500mm至約625mm蔗糖和/或約500mm至約625mm羥基四氫嘧啶中進行滲透預(yù)處理。然后將預(yù)處理的活性劑與含有約500mm至約625mm蔗糖的約1.0％至約1.5％藻酸鈉懸浮液基質(zhì)混合，然后通過噴涂將其施加到基質(zhì)的表面上。通過噴涂將濃度約200mm至約225mm的第二層鈣鹽施加到基質(zhì)的表面上。在一些實施方案中，在施加第一層之后約1秒至約60秒，將第二層施加到基質(zhì)的表面。如本發(fā)明中所用，鈣鹽為乳酸鈣。在一些實施方案中，鈣鹽可以為氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、乙酸鈣或抗壞血酸鈣。如本文中所用，術(shù)語“蟲膠”在一些實施方案中是指外部施用于涂覆有疫苗的基質(zhì)的外部可食用釉、樹脂和/或包衣。在一些實施方案中，蟲膠包衣包含防潮層，例如在口服施用的疫苗的部署中，防潮層用于增強疫苗的保質(zhì)期和穩(wěn)定性。本發(fā)明在一些實施方案中提供了通過對有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括向受試個體口服施用本文公開的組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種口服施用利用抗原表達系統(tǒng)的基于生物制品的疫苗的方法，所述疫苗包含具有載體的細菌(vectoredbacteria)，消耗其時在目標(biāo)哺乳動物群體中引發(fā)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及穩(wěn)定疫苗的活性生物制劑/組分的方法，使得抗原活性可以得以保持，并用劑量來衡量；該劑量保持對于免疫活性galt(腸相關(guān)淋巴組織)或nalt(鼻咽相關(guān)淋巴組織)的吸收的抗原性；并且免疫應(yīng)答產(chǎn)生對疫苗的反應(yīng)，該反應(yīng)在通過抗體滴度測定的血清反應(yīng)性水平上是持續(xù)的、可測量的且是預(yù)防性或治療性的?？贵w滴度可作為預(yù)防活性化合物傳遞以壓制目標(biāo)人畜共患病的感染的發(fā)生。關(guān)于本發(fā)明的使用方法，動物粘膜表面是許多感染原的主要進入部位。因此，粘膜免疫提供了抵抗感染原的初始防線。粘膜免疫應(yīng)答通過阻礙病原體附著于粘膜上皮、中和病毒劑和細菌劑并提供通過吞噬作用去除病原體的手段而干擾感染過程。粘膜相關(guān)的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以防止微生物穿透并感染動物的內(nèi)部區(qū)域。由于廣泛存在與粘膜免疫系統(tǒng)相關(guān)的免疫學(xué)性質(zhì)，疫苗施用也有效靶向該區(qū)域以引發(fā)針對幾種病原體的預(yù)防性免疫應(yīng)答(chenandcerutti,immunity33:479,2010；fujkuyamaetal.,expertrevvaccines11:367,2012；neutraandkozlowski,naturerev.immunol.6:148,2006；ograetal.,clin.microbiol.rev.14:430,2001；woodrowetal.,annu.rev.biomed.eng.14:17,2012)。將抗原直接施加到粘膜表面會最有效地誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。然而，天然構(gòu)象的抗原的位點特異性呈遞在可用的施用載體和與抗原相關(guān)的毒性方面提出了挑戰(zhàn)。因此，可以通過刺激粘膜相關(guān)淋巴組織(malt，一種免疫活性粘膜組織的綜合網(wǎng)絡(luò))來誘導(dǎo)局部免疫。在腸或肺的粘膜表面處的抗原暴露觸發(fā)淋巴細胞向產(chǎn)生抗原反應(yīng)性抗體的所有粘膜區(qū)域的復(fù)雜遷移?？乖┞哆M一步誘導(dǎo)記憶淋巴細胞群，這有助于響應(yīng)隨后同一抗原的暴露而產(chǎn)生抗體。因此，malt通過觸發(fā)局部免疫應(yīng)答而作為有效疫苗接種的靶點(chenandcerutti,immunity33:479,2010；fujkuyamaetal.,expertrevvaccines11:367,2012；neutraandkozlowski,naturerev.immunol.6:148,2006；ograetal.,clin.microbiol.rev.14:430,2001；woodrowetal.,annu.rev.biomed.eng.14:17,2012)。在免疫活性粘膜表面中，腸中的腸相關(guān)淋巴組織(galt)的malt為淋巴組織的最大堆積物。galt含有功能性t淋巴細胞群和功能性b淋巴細胞群以及抗原呈遞輔佐細胞。具體地，galt的b淋巴細胞群包含致力于產(chǎn)生免疫球蛋白a(iga)類抗體的重要細胞亞群。作為中和抗體，galt局部獲得iga的能力提供了防止入侵襲病原體附著和穿透粘膜表面的上皮層的有效手段。這種形式的免疫應(yīng)答不同于全身性淋巴組織的免疫應(yīng)答，在全身性淋巴組織中通過常規(guī)的肌內(nèi)(im)或皮下(subq)免疫施用方法不能有效誘導(dǎo)iga類抗體(chenandcerutti,immunity33:479,2010；fujkuyamaetal.,expertrevvaccines11:367,2012；neutraandkozlowski,naturerev.immunol.6:148,2006；ograetal.,clin.microbiol.rev.14:430,2001；woodrowetal.,annu.rev.biomed.eng.14:17,2012)。galt的上皮細胞層將粘膜下面的淋巴層與腸的內(nèi)腔分開。散布在上皮層內(nèi)的是具有抗原呈遞功能的輔佐細胞。這樣的輔佐細胞主動地對腔內(nèi)抗原樣品進行取樣并將樣品內(nèi)化用于處理和呈遞到相鄰淋巴細胞。將抗原呈遞和暴露于galt啟動抗原特異性b淋巴細胞和t淋巴細胞的克隆擴增。因此，致力于產(chǎn)生iga的b淋巴母細胞遷移通過roesenteric淋巴結(jié)以在包括腸道、鼻咽和呼吸道、肺、口腔、眼部區(qū)域、乳腺和泌尿生殖道的所有粘膜部位中引發(fā)增強的特異性免疫應(yīng)答。因此，通過口服疫苗接種對galt進行免疫刺激可在各種粘膜表面預(yù)防傳染病(chenandcerutti,immunity33:479,2010；fujkuyamaetal.,expertrevvaccines11:367,2012；neutraandkozlowski,naturerev.immunol.6:148,2006；ograetal.,clin.microbiol.rev.14:430,2001；woodrowetal.,annu.rev.biomed.eng.14:17,2012)。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過口服給藥使用涂覆在可食用的遞送基質(zhì)上的、水膠體穩(wěn)定/包封的全細胞載體為動物接種疫苗。成功且有效的口服疫苗需要在其通過消化道時抗原具有穩(wěn)定性。作為依賴于構(gòu)象結(jié)構(gòu)的功能蛋白，抗原的構(gòu)象可以在消化道的消化過程下變性。已經(jīng)開發(fā)了腸道藥物遞送系統(tǒng)以保護藥物活性化合物通向腸。此外，水膠體可用于全細胞包封和/或維持細胞酶反應(yīng)潛能。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用水膠體作為穩(wěn)定全細胞抗原以有效呈遞至malt的腸溶包衣。諸如藻酸鹽的水膠體提供親水性凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定基質(zhì)，其保護包封的生物制劑有效通向目標(biāo)粘膜組織，例如galt。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種有效刺激針對所呈遞的抗原的粘膜免疫應(yīng)答的方法。具體地，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及水膠體穩(wěn)定的生物載體(例如全細胞細菌)作為用于表達天然構(gòu)象的抗原的載體的用途。本發(fā)明還涉及將經(jīng)穩(wěn)定的生物載體與基質(zhì)組合物復(fù)合(complexing)的方法，所述基質(zhì)組合物有助于通過口服和/或鼻腔給藥將抗原遞送至粘膜相關(guān)淋巴組織。在一些實施方案中，還提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括向受試個體口服施用組合物。該組合物包括層疊在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑，以及交聯(lián)劑，其中在有利于脫水生活的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑。本發(fā)明在一些實施方案中提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括將組合物以適于飲用的懸浮液直接加入至水源中。該組合物包括層疊在基質(zhì)上的有效量的至少一種生物活性劑，以及交聯(lián)劑，其中在有利于脫水生活的條件下在穩(wěn)定劑中穩(wěn)定所述至少一種生物活性劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于減少媒介傳播的人畜共患傳染病和/或其它人畜共患傳染病的口服疫苗組合物。如本文所用，術(shù)語“人畜共患的”或“人畜共患傳染病”是指可以在物種之間傳播的傳染性疾病。在一些實施方案中，疾病傳播媒介可促進傳染病傳播，疾病傳播媒介包括但不限于昆蟲(蚊子或其它)和/或節(jié)肢動物(蜱或其它)。在一些實施方案中，人畜共患疾病是由媒介傳播的。如本文所用，“媒介”是指可在人類之間或由動物向人類傳播傳染性疾病的活生物體。這些媒介中的許多是吸血昆蟲，其在從受感染的宿主(人或動物)吸食血液期間攝入致病的微生物，并且在隨后的血液吸食期間將導(dǎo)致病的微生物注射到新的宿主中。在一些實施方案中，媒介傳播的人畜共患疾病為萊姆病?！懊浇閭鞑ゼ膊　笔侵溉巳褐杏刹≡w和寄生蟲引起的疾病。媒介傳播的人畜共患傳染病和其他類型的人畜共患傳染病包括但不限于無形體病(anaplasmosis)、巴貝蟲病(babesiosis)、艾里希體病(ehrlichiosis)、洛基山斑疹熱(rockymountainspottedfever)、登革熱(dengue)或瘧疾(malaria)。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了通過給有需要的受試個體接種疫苗來控制人畜共患傳染病的方法。該方法包括向受試個體口服施用包含基質(zhì)和涂覆或?qū)盈B在基質(zhì)上的有效量的至少一種活性劑的組合物。在一些實施方案中，受試個體為人畜共患傳染病循環(huán)的儲存宿主。在一些實施方案中，受試個體為人畜共患傳染病循環(huán)的易感宿主。在一些實施方案中，受試個體為一種異體接種診斷攜帶者。受試個體的非限制性實例包括節(jié)肢動物、昆蟲、哺乳動物、鳥、魚和/或馴養(yǎng)動物或伴生動物。在一些實施方案中，哺乳動物包括野生動物，包括小鼠、花栗鼠、松鼠、鼩鼱、田鼠、大鼠、浣熊、負鼠、臭鼬、兔子和鹿中的一種或多種。在一些實施方案中，受試個體為馴養(yǎng)動物或伴生動物。在一些實施方案中，馴養(yǎng)動物包括狗、貓、牛和馬中的一種或多種。在一些實施方案中，受試個體為鳥。在一些實施方案中，受試個體為魚。如本文所使用的，術(shù)語“儲存宿主”是指攜帶傳染性疾病微生物或病原體但無癥狀表現(xiàn)的生物體。具體地，如本文所提及的，儲存宿主通過攜帶可傳播到其他儲存宿主或隨后的易感宿主的傳染原而在人畜共患傳染病的傳播循環(huán)中起作用。在一些實施方案中，儲存宿主可將一定量的感染原傳播至例如飼養(yǎng)媒介，感染原可以傳播至隨后的儲存宿主和/或隨后的易感宿主。如本文所用，術(shù)語“易感宿主”是指傾向于患病的、易受疾病攻擊和/或易于接受疾病的個體生物體。具體地，如本文所提及的，易感宿主可接受由攜帶疾病的媒介載體傳播的疾病。具體地，如本文所提及的，術(shù)語“異體接種診斷載體”可用于描述通過將可能的感染性組織暴露于未受感染的(naive)媒介，然后測定媒介是否存在(攝取)相同的感染原來證明是否存在具有傳染病的微生物或病原體的診斷方法。本發(fā)明通過本文提供的具體但非限制性的實施例進行進一步說明。此外，以下示例可以包括數(shù)據(jù)的匯編，該數(shù)據(jù)匯編代表在與本發(fā)明相關(guān)的開發(fā)和實驗過程中在各個時間收集的數(shù)據(jù)。提供本文公開的方法和結(jié)果以報告疫苗效能的分析結(jié)果。有效的疫苗被定義為基于指定的施用方案誘導(dǎo)持續(xù)的免疫應(yīng)答的疫苗。免疫反應(yīng)性取決于抗原向免疫系統(tǒng)的呈遞。對于本公開，抗原呈遞考慮了生物系統(tǒng)(維持的細菌全細胞載體)的效用，通過其施用后所述抗原在細胞表面上穩(wěn)定表達以有效呈遞給免疫系統(tǒng)。細菌載體系統(tǒng)進一步作為天然佐劑，用于增強疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。使用以下測試措施來測定疫苗的有效性；下面的實施方案包括用于萊姆病的靶向候選儲主的疫苗。測試涉及細菌菌株身份和純度測定、基于限制性消化和測序的質(zhì)粒序列測定以及蛋白質(zhì)表達測定，以上測定是按照符合9cfr113.27(b)的針對修飾的活生物產(chǎn)品的無菌性測試的標(biāo)準操作步驟進行的。疫苗效能驗證和測試按照符合vsm800.202的操作步驟進行。實施例1疫苗生物純度和身份本研究涉及用于確認大腸桿菌抗原載體細菌培養(yǎng)物的身份和純度的方法。在本研究中，為了測定疫苗的效價和效能所需的活培養(yǎng)物/活性培養(yǎng)物，向每瓶含有40ml流體巰基乙酸鹽的10個瓶中分別接種來自od600＝1.2培養(yǎng)物樣品瓶的0.2ml培養(yǎng)物樣品。將瓶在30-35℃溫育14天。此外，向每瓶含有40ml胰蛋白胨大豆肉湯的10個瓶中分別接種來自樣品瓶的0.2ml樣品。將瓶在20-25℃溫育14天。在14天的溫育期結(jié)束時，所有20個瓶子均顯示生長。在宏觀檢查時，在所有瓶中均未觀察到外來物生長(extraneousgrowth)。從每個瓶中取出0.2ml樣品涂布在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上，并在37±2℃下溫育24小時。在溫育24小時后，每個樣品瓶的菌落形態(tài)是均一的并與大腸桿菌的一致。顯微鏡檢查顯示了與大腸桿菌一致的均一的革蘭氏陰性桿狀菌(rod)。使用96孔biologmicrostation系統(tǒng)，按照微生物鑒定程序，證實微生物的身份為大腸桿菌。biologmicrostation系統(tǒng)鑒定該生物體為大腸桿菌，似然度為80.4％。實施例2疫苗抗原表達穩(wěn)定性以下研究進一步涉及確認質(zhì)粒穩(wěn)定性并從培養(yǎng)物中分離的方法，其中借助實施例1中概述的方法，該培養(yǎng)物被鑒定為大腸桿菌。對于2個不同的樣品瓶a和b，使用1％細菌蛋白胨制備10倍稀釋系列。將0.1ml10-7稀釋液轉(zhuǎn)移到含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上，并在37±2℃溫育24小時。對于a和b樣品板，使用分離的菌落接種含有10.0ml具有100μg/ml卡那霉素的lb肉湯的三個培養(yǎng)管，并在37±2℃以及連續(xù)、低水平攪動下溫育16小時。然后將管以8000rpm(×4300g)離心3分鐘以使細胞沉淀(pellet)。使用qiagenspinminiprep試劑盒從細胞培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒dna。使用nanovue分光光度計定量質(zhì)粒dna產(chǎn)率。選擇具有最高質(zhì)粒產(chǎn)率的樣品，即質(zhì)粒產(chǎn)率分別為53.5μg/ml和83.0μg/m的a1和b1，用于另外的分析。然后將分離的質(zhì)粒用于測序和限制性消化分析以驗證ospa基因成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。分離的質(zhì)粒的限制性消化。使用表1所示的bamhi和ndei消化分離的ospa質(zhì)粒樣品a1和b1(這些樣品在37±2℃溫育1小時)。表1限制性消化稀釋方案ospa質(zhì)粒樣品(a1或b1)10μlne緩沖液3.15μlbamhi1μlndei1μl去離子水33μl按照表2所示稀釋未消化的分離的ospa質(zhì)粒樣品a1和b1。表2未消化的ospa稀釋方案ospa質(zhì)粒樣品(a1或b1)10μl去離子水40μl用9μl去離子水稀釋一(1.0)μl的1kb的梯狀分子量標(biāo)準品(ladder)。用5μl去離子水稀釋五(5.0)μl超螺旋dna梯狀分子量標(biāo)準品。將每個樣品取十(10.0)μl加入到2μl的6x上樣染料中。將每種樣品取十二(12)μl上樣到1％瓊脂糖凝膠+4μl溴化乙錠上，如表3所示。表3sdspage泳道說明(key)泳道樣品11kb梯狀分子量標(biāo)準品2sc梯狀分子量標(biāo)準品3未消化的a14經(jīng)消化的a15未消化的b16經(jīng)消化的b1將凝膠用0.5xtbe+24μl溴化乙錠在100v下運行90分鐘。在透射照明器上用uv光分析凝膠。接受標(biāo)準要求(1)ospa條帶必須在1.0kb處與1kb梯狀分子量標(biāo)準品的條帶對齊。質(zhì)粒主鏈必須與略高于4kb條帶的分子量梯狀標(biāo)準品對齊；(2)未消化的樣品的條帶必須略高于梯狀分子量標(biāo)準品的5kb條帶；和(3)存在條帶且尺寸合適(參見表4以及圖1和圖2)。結(jié)果令人滿意。表4消化后dna片段的估算長度估算片段尺寸ospa1079bp質(zhì)粒主鏈4301bp未切割質(zhì)粒5380bp對質(zhì)粒的t7區(qū)進行測序。用于表達質(zhì)粒構(gòu)建體的t7區(qū)域測序的引物包括(1)以下序列的t7啟動子引物：taatacgactcactataggg(seqidno：1)和(2)以下序列的t7終止子引物：gctagttattgctcagcgg(seqidno：2)。分離的質(zhì)粒和t7引物被送到艾奧瓦州進行正向和反向的sanger法測序。使用在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/處在線找到的blast軟件，將從艾奧瓦州獲得的實驗序列(sbjct)與在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1194357處找到的已知的ospa基因參考序列(query)(seqidno：3)進行核苷酸blast比對。結(jié)果表明，正向序列和反向序列分別具有100％(圖3)和99％(圖4)的同一性得分。實施例3測定疫苗蛋白抗原表達的方法通過用于測定表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物ospa的蛋白質(zhì)印跡分析驗證質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達。在擴增有ospa載體的大腸桿菌培養(yǎng)物之后，提取蛋白用于蛋白質(zhì)印跡分析。將大腸桿菌樣品接種到含有100μg/ml卡那霉素的10mllb+肉湯中，并在37±2℃以及連續(xù)、低水平攪動下溫育過夜。將樣品以8000rpm(×4300g)離心3分鐘以使細胞沉淀。然后棄去上清液。將沉淀再次懸浮于1ml冰冷的pbs緩沖液中。將樣品在8000rpm離心3分鐘以使細胞沉淀。然后棄去上清液。將沉淀再次懸浮于于1ml冰冷的pbs緩沖液中，并轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml微量離心管中。將樣品以8000rpm(×4300g)離心3分鐘以使細胞沉淀。然后棄去上清液。將沉淀再次懸浮于1ml冰冷的20mmtris-hcl溶液中，并在冰上靜置30分鐘作為細胞溶解步驟。將所得細胞溶解產(chǎn)物以10,000rpm(×6720g)離心10分鐘。將含有可溶性蛋白質(zhì)部分的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中。將含有不溶性蛋白質(zhì)部分的細胞沉淀再次懸浮于1ml冰冷的20mmtris-hcl溶液中。將可溶性蛋白質(zhì)部分和不溶性蛋白質(zhì)部分用于蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡：提取蛋白質(zhì)后，如表5所示制備樣品。表5蛋白質(zhì)還原劑+緩沖液反應(yīng)ospa樣品a1、b1或pc6.5μl樣品緩沖液2.5μldtt1.0μl將樣品在加熱塊上于70℃加熱10分鐘。將每種樣品取十(10)μl上樣到如表6所示的4-12％bis-tris凝膠上。表6蛋白質(zhì)印記泳道說明泳道樣品1mwm2pc3樣品a14樣品b1將凝膠在biorad凝膠系統(tǒng)上在1xnovexmessds運行緩沖液+1ml抗氧化劑中在220v下運行30分鐘。將pvdf轉(zhuǎn)移膜、濾紙和墊浸在1xnupage轉(zhuǎn)移緩沖液(75ml20xnupage轉(zhuǎn)移緩沖液+1.5ml抗氧化劑+150ml甲醇+1273.5ml去離子水)中。用轉(zhuǎn)移膜制備凝膠并在30v下運行約1小時。在室溫下用甲醇活化ospa蛋白轉(zhuǎn)移的pvdf膜2分鐘。將膜分配到容器中的1xtbst(100mltbs+900ml去離子水+500μl吐溫20)+3％脫脂乳中并搖晃該膜1小時。棄去溶液，然后加入少量la2.2.1雜交瘤ospa單克隆抗體(100μlospa單克隆抗體+9.9ml1xtbst)+1％脫脂乳，將膜在室溫下?lián)u晃1小時。然后將膜用1xtbst洗滌三次。在每次洗滌時將膜搖晃5分鐘。加入1xtbst+1％脫脂乳中的二抗(山羊抗小鼠iggap)(稀釋度1:1000)，并在室溫與膜一起搖晃30分鐘。將膜再次用1xtbst洗滌三次。在每次洗滌時將膜搖晃5分鐘。然后加入五(5.0)mlbcip/nbt膜磷酸酶底物。使該溶液顯影該膜，并通過加入水停止反應(yīng)。將膜在室溫下干燥。接受標(biāo)準要求條帶必須在mwm上的紫色30398道爾頓條帶處存在。結(jié)果表明，每個樣品都在30398道爾頓處存在條帶(參見圖5和6)。結(jié)果令人滿意。ospa蛋白抗原的穩(wěn)定質(zhì)粒表達為陽性的大腸桿菌符合用作疫苗抗原的生物全細胞載體所必需的標(biāo)準，并且可以涂覆在合適的基質(zhì)上以施用于目標(biāo)動物。實施例4合適的疫苗載體基質(zhì)材料的組成在一些實施方案中，本發(fā)明的基質(zhì)為顆粒型、擠出的和/或無營養(yǎng)價值或具有低營養(yǎng)價值。此外，所述基質(zhì)可以包括磨碎的玉米、麥麩、甘蔗糖蜜、碳酸鈣、動物脂肪(例如用丁基羥基茴香醚(bha)保存的豬脂肪)、去殼大豆粉、磨碎的燕麥、鹽、脫水苜蓿粉、全麥、磨碎的大豆皮、魚粉、干甜菜漿、磷酸二鈣、小麥胚芽、玉米面筋粉和大豆油。在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包括擠出的顆粒；在一些實施方案中，擠出的顆粒具有高的顆粒耐久性指數(shù)(pdi>90)，并且可以是例如球形或圓柱形。所述顆?；|(zhì)的高耐久性和球狀形狀使顆粒在用高效的商業(yè)轉(zhuǎn)鼓涂覆方法涂覆疫苗時保持其完整性和形狀。實施例5疫苗穩(wěn)定化和包衣基質(zhì)的組成在一些實施方案中，為了使疫苗適應(yīng)本發(fā)明中所用的涂覆工藝，全細胞細菌生物質(zhì)首先在標(biāo)準發(fā)酵方法下擴大至落入固定相的細胞密度。支持全細胞細菌生物質(zhì)生長的培養(yǎng)條件遵循studier(2005)提出的條件，用于具有pet9c質(zhì)粒表達載體的培養(yǎng)物生長。簡言之，在kan+選擇固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)有ospa載體的bl21(de3)大腸桿菌的單菌落分離物。將分離物在3ml的tby+kan液體選擇培養(yǎng)基中單獨生長過夜。然后將液體培養(yǎng)物以1:1000的比例傳代到tby+kan誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)t7啟動子驅(qū)動的ospa基因表達。在一些實施方案中，本發(fā)明的生物質(zhì)經(jīng)歷中空纖維過濾以減少液體介質(zhì)從而產(chǎn)生濕細胞糊狀物(wet-cellpaste，wcp)。液體介質(zhì)的減少包括使用pbs緩沖液將wcp洗滌成懸浮液。為了維持全細胞抗原載體作為指示最小免疫劑量(mid)的度量標(biāo)準，將生物質(zhì)穩(wěn)定化。如本文所用，pbs是指不含鈣和/或鎂的二價陽離子的磷酸鹽緩沖鹽水。如本文所用，用于本發(fā)明的方法的穩(wěn)定化基質(zhì)是指完全溶解在pbs中的最終濃度為500mm至625mm的蔗糖的溶液。穩(wěn)定化基質(zhì)用作(1)用于生物組合物的冷凍保存的冷凍穩(wěn)定基質(zhì)，和/或用作(2)基質(zhì)溶液，以在下游包封處理和脫水生活的干燥條件下滲透穩(wěn)定(osmoticallystabilize)全細胞細菌細胞。在一些實施方案中，使用最終濃度為100mm的海藻糖作為穩(wěn)定化基質(zhì)中使用的糖。在一些實施方案中，通過在4℃下將1:1的生物質(zhì)-pbs懸浮液與1mm-1.25mm的穩(wěn)定化基質(zhì)的濃溶液緩慢混合來確保穩(wěn)定化過程，產(chǎn)生最終濃度為500mm-625mm的蔗糖的pbs溶液。該實施方案產(chǎn)生經(jīng)過滲透穩(wěn)定(osmoticallystabilized)的液體疫苗組分。液體疫苗組分可以立即用作施用于合適的基質(zhì)材料的組合物，或者在可以進行涂覆之前冷凍至-80℃。在一些實施方案中，藻酸鈉用作在脫水生活的條件下穩(wěn)定活細胞的包封平臺。在某些實施方案中，按照諸如“standardguideforimmobilizationorencapsulationoflivingcellsortissueinalginategels(用于藻酸鹽凝膠中活細胞或組織的固定化或包封的標(biāo)準指南)”(astm，designationf2315-10,2010，由fmcbiopolymer提供的參考文獻)的參考文獻中描述的方法和根據(jù)smidsrod和skjak-braek概述的方法(trends.biotechnol.,8:71,1990)制備藻酸鈉混合物。給出了表示交聯(lián)反應(yīng)的線性化學(xué)方程的實例：2藻酸鈉+cacl2→藻酸鈣+2nacl。在一些實施方案中，水膠體聚合物作為腸溶聚合物。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物的一些或所有組分的聚合物穩(wěn)定化可以保護組分免受胃的消化ph的破壞，從而保存組分用于在腸中靶向釋放。例如，在某些實施方案中，口服施用的生物疫苗組合物包含一種或多種聚合物穩(wěn)定化(polymericallystabilized)的成分/組分。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含與鈣交聯(lián)的藻酸鈉。在一些實施方案中，在500mm-625mm蔗糖的蒸餾水/去離子水溶液中制備藻酸鈉水性懸浮液，例如1％至4％的懸浮液。將懸浮液在室溫下攪拌混合約6小時或直到完全溶解，得到藻酸鈉-蔗糖糖漿的懸浮液。然后將該滲透穩(wěn)定的液體疫苗組分在室溫下與藻酸鹽溶液輕輕混合。然后將液體疫苗-藻酸鈉混合物施用到球狀動物食品顆粒上。隨后用100mm-225mm乳酸鈣的噴霧混合物(高達7％的溶液，作為具有增強的味道的交聯(lián)多價離子的來源；也可以使用5％至7％的氯化鈣溶液)作為交聯(lián)劑涂覆半干燥疫苗-藻酸鈉包衣，以促進在顆?；|(zhì)上產(chǎn)生藻酸鈣微膠囊化的細菌細胞層，如圖7中的示意圖所示。藻酸鈣交聯(lián)/包封保持了基于細菌的疫苗抗原的生存力和免疫原性完整性。實施例6將經(jīng)穩(wěn)定的疫苗作為表面處理噴涂于基質(zhì)組合物上的方法噴霧干燥是用于生物材料的穩(wěn)定干燥和保質(zhì)期延長的通常做法。現(xiàn)有技術(shù)包括將生物材料噴霧干燥技術(shù)應(yīng)用于下游收集和利用。通過包封過程增強了生物穩(wěn)定性，因此所述生物材料與水膠體聚合物組合，然后與交聯(lián)化合物混合。然后收集噴霧干燥的包封的生物材料以進行使用。本發(fā)明介紹了將生物材料與水膠體或其他包封組合物的組合物噴涂到基質(zhì)材料上的應(yīng)用?；|(zhì)材料用作固體支撐載體，在該固體支撐載體上噴涂生物材料，隨后將(1)交聯(lián)劑噴涂于其上以促進包封，以及將(2)防潮釉或蟲膠、調(diào)味劑或香味誘餌引誘劑噴涂于其上。然后可以對經(jīng)涂覆的顆粒進行溫和的干燥過程，從而可以干燥涂覆的材料。在轉(zhuǎn)鼓涂覆過程中，球狀的基質(zhì)材料或“干凈的”顆?；|(zhì)有利于“流體”翻滾過程。將顆?；|(zhì)以給定的速率進料到涂覆轉(zhuǎn)鼓中以在被噴涂時有效地產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?。將顆粒在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)輕輕地、均勻地滾動/翻滾，同時用蔗糖穩(wěn)定的細菌/藻酸鹽包封的細菌進行噴涂。嚴格控制噴涂(可以靜電輸送)并自動與翻滾持續(xù)時間相關(guān)聯(lián)以確保均勻的包衣覆蓋和適當(dāng)?shù)膭┝?，該劑量等于以每個顆粒的菌落形成單位(cfu)測量的指定的mid。二次噴涂促進與鈣進行的交聯(lián)反應(yīng)。糖果釉和/或藥用蟲膠與引誘劑/調(diào)味添加劑組合而成的最終外部密封劑的任選的第三包衣有利于自由流動顆粒的處理、儲存和分配；調(diào)味添加劑為萊姆病的目標(biāo)動物儲存宿主提供可口的引誘劑。在翻滾時進行干燥，或通過將產(chǎn)品鋪展在高表面積干燥臺上進行干燥。該方法在連續(xù)批量操作下具有高產(chǎn)量。在一些實施方案中，考慮使用離心分批涂布工藝將生物材料與水膠體或其它包封組合物的組合物以及隨后的交聯(lián)劑作為涂覆基質(zhì)施用于顆粒表面上。如圖8所示并且如在本發(fā)明中使用，將離心涂覆設(shè)備用于高效涂覆基質(zhì)顆粒(本文中為顆粒)材料的高產(chǎn)量商業(yè)操作。裝入大量顆粒(101)(配料斗，106)以進入涂覆轉(zhuǎn)鼓(107)，在標(biāo)準機動系統(tǒng)(108)驅(qū)動下，在涂覆轉(zhuǎn)鼓內(nèi)于恒定轉(zhuǎn)速下拌入并攪拌顆粒。將生物材料與藻酸鈉水膠體穩(wěn)定化基質(zhì)(試劑a，102)(或其它包封組合物)的組合物通過機載電動機驅(qū)動的混合器(110-111)保持在容器(109)中并保持在懸浮液中。類似地，乳酸鈣交聯(lián)劑(試劑b，103)和防潮劑也放在容器(113)中。通過蠕動泵送過程(112,114)連續(xù)地添加兩種試劑(115)并通過霧化過程(104)涂覆到拌入的顆粒上，通過分配至相對于拌入基質(zhì)的旋轉(zhuǎn)位于中心的、單獨的、機動(117)旋轉(zhuǎn)離心盤(116)促進所述霧化過程，由此以指定的mid均勻地涂覆顆粒(105)。實施例7證明疫苗穩(wěn)定性的方法本文提出的實施方案的有效保質(zhì)期必須與配送計劃和活動相適應(yīng)。穩(wěn)定化疫苗涂覆的顆粒是用于口服的不溶于水的制品，其在腸內(nèi)穩(wěn)定以將疫苗有效地施用于galt。對干燥的、疫苗涂覆的顆粒進行穩(wěn)定性/保質(zhì)期分析。簡言之，將每個單獨的疫苗顆粒測試制品在4ml體積的ph7.4的55mm檸檬酸鈉hepes緩沖鹽水溶液中再水合。將其在攪拌下于35℃溫育1小時。將含有釋放的/解封的活的有ospa載體的全細胞大腸桿菌的100μl顆粒上清液涂覆在tb+kan瓊脂平板上并培養(yǎng)過夜以評估菌落生長。將得到的菌落換算為近似的cfu/ml，其代表再水合時每個疫苗涂覆的顆粒釋放的菌落；將所得cfu計數(shù)作為疫苗穩(wěn)定性和隨時間衰減(保存期限)的替代標(biāo)志物進行評價。在疫苗涂覆的顆粒生產(chǎn)之后每周執(zhí)行這個步驟，時間長達10周。如圖9所示的結(jié)果表明在8周的測定期內(nèi)活性疫苗組分(大腸桿菌抗原載體)保持穩(wěn)定和且是存活的，衰減系數(shù)為2。實施例8證明疫苗效能的方法疫苗效能是基于施用抗原后在動物中誘導(dǎo)血清反應(yīng)性的能力確定的。使用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)測定的針對抗原或免疫原產(chǎn)生的抗體滴度是疫苗效能的替代標(biāo)志物。如本文所用，間接elisa方法的使用適合于檢測針對ospa的血清抗體。實施測定，其中將純化的ospa靶蛋白/捕獲抗原蛋白包被在固體支撐物上。然后使ospa特異性單克隆抗體(陽性對照，mabla2.2)或ospa血清抗體(測試物)形式的一抗結(jié)合靶抗原。然后加入對一抗具有特異性的二抗綴合物，對該反應(yīng)進行顯色以指示血清ospa特異性應(yīng)答抗體的相對水平。該過程使用平底孔。然后將純化的蛋白質(zhì)在包被緩沖液(一個96孔板使用10ml涂覆緩沖液)中稀釋至0.5-2μg/ml的最終濃度，并且以100μl體積分配至每個孔中(使用8通道移液器)。將板覆蓋并在無振蕩的條件下于室溫溫育1小時或在4℃過夜(理想地)。將溶液棄去并在紙巾上干燥。向每個孔中加入300μl封閉緩沖液(pbst+1％bsa)。再次覆蓋該板并在37℃(無振蕩)溫育1小時。將板用300μl1×pbst洗滌每孔3次。向每個孔中加入100μl封閉/樣品稀釋液中的稀釋的血清樣品(1:100,1:500)；對于對照孔，加入mab標(biāo)準曲線(500、250、125、62.5、31.25ng/ml)。覆蓋板并在室溫溫育1小時。將溶液棄去，并再次在紙巾上干燥。將板的每個孔用300μl1×pbst(用于elisa)洗滌4次。每孔中分配100μl(使用8通道吸液器)在封閉/樣品稀釋液中的、最終濃度為0.3μg/ml的稀釋bt-mab純化蛋白(一個96孔板使用10ml包被緩沖液)。將板覆蓋并在室溫溫育1小時，之后棄去溶液，并將板在紙巾上干燥。每孔用300μl1×pbst(用于elisa)洗滌4次。將中性抗生物素蛋白綴合的hrp在封閉/樣品稀釋液中以1:1000的比例稀釋，并以100μl的體積加入每個孔中。將板覆蓋并在室溫溫育30分鐘，之后棄去溶液，并在紙巾上干燥板。將板的每個孔用300μl1×pbst(用于elisa)洗滌4次。向每個孔中加入100μlsureblue(kpl)基質(zhì)(陽性樣品將變?yōu)樗{色)。將板覆蓋并在室溫下溫育30分鐘至1小時。在加入100μl終止溶液(kpl)后，在650nm處讀取藍色吸光度，在450nm處讀取黃色吸光度。如本文所公開的，通過評估等同于通過elisa測定的od450值的ospa特異性血清抗體滴度來考慮疫苗效能或血清保護。如在richeretal.,clin.vaccineimmunol.18:1809,2011中所提出的并且也在本文中公開(如us8,821,893中所提及的，該文獻通過引用整體并入本文)的關(guān)于核心疫苗技術(shù)的早期優(yōu)化研究，旨在定義通過合格的elisa方法測量的、小鼠中響應(yīng)于口服疫苗給藥的血清反應(yīng)性。疫苗“單位”表示劑量，并且等于約log5x105cfu。每周向小鼠施用相當(dāng)于0、6、12和30單位的多種劑量(第0、14、28和42天)，持續(xù)長達6周。如圖10所示，血清反應(yīng)峰在約等于1.5的od450血清抗體滴度附近出現(xiàn)。對于商業(yè)應(yīng)用，認為使用最小數(shù)目的劑量以產(chǎn)生最有效的血清反應(yīng)是有意義的，從而定義mid。根據(jù)圖10中顯示的結(jié)果，對于本發(fā)明公開的疫苗技術(shù)應(yīng)用的商業(yè)演變，考慮使用總共多達6劑的周劑量；數(shù)據(jù)證明在以6單位/周的劑量施用疫苗約21天后獲得約等于0.6的od450血清抗體滴度。當(dāng)對多個小鼠物種口服施用時，實驗證據(jù)進一步證明了核心疫苗技術(shù)的效能。研究總結(jié)概述于表7中。表7疫苗效能總結(jié)研究#1234#小鼠46866誘餌形式rtvrtvusb疫苗usb對照給藥每周每天每周每周劑量1劑/周自由采食1劑/周1劑/周持續(xù)時間4周1年3周3周測定每周每周第4周第4周攻擊是，實驗物是，野生型不適用不適用反應(yīng)中和中和效能不適用研究1是疏螺旋體(borrelia)攻擊的實驗室研究，其按照richeretal.,clin.vaccineimmunol.18:1809,2011中所述進行，并且也在本文中公開，如us8,821,893b2中所提及的。在研究中將總共4只遠交的白足小鼠(peromyscusleucopus)作為受試動物(作為代表性的野生的、儲存宿主靶向動物)用于疫苗施用。按照richeretal.,2011.中所述生成疫苗(儲存宿主靶向疫苗，rtv)。按照每周一劑的劑量每周施用疫苗，施用時間共4周。如richeretal.,2011.中所述，在最后一次給藥后2周進行疏螺旋體攻擊，以評估疫苗中和疏螺旋體感染的效能。簡而言之，將6-8個伯氏疏螺旋體(b.burgdorferi)感染的蜱幼蟲置于受試動物頭的后部，并使其保持3天直到吸食血液充血時自然落下。然后收獲小鼠組織(心臟和膀胱)和血清。通過在bsk-h培養(yǎng)基中于34℃下培養(yǎng)長達6周測定組織的疏螺旋體感染，每周通過暗視野顯微鏡檢查培養(yǎng)物。無疏螺旋體培養(yǎng)物(從分離的小鼠組織中培養(yǎng)了0個活的螺旋體)表明通過疫苗施用感染被中和以及產(chǎn)生的ospa抗體滴度負載量。通過elisa在收獲的血清樣品中測量中和ospa特異性全身igg反應(yīng)滴度。對于商業(yè)應(yīng)用，該研究定義了誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答所需的mid(圖11，研究1)。研究2是將研究1平移到基于r&d的預(yù)期5年的野外試驗。按照richeretal.,j.infect.dis.209:1972,2014中所述開發(fā)核心疫苗技術(shù)(rtv)。作為圖11中所示的研究數(shù)據(jù)的一部分，研究2代表疫苗接種活動的結(jié)果，在該疫苗接種活動中，每天施用疫苗，并且每周監(jiān)測和測定動物對ospa抗原的血清反應(yīng)性。來自68個經(jīng)評估的小鼠的結(jié)果證明，使用疫苗核心技術(shù)的實驗室優(yōu)化的mid對白足小鼠口服接種疫苗，使得通過elisa測量的血清抗體滴度有效地中和疏螺旋體(自然挑戰(zhàn)模型)的蜱幼蟲感染流行。從該研究中得到的等于0.6的平均od450ospa特異性血清抗體滴度表示所施用的mid所需的保護的足夠相關(guān)性。該研究還得出以下結(jié)論：在5年活動期間在野外施用疫苗致使幼蟲感染患病率減少高達76％。研究3是對商業(yè)疫苗進行的實驗室研究，商業(yè)疫苗的配方是本發(fā)明公開的主題(usbvaccine)。使用c3h近交系小鼠。使用小鼠誘餌顆粒作為基質(zhì)，該基質(zhì)上涂覆有mid為5×105cfu的穩(wěn)定化疫苗。在總共三周的給藥時間內(nèi)每只小鼠每周接受一次給藥；在研究的第4周結(jié)束時通過elisa測定小鼠的血清反應(yīng)性。將結(jié)果與未接種疫苗的對照(usb對照，研究4)進行比較。與那些施用非疫苗涂覆的顆粒的動物相比，在僅3次給藥后，從接種疫苗的動物獲得的結(jié)果顯示在所有6只測量的小鼠中均有血清反應(yīng)(圖11，研究3和4)。圖11還提供了建立針對疏螺旋體的保護的相關(guān)性所需的最小od450ospa血清抗體滴度等同值(equivalents)的綜合概要。已經(jīng)通過等同于od450≥0.6的吸光度的小鼠血清ospa特異性抗體滴度來定義效能值。當(dāng)所有實驗室數(shù)據(jù)和野外數(shù)據(jù)歸一化為血清反應(yīng)性的od450等同值時，所有數(shù)據(jù)進行集體校準。通過引用并入本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請通過引用并入本文，并入程度如同明確地且單獨地指出通過引用并入每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾?。?yīng)理解，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以改變本發(fā)明的各種細節(jié)。此外，以上描述僅僅是為了說明的目的，而不是為了限制的目的。參考文獻bowmanandclements,“differentialbiologicalandadjuvantactivitiesofcholeratoxinandescherichiacoliheat-labileenterotoxinhybrids(霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素雜合體的不同的生物活性和佐劑活性)”,infect.immun.69(3):1528-1535,2001.chenandcerutti,“vaccinationstrategiestopromotemucosalantibodyresponses(促進粘膜抗體應(yīng)答的疫苗接種策略)”,immunity33:479-491,2010.erdileetal.,“roleofattachedlipidinimmunogenicityofborreliaburgdorgeriospa(附著脂質(zhì)在伯氏疏螺旋體ospa的免疫原性中的作用)”,infect.immun.61(1):81-90,1993.flanaganetal.,“oraladministrationofescherichiacoliinentericcoatedmicroparticlesinducesserumantibodiesagainstlipopolysaccharideantigens(腸溶包衣微粒中的大腸桿菌的口服誘導(dǎo)針對脂多糖抗原的血清抗體)”,j.endotoxinres.3(6):481-489,1996.fujkuyamaetal.,“novelvaccinedev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