本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)獎(jiǎng)勵(lì)的合同號(hào)R01-MH39085的政府支持下進(jìn)行。政府享有本發(fā)明的一些權(quán)益。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年2月7日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/937,425的優(yōu)先權(quán)，在此通過援引將其內(nèi)容整體上并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體上涉及在治療腦癌中對(duì)單胺氧化酶(MAO)的抑制，及其抑制劑(MAOI)。

背景技術(shù)：

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是原發(fā)性腦腫瘤的最惡性形式，中位數(shù)存活時(shí)間為約14個(gè)月(1)。目前的治療包括手術(shù)、放療和化療。用于GBM治療的化療劑是DNA烷基化劑，替莫唑胺(TMZ)。該藥物與手術(shù)和放療組合或者作為獨(dú)立的化療劑是有效的(2)。不幸的是，治療后，腫瘤通常復(fù)發(fā)，并且對(duì)TMZ不再響應(yīng)。然后治療選項(xiàng)非常有限。因此，對(duì)于治療TMZ抗性的復(fù)發(fā)GBM而言，鑒定良好耐受的、對(duì)膠質(zhì)瘤具有細(xì)胞毒性并且能夠穿過血腦屏障的藥物是極其有用的。

單胺氧化酶A(MAO A)是線粒體結(jié)合的酶，其催化諸如血清素、去甲腎上腺素、多巴胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的氧化性脫氨，并且產(chǎn)生使癌細(xì)胞傾向于DNA損傷的過氧化氫(H₂O₂)、反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)，由此促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室之前的研究顯示，前列腺癌中的MAO A的敲弱(KD)或藥理學(xué)抑制使癌進(jìn)展降低或消除(3)。氯吉林(Clorgyline)是穿過血腦屏障(BBB)的選擇性MAO A抑制劑(MAOI)，用作抗抑郁藥，引起前列腺癌體內(nèi)生長的降低。氯吉林綴合物NMI顯著地降低腫瘤生長，在體內(nèi)和體外對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性，也穿過BBB，并且通過用于癌診斷的近紅外成像可視化，和監(jiān)視癌進(jìn)展。

之前已經(jīng)報(bào)道了在數(shù)種癌(包括前列腺癌和腎細(xì)胞癌)中MAO A表達(dá)增加(15,16)，并且基于癌基因芯片數(shù)據(jù)集的集合，在大多數(shù)人癌中下調(diào)(17)。之前，本發(fā)明人證明MAO A表達(dá)的升高促進(jìn)前列腺腫瘤發(fā)生，并且誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)。此外，MAO A的抑制在體外降低LNCaP PCa細(xì)胞的生長，并且在體內(nèi)降低腫瘤異種移植物的生長(18,3)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于治療腦癌的化合物和藥物組合物，并且涉及使用本發(fā)明的化合物和藥物組合物治療腦癌的方法。

根據(jù)本發(fā)明的治療腦癌的方法包括對(duì)患有腦癌并需要治療的患者施用有效量的MAO抑制劑。待治療的腦癌可以是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并且包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。待治療的腦癌也可以是具有TMZ抗性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

MAO抑制劑優(yōu)選選自由下述組成的組：

優(yōu)選的是，MAO抑制劑選自由下述組成的組：

在優(yōu)選實(shí)施方式中，MOA抑制劑可以經(jīng)由連接物(linker)與近紅外染料共價(jià)連接。近紅外染料包含多烯官能團(tuán)，并且優(yōu)選是選自由IR-783、IR-780、IR-786和MHI-148組成的組的近紅外染料，更優(yōu)選是MHI-148。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，MAO抑制劑選自由下述組成的組：MHI-148和嗎氯貝胺的綴合物(MHI-嗎氯貝胺)、MHI-148和苯乙肼的綴合物、MHI-148和反苯環(huán)丙胺的綴合物、MHI-148和帕吉林的綴合物、MHI-148和氯吉林的綴合物。

優(yōu)選實(shí)例包括：

和其鹽、其羧酸或其酯。

其它實(shí)例包括具有下式的化合物：

A、B或C＝F、Cl、Br、I

X＝NH、O、S

Y＝Cl、Br、I、甲磺?；⒓妆交酋；?/p>

m，n＝1～15。

本發(fā)明的另一實(shí)施方式是包括下述物質(zhì)的鹽或其羧酸或酯類似物的化合物：

和包含它們的藥物組合物，以及治療腦癌的方法和它們的應(yīng)用。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于治療藥物抗性腦癌的化合物和藥物組合物，和用于治療藥物抗性腦癌的治療方法。根據(jù)本發(fā)明的治療藥物抗性腦癌的方法通常包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于使TMZ抗性腦癌對(duì)TMZ敏感化的化合物和藥物組合物，和治療TMZ抗性腦癌的治療方法。根據(jù)本發(fā)明的使TMZ抗性腦癌對(duì)TMZ治療敏感化的藥物治療方法通常包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。所述方法優(yōu)選包括同時(shí)或依次施用有效量的TMZ。

本發(fā)明顯示單胺氧化酶A(MAO A)的抑制降低腫瘤生長，并且增加替莫唑胺(TMZ)-抗性膠質(zhì)瘤的存活。膠質(zhì)瘤最初對(duì)TMZ響應(yīng)；但是患者通常變得對(duì)該藥物具有抗性并且腫瘤復(fù)發(fā)。然后無可用的治療。MAO A是線粒體酶，其使單胺神經(jīng)遞質(zhì)氧化性脫氨，產(chǎn)生引起細(xì)胞損傷和癌的過氧化氫。人膠質(zhì)瘤表達(dá)MAO A，而正常星形膠質(zhì)細(xì)胞具有不可檢測(cè)的MAO A活性。體外研究顯示，本文定義的兩種MAO抑制劑，氯吉林和NMI，在藥物敏感性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增加TMZ敏感性，而在TMZ-抗性細(xì)胞中僅NMI使細(xì)胞敏感化，而氯吉林不能。在抗性和敏感性人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，對(duì)于降低遷移而言NMI(IC₅₀:5μM)都比氯吉林(IC₅₀:140μM和136μM)有效。植入MAO A KO小鼠中的小鼠GL26腫瘤與野生型相比展示提高的存活，表明微環(huán)境中的MAO A影響腫瘤生長和存活。原位異種移植模型中的藥物功效研究顯示，氯吉林和NMI都降低TMZ-抗性腫瘤的生長并且增加存活(分別是28％、46％)。腫瘤組織的分析顯示，MAO A抑制劑降低增殖、微血管密度和基質(zhì)金屬蛋白酶，并且增加巨噬細(xì)胞浸潤。總之，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MAO A在藥物敏感性和抗性膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的重要作用，并且鑒定了作為用于治療藥物抗性腦腫瘤的重要治療劑的MAO A抑制劑及其綴合物。本發(fā)明顯示，MAO A抑制劑在體外和體內(nèi)具有活性：減緩腫瘤進(jìn)展和延長患有藥物抗性膠質(zhì)瘤的患者的存活。

附圖說明

圖1顯示NMI的合成。

圖2顯示MAOA表達(dá)和活性在膠質(zhì)瘤組織、小鼠和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增加。(A)將非惡性腦和膠質(zhì)瘤(GBM)試樣用抗-MAO A染色。陽性細(xì)胞是紅色的，細(xì)胞核是藍(lán)色的。(B)將U251R和U251S細(xì)胞用抗-MAOA抗體染色；紅色染色顯示MAOA表達(dá)的陽性細(xì)胞。(C)測(cè)定U251S和U251R、小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(GL26)和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中的MAO A催化活性。

圖3證明了在GL26細(xì)胞中氯吉林和NMI抑制MAO A。在濃度增加的氯吉林和NMI的存在下確定GL26細(xì)胞中的MAO A活性。氯吉林以10^-9M的IC₅₀值抑制MAOA活性，NMI以10^-5M的IC₅₀值抑制MAO A活性。

圖4顯示在用單獨(dú)的TMZ(15μM)和單獨(dú)的氯吉林(10μM)及氯吉林與TMZ組合處理的(A)U251S和(B)U251R中進(jìn)行集落形成和遷移檢驗(yàn)48小時(shí)，并且將集落在第8或10天用1％亞甲基藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。在分別用氯吉林(1μM、5μM、10μM)處理24小時(shí)和20小時(shí)的(C)U251S和(D)U251R細(xì)胞中進(jìn)行遷移檢驗(yàn)。誤差棒是一式三份進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的平均值的±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM)。*p<0.05，t檢驗(yàn)。

圖5顯示在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的NMI的結(jié)構(gòu)和功能。(A)NMI的結(jié)構(gòu)。(B)用NMI處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。MitoTracker試劑染色的線粒體。(C)集落形成檢驗(yàn)，用單獨(dú)的TMZ(15μM)(T)和單獨(dú)的NMI(1μM、5μM、10μM)(N)以及NMI與TMZ組合處理48小時(shí)的(a)U251S和(b)U251R；將集落計(jì)數(shù)。(D)通過MTS測(cè)定的氯吉林和NMI對(duì)(a)U251S和(b)U251R中的細(xì)胞活力的影響。(E)對(duì)用NMI(1μM、5μM、10μM)處理24小時(shí)的(a)U251S和(b)U251R細(xì)胞進(jìn)行遷移檢驗(yàn)。誤差棒＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM)；實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。***p<0.0001，**p<0.005，*p<0.05，t檢驗(yàn)。

圖6顯示在MAOA KO小鼠中膠質(zhì)瘤進(jìn)展降低，并且存活時(shí)間增加。(A)將小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞顱內(nèi)植入WT和MAOA KO中，10天后成像。星號(hào)(*)表示小鼠標(biāo)簽數(shù)量。(B)柱狀圖顯示發(fā)光(與腫瘤尺寸相關(guān))。(C)使用Kaplan-Meier繪圖分析WT和MAOAKO小鼠的存活(天數(shù))。(D)檢驗(yàn)?zāi)[瘤和周圍組織的MAO A活性。

圖7顯示在小鼠異種移植物模型中氯吉林抑制膠質(zhì)瘤生長。(A)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下植入；7天后開始治療：載劑(水)(30μl)，或氯吉林(30mg/kg)，每日，持續(xù)21天。在第13、28和41天將腫瘤成像。(B)柱狀圖顯示從成像計(jì)算的腫瘤體積；p<0.05。

圖8顯示單獨(dú)的氯吉林和單獨(dú)的NMI或者它們與TMZ組合在顱內(nèi)小鼠模型中減緩腫瘤生長，并增加存活。無胸腺/裸小鼠顱內(nèi)植入人膠質(zhì)瘤細(xì)胞。7天后，用以下物質(zhì)每天處理動(dòng)物21天：載劑，TMZ(1mg/kg)，氯吉林(10mg/kg)，TMZ(1mg/kg)+氯吉林(10mg/kg)，NMI(5mg/kg)，TMZ(1mg/kg)+NMI(5mg/kg)。TMZ治療僅在前10天提供。(A)NMI定位至腫瘤。(B)在處理后連續(xù)數(shù)天，植入7天后將腫瘤成像。(C)圖顯示發(fā)光(與腫瘤尺寸相關(guān))。(D)Kaplan-Meier存活曲線；p值表示在所有治療組中存活增加。

圖9顯示氯吉林和NMI減少增殖和血管生成，并在體內(nèi)誘導(dǎo)先天性免疫響應(yīng)，(A)將來自經(jīng)載劑、氯吉林和NMI處理的動(dòng)物的組織用Ki67、MMP 9和CD31免疫染色。紅色表示陽性染色。(放大率400x)。將組織切片(B)對(duì)F4/80、TNF-α和TGFβ進(jìn)行免疫染色。紅色表示陽性染色。(放大率400x)。(C)處理組織中Ki67、CD31和F4/80的定量。*p<0.05，**p<0.01(與載劑相比)。

圖10顯示MAO A抑制劑減少腫瘤生長、降低MAOA活性并增加動(dòng)物存活。A)將小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞顱內(nèi)植入：6天后，每天用載劑、TMZ(1mg/kg)、苯乙肼(10mg/kg)、TMZ(1mg/kg)+苯乙肼(10mg/kg)和嗎氯貝胺(10mg/kg)處理動(dòng)物。使用Kaplan-Meier繪圖分析存活率；p值表明所有處理顯著地增加存活。B)MAOA活性在用MAO抑制劑處理后減少。

圖11顯示與正常腦相比，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)組織中MAOA表達(dá)增加。將正常和膠質(zhì)瘤(GBM)腦試樣的冷凍切片用抗-MAOA抗體染色。陽性細(xì)胞顯示紅色沉淀；蘇木精染色(藍(lán)色)細(xì)胞核。與正常腦相比，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)組織中MAOA表達(dá)增加。

圖12顯示，在腫瘤衍生細(xì)胞系(LN229,U251)、GSC(USC02,USC08)和在GBM中但不是在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中的MAO A和MAO B活性表明：MAOA活性與癌進(jìn)展相關(guān)。收集來自細(xì)胞的總蛋白，并在37℃與10μM的¹⁴C-標(biāo)記的血清素一起溫育20分鐘。通過液體閃爍分光術(shù)測(cè)定放射活性。

圖13顯示膠質(zhì)瘤生長在MAOA/B敲除(KO)小鼠中顯著降低。A)將熒光素酶-標(biāo)記的GL-26膠質(zhì)瘤細(xì)胞顱內(nèi)植入WT和A/B KO C57B/L小鼠中，10天后成像。B)柱狀圖顯示與腫瘤尺寸相關(guān)的發(fā)光。C)WT和A/B KO C57B/L小鼠的動(dòng)物存活的比較。存活率增加了116.6％(14天)。***p<0.0001。

圖14顯示用氯吉林治療人膠質(zhì)瘤細(xì)胞降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。使膠質(zhì)瘤細(xì)胞(LN229)生長至匯聚，然后用絲裂霉素C處理以防止增殖。進(jìn)行“刮擦”以清除一細(xì)胞區(qū)域，然后用(A)載劑或(B)氯吉林[10μM]處理培養(yǎng)物24小時(shí)。結(jié)果顯示氯吉林將遷移速率降低約50％。(C)數(shù)據(jù)總結(jié)。

圖15顯示用MAO A抑制劑氯吉林處理誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞毒性。(A)GSC用氯吉林處理96小時(shí)，并使用球形體形成進(jìn)行檢驗(yàn)；(B)GSC用氯吉林和TMZ處理72小時(shí)，再次添加氯吉林另外48小時(shí)，并進(jìn)行檢驗(yàn)(MTT)。結(jié)果顯示氯吉林在5μM和10μM時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。此外，與TMZ組合的氯吉林顯示細(xì)胞毒性增加50％。

圖16顯示MHI-氯吉林在具有替莫唑胺抗性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中減少集落形成。使U251TMZ抗性(R)在6孔板中鋪平板，用MAOA抑制劑和TMZ處理48小時(shí)。與載劑相比，MHI-氯吉林將集落形成(CFA)速率減少65％。TMZ和MHI-氯吉林的組合處理使具有TMZ抗性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ敏感化，導(dǎo)致集落形成減少85％。CFA是細(xì)胞死亡的度量，集落越少則細(xì)胞死亡越多。

圖17顯示施用單獨(dú)的MHI-氯吉林或其與替莫唑胺(TMZ)組合在攜帶顱內(nèi)TMZ-抗性膠質(zhì)瘤的動(dòng)物中增加存活。將無胸腺/裸小鼠顱內(nèi)植入U(xiǎn)251-TMZ抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。7天后，將動(dòng)物分成以下組并每天處理：載劑，TMZ(1mg/kg)，氯吉林(10mg/kg)，MHI-氯吉林(5mg/kg)或TMZ(1mg/kg)+MHI-氯吉林(5mg/kg)。21天后，停止處理，記錄存活。結(jié)果顯示MHI-氯吉林處理動(dòng)物比載劑處理動(dòng)物存活長50％(p<0.0001)，TMZ+MHI-氯吉林處理動(dòng)物比載劑存活長70％(p<0.00001)。使用單獨(dú)的MHI-氯吉林或其與TMZ組合抑制MAOA在減緩膠質(zhì)瘤腫瘤進(jìn)展方面是有效的。MHI-氯吉林使TMZ-抗性細(xì)胞對(duì)TMZ敏感化。

圖18.前列腺癌和膠質(zhì)瘤具有MAO A活性，并且能夠用MAO I和MHI-氯吉林處理。前列腺癌和淋巴瘤不具有MAO A活性，因此不用氯吉林和MHI-氯吉林處理。

圖19.A)在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)中MAO A活性的存在和B)用氯吉林和MHI-氯吉林進(jìn)行處理，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞毒性。(A)GSC、USC08和USC02顯示MAOA活性。MAOA活性通過放射活性檢驗(yàn)確定。細(xì)胞勻漿在37℃與10μM的¹⁴C標(biāo)記血清素一起溫育20分鐘。提取MAOA催化反應(yīng)的產(chǎn)物5-HIAA，并通過液體閃爍分光術(shù)確定放射活性。B)USC08和USC02干細(xì)胞用增加濃度的氯吉林和MHI-氯吉林處理，并測(cè)定球形體形成。氯吉林和MHI-氯吉林誘導(dǎo)干細(xì)胞細(xì)胞毒性。

具體實(shí)施方式

適合用于本發(fā)明的藥物組合物通常通過將具有所需純度的活性成分與可選的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980))以凍干制劑或水性溶液形式來制備?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度時(shí)對(duì)于接收者是無毒的，并且包括：緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。

用于體內(nèi)施用的制劑通常應(yīng)該是滅菌的。這通過在凍干和重建(reconstitution)之前或之后，經(jīng)由無菌過濾膜過濾而容易實(shí)現(xiàn)。

定義

可能受益于本發(fā)明的治療方法或需要本發(fā)明的治療方法的患者是已經(jīng)被診斷患有腦癌的患者。

如本文所用，短語“治療腦癌”可以包括具有至少一種以下效果：抑制原發(fā)性腫瘤、宏轉(zhuǎn)移(macrometastases)或微轉(zhuǎn)移(micrometastases)的形成或擴(kuò)散，減少宏轉(zhuǎn)移的尺寸，或減輕或緩解由腦癌引起的疾病的一種或多種癥狀。本發(fā)明的藥物組合物的“有效量”是足以執(zhí)行特意陳述的目的的量。"有效量"可以憑經(jīng)驗(yàn)并以與所述目的相關(guān)的常規(guī)方式確定。宏轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移的形成、尺寸或擴(kuò)散的抑制或減少可以通過與未處理對(duì)照比較來顯示。

本文公開的是顯示MAO A介導(dǎo)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的結(jié)果，并且抑制MAO A活性可以減緩膠質(zhì)瘤生長，由此增加存活。此處提出的數(shù)據(jù)證明MAO抑制劑嗎氯貝胺、氯吉林及其衍生物NMI在減緩腫瘤生長方面具有活性。據(jù)證明來自GBM患者的組織試樣與非腫瘤腦組織相比過表達(dá)MAO A。檢查目前用作抗抑郁藥的MAO A抑制劑對(duì)腦癌(包括藥物-抗性膠質(zhì)瘤)的治療效果。

本文提出的結(jié)果證明MAO A在腦腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境中的作用。治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)是腫瘤復(fù)發(fā)，并且這些復(fù)發(fā)腫瘤通常具有TMZ抗性。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是MAO A抑制劑及其綴合物減少膠質(zhì)瘤生長和在TMZ-抗性中的進(jìn)展，這是顯著臨床意義的結(jié)果。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于治療腦癌的化合物和藥物組合物，所述腦癌包括惡性膠質(zhì)瘤，并包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)。另一方面涉及使用該組合物治療惡性膠質(zhì)瘤(例如GBM)的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的組合物通常會(huì)包含MAO抑制劑(即，能夠抑制MAO活性的活性劑)；和藥理學(xué)上合適的載體。在一個(gè)方面，治療惡性膠質(zhì)瘤的方法包括使所述膠質(zhì)瘤與有效量的MAO抑制劑接觸。與本發(fā)明該方面有關(guān)的治療患有惡性膠質(zhì)瘤或GBM的患者的方法包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。MAO抑制劑可以是NIR染料綴合至MAO抑制劑的納米綴合物。

本發(fā)明的第二方面涉及用于減少GBM進(jìn)展的藥物組合物，和使用所述組合物減緩GBM進(jìn)展的方法。本文所用的減緩進(jìn)展包括停止進(jìn)展，減緩進(jìn)展或減緩GBM腫瘤的至少一種特征的進(jìn)展增加速率。根據(jù)本發(fā)明該方面的組合物通常會(huì)包含MAO抑制劑(即，能夠抑制MAO活性的活性劑)；和生理學(xué)上合適的載體。與本發(fā)明該方面有關(guān)的減少GBM進(jìn)展的方法包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。MAO抑制劑可以是NIR染料綴合至MAO抑制劑的納米綴合物。

本發(fā)明的第三方面涉及用于降低GBM細(xì)胞遷移和侵襲的藥物組合物，和使用所述組合物降低GBM細(xì)胞遷移和侵襲的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的組合物通常會(huì)包含MAO抑制劑(即，能夠抑制MAO活性的活性劑)；和生理學(xué)上合適的載體。與本發(fā)明該方面有關(guān)的降低GBM細(xì)胞遷移和侵襲的方法包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。MAO抑制劑可以是NIR染料綴合至MAO抑制劑的納米綴合物。

本發(fā)明的第四方面涉及用于降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性的藥物組合物，和使用所述組合物降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的組合物通常會(huì)包含MAO抑制劑(即，能夠抑制MAO活性的活性劑)；和生理學(xué)上合適的載體。與本發(fā)明該方面有關(guān)的降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性的方法包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑。MAO抑制劑可以是NIR染料綴合至MAO抑制劑的納米綴合物。

本發(fā)明的第五方面涉及用于使TMZ抗性膠質(zhì)瘤(包括TMZ抗性GBM)對(duì)TMZ敏感化、由此使這些TMZ抗性細(xì)胞對(duì)該藥物敏感的藥物組合物，和使用所述組合物使TMZ抗性膠質(zhì)瘤(包括TMZ抗性GBM)敏感化的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的組合物通常會(huì)包含MAO抑制劑(即，能夠抑制MAO活性的活性劑)；和生理學(xué)上合適的載體。與本發(fā)明該方面有關(guān)的使TMZ抗性GBM對(duì)TMZ敏感化的方法包括對(duì)有需要的患者施用有效量的MAO抑制劑，使TMZ抗性GBM對(duì)TMZ敏感化，由此使其TMZ抗性，由此所述量可有效使TMA抗性GBM細(xì)胞對(duì)TMZ敏感化。MAO抑制劑可以是NIR染料綴合至MAO抑制劑的綴合物。

本發(fā)明的第六方面是對(duì)惡性膠質(zhì)瘤(包括GBM)的組合治療，其包括施用TMZ和MAO抑制劑的組合。TMZ和MAO抑制劑可以同時(shí)施用。反之，MAO抑制劑和TMZ可以依次施用，MAO抑制劑優(yōu)選首先施用。

合適的MAO抑制劑(包括其合適的納米綴合物)包括2013年7月26日提交的美國專利申請(qǐng)13/353,094號(hào)，其全部內(nèi)容通過援引并入本文。合適的MAO抑制劑及其納米綴合物可以根據(jù)美國專利申請(qǐng)13/353,094號(hào)所述的方法合成。

在一個(gè)實(shí)施方式中，與本發(fā)明相關(guān)使用的MAO抑制劑是本領(lǐng)域已知的。示例性的MAO抑制劑可以包括但不限于嗎氯貝胺、苯乙肼、反苯環(huán)丙胺、帕吉林和氯吉林。能夠抑制、下調(diào)或沉默MAO的表達(dá)的核酸也可以有利地使用。示例性的核酸MAO抑制劑可以包括siRNA、shRNA、反義核酸，或本領(lǐng)域公知的任何其它類型的基于核酸的基因沉默劑，例如誘餌(decoy)、核酶和適體。此類優(yōu)選實(shí)施方式可以單獨(dú)或在與本文所述的藥物組合物組合用作癌治療劑。

合適的MAO抑制劑包括：

和下述化合物11–14：

和其鹽。

如2013年7月26日提交的美國專利申請(qǐng)13/353,094號(hào)所述，MAO抑制劑可以與近紅外染料(NIR)連接以形成例如優(yōu)先或選擇性地靶向癌細(xì)胞的綴合物。根據(jù)本發(fā)明該方面的綴合物通常會(huì)具有與MAO抑制劑綴合的NIR染料納米顆粒。示例性的NIR染料可以包括共軛多烯官能團(tuán)，例如IR-783、IR-780、IR-786和MHI-148中發(fā)現(xiàn)的一種，但不限于此。示例性的MAO抑制劑包括苯乙肼、反苯環(huán)丙胺對(duì)映異構(gòu)體、帕吉林、雷沙吉蘭、D-丙炔苯丙胺、L-丙炔苯丙胺和下述化合物11–14：

和其鹽。

NIR染料與MAO抑制劑的綴合可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適化學(xué)手段實(shí)現(xiàn)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的示例性綴合物通常會(huì)具有至少兩個(gè)功能團(tuán)：經(jīng)由含有至少一個(gè)C原子和兩個(gè)H原子的連接物附接至發(fā)光元件(例如NIR染料納米顆粒)的MAO抑制劑。優(yōu)選的是，含有一個(gè)不飽和雙鍵或三鍵的至少兩個(gè)不飽和結(jié)構(gòu)體經(jīng)由1–3、1–5或1–15個(gè)原子的主鏈連接至一個(gè)雜環(huán)。

示例性的連接物是具有以下通式的連接物：

其中M₁是O或S；并且其中X、Y和Z中的至少兩個(gè)參與與不飽和和/或芳香族A和B(未示出)成鍵，其通過另外的碳、氧或氮原子進(jìn)行。不參與與基團(tuán)A或B所成的鍵的X、Y和Z中任一個(gè)取代有氫或低級(jí)脂肪族基團(tuán)，例如C₁-C₆烷基。

例如，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的綴合物可以是具有下式的綴合物：

A、B或C＝F、Cl、Br、I

X＝NH、O、S

Y＝Cl、Br、I、甲磺?；?、甲苯磺?；?/p>

m，n＝1～15。

在另一實(shí)施方式中，X和Y如上所述，Z選自由組成的組，其中共價(jià)鍵附接至芳香環(huán)。該化合物在本文稱為MHI-嗎氯貝胺，MAO-A特異性可逆抑制劑。

在另一實(shí)施方式中，X和Y與上述相同，Z是其中共價(jià)鍵也附接至芳香環(huán)。該化合物在本文稱為MHI-苯乙肼，MAO-A和–B抑制劑。

在又一實(shí)施方式中，X和Y與上述相同，Z是具有下式的(±)-反式-2-苯基環(huán)丙烷-1-胺：

其中共價(jià)附接通過芳香環(huán)。該化合物在本文稱為MHI-反苯環(huán)丙胺，其是MAO-A和–B抑制劑。

在又一實(shí)施方式中，X和Y與上述相同，Z是N-苯甲基-N-甲基丙-2-炔基-1-胺，其具有下式：

其中共價(jià)鍵如曲線所示附接至氮。該化合物在本文稱為MHI-帕吉林，MAO-A和–B抑制劑，優(yōu)先針對(duì)MAO-B。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，Y是S；X是具有下式的基團(tuán)：

Z是下式的基團(tuán)：

該化合物在本文稱為MHI-氯吉林，其是MAO-A特異性不可逆抑制劑。

在又一實(shí)施方式中，X和Y與上述相同，Z是選自以下的一種：

其中共價(jià)鍵附接至芳香環(huán)。這組化合物在本文統(tǒng)稱為MHI-MAOI。

在另一實(shí)施方式中，MAO抑制劑NIR染料綴合物具有下式：

A、B或C＝F、Cl、Br、I

X＝NH、O、S

Y＝Cl、Br、I、甲磺?；⒓妆交酋；?/p>

m，n＝1～15。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，為了改善MAO抑制劑對(duì)腫瘤的特異性靶向，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了示例性NIR染料-MAOA抑制劑綴合物NMI，證明了NIR染料-MAOA綴合物特異性靶向癌細(xì)胞的線粒體而不影響正常細(xì)胞(19)。NMI以陰離子形式如下所示：

如本文所用，NMI包括陰離子的鹽形式，或者鹽的羧酸或酯類似物。

本發(fā)明化合物的合適的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽例如包括：金屬鹽，包括堿金屬、堿土金屬和過渡金屬鹽，例如鈣、鎂、鉀、鈉和鋅鹽。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽還包括由堿性胺制成的有機(jī)鹽，所述堿性胺例如N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因。藥學(xué)上不可接受的堿加成鹽的實(shí)例包括鋰鹽和氰酸鹽。雖然藥學(xué)上不可接受的鹽通常不用做藥物，此類鹽例如可用作合成化合物時(shí)(例如在通過重結(jié)晶純化時(shí))的中間體。所有這些鹽可以通過常規(guī)手段從相應(yīng)的化合物通過例如合適的酸或堿與所述化合物反應(yīng)而制備。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指無毒的無機(jī)或有機(jī)酸和/或堿加成鹽，例如參見Lit等，Salt Selection for Basic Drugs(1986),Int J.Pharm.,33,201-217，在此通過援引并入。

NMI包含與NIR染料MHI-148通過酰胺鍵經(jīng)由連接物綴合的氯吉林(不可逆的MAOA抑制劑)。該雙官能系統(tǒng)具有用于診斷的NIR成像能力以及特異性靶向癌的治療活性。

例如本發(fā)明人已經(jīng)檢查了氯吉林和MHI-氯吉林在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中對(duì)腫瘤生長的功效。本發(fā)明人已經(jīng)指出，這些MAO A抑制劑對(duì)于GBM細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性。本發(fā)明人已經(jīng)證明，在原位體內(nèi)小鼠模型中，MAO抑制劑減少TMZ抗性GBM的腦腫瘤進(jìn)展。此外，MAO抑制影響腫瘤的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和微環(huán)境。

如本文顯示，NMI特異性靶向人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的線粒體，并抑制MAOA活性。在體外和體內(nèi)檢驗(yàn)中NMI比氯吉林具有更好的功效。NMI抑制藥物敏感性膠質(zhì)瘤和藥物抗性膠質(zhì)瘤的集落形成，并使敏感性和抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ治療進(jìn)一步敏感化。這表明MAO抑制劑影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的機(jī)制不依賴于TMZ-介導(dǎo)的活性。

這些結(jié)果證明NMI在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性方面比氯吉林有效30倍，表明細(xì)胞死亡的這種增加可能是(至少部分是)NIR綴合物在癌細(xì)胞中的更高累積的結(jié)果。本發(fā)明人還探索了氯吉林和NMI影響腫瘤細(xì)胞遷移(其是復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵特征)的能力，發(fā)現(xiàn)NMI顯著地抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，但是氯吉林未顯示任何顯著功效。該觀察也與下述觀念一致：NMI有效地將在腫瘤細(xì)胞中的高劑量MAO抑制劑沉積，并且MAO A降低與腫瘤生長降低相關(guān)。因此用NIR部分(moiety)靶向腫瘤以產(chǎn)生NMI是腫瘤生長的有效得多的抑制劑。

癌細(xì)胞通常處于復(fù)雜腫瘤微環(huán)境的持續(xù)壓力下，其包括缺氧、酸中毒、氧化脅迫和數(shù)種其它因素(21,22)。高氧化脅迫導(dǎo)致諸如過氧化氫等反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)的表達(dá)升高(23)。當(dāng)催化氧化反應(yīng)時(shí)MAOA產(chǎn)生過氧化氫作為副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物能夠被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成其它ROS物質(zhì)(24)。本發(fā)明人的結(jié)果顯示，與野生型相比，在MAO A KO小鼠中腫瘤生長減少，存活增加。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)在腫瘤和周圍組織中的MAOA活性比野生型低，表明微環(huán)境中的MAO A可以影響膠質(zhì)瘤生長和存活。受這些結(jié)果啟發(fā)本發(fā)明人探索了其它MAO抑制劑對(duì)腫瘤生長的潛力。顱內(nèi)異種移植物體內(nèi)小鼠模型證明用苯乙肼和TMZ的組合以及嗎氯貝胺使存活響應(yīng)增加。這些結(jié)果顯示，各種MAO抑制劑有效地減少腫瘤生長。使用顱內(nèi)異種移植物小鼠模型的體內(nèi)研究顯示，氯吉林(10mg/kg)和NMI(5mg/kg)都減少腫瘤生長速率并增加存活。結(jié)果還顯示TMZ和氯吉林的組合或NMI，與單獨(dú)的各藥物相比展示出針對(duì)存活的顯著加和效果。NMI(5mg/kg)顯示對(duì)腫瘤異種移植物生長的顯著抑制功效，還顯示出選擇性定位至腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明，NMI比單獨(dú)的氯吉林更有效，并且可能更有用，特別是針對(duì)TMZ抗性膠質(zhì)瘤。

為了確定MAO A抑制劑的體內(nèi)效果的潛在機(jī)制，檢查來自經(jīng)處理動(dòng)物的腫瘤組織的數(shù)種特征，包括微血管密度。數(shù)據(jù)表明，氯吉林和NMI都降低血管生長。該降低的理由不清楚。氯吉林和NMI似乎不影響正常血管，因?yàn)橄噜從X實(shí)質(zhì)的血管密度似乎不展示異常密度或血管結(jié)構(gòu)。因此MAO A抑制劑特異性影響腫瘤脈管。由于與正常腦相比，腫瘤脈管的微環(huán)境經(jīng)常表達(dá)高水平的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，以及低水平的血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)(25,26)，存在MAO A抑制劑也可以調(diào)節(jié)這些生長因子的可能性。

與對(duì)照組織相比，來自用MAO抑制劑處理的動(dòng)物的腫瘤組織展示高數(shù)量的巨噬細(xì)胞。有明顯證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)，特別是巨噬細(xì)胞，對(duì)于調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展是重要的(10)。促炎性巨噬細(xì)胞通常減少腫瘤生長，而免疫抑制性、抗炎性巨噬細(xì)胞維持或增強(qiáng)腫瘤生長(27)。促炎性巨噬細(xì)胞的特征是TNF-α的產(chǎn)生。本發(fā)明人的免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)顯示，NMI–處理的組織證明了TNF-α的顯著增加，表明此處存在的巨噬細(xì)胞可能是促炎性細(xì)胞。因此MAO抑制劑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性。

總之，本發(fā)明人已經(jīng)證明體內(nèi)MAO A抑制劑減少膠質(zhì)瘤生長和增加存活。MAO抑制劑的這些效果可能是腫瘤細(xì)胞的增殖減少、細(xì)胞毒性增加和/或侵襲減少的結(jié)果。MAO A抑制劑也可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性和/或降低腫瘤內(nèi)的血管密度而起作用?？赡躆AO A抑制劑執(zhí)行數(shù)種不同的功能，由此使這些抑制劑能夠?qū)λ幬?抗性膠質(zhì)瘤有效。因此對(duì)于膠質(zhì)瘤治療靶向MAO A是治療復(fù)發(fā)性腦腫瘤的有效途徑。

試驗(yàn)

A.材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)物.人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；TMZ-抗性人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，U251R，如之前所述衍生(4)。小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL26是來自UCLA的Linda Liau博士的饋贈(zèng)。將所有膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在37℃和5％CO₂下在加濕溫育器中在于補(bǔ)充有100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，Life technologies,Carlsbad,CA)中的10％胎牛血清(FCS)中培養(yǎng)。

MAO A催化活性檢驗(yàn).MAOA催化活性如之前所述確定(5)。簡言之，將細(xì)胞或組織勻漿與1mM ¹⁴C-5-羥色胺(5-HT)一起在檢驗(yàn)緩沖液中溫育。提取反應(yīng)產(chǎn)物，通過液體閃爍分光術(shù)確定放射活性。對(duì)于抑制活性檢驗(yàn)，在37℃將細(xì)胞與濃度增加的各種化合物一起預(yù)溫育20分鐘，然后在37℃添加¹⁴C標(biāo)記的5-HT 20分鐘。

激光掃描共聚焦顯微鏡.將細(xì)胞在玻璃底顯微鏡皿(MatTek)中在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中鋪平板(30,000個(gè)細(xì)胞/400μl)24小時(shí)。將細(xì)胞用NMI(1μM和5μM),MitotrackerGreen(200nM)(Life Technologies,Carlsbad,CA)和DAPI(1x)處理；溫育3小時(shí)。在ZeissLSM 510倒置激光掃描共聚焦顯微鏡上進(jìn)行成像。激發(fā)波長設(shè)定在λ_max＝790nmChameleon(DAPI，藍(lán)色激發(fā))、488nm(Mitotracker Green,黃綠色激發(fā))和633nm(NMI，紅色激發(fā))。以多軌模式獲得數(shù)據(jù)。使用130μM至200μM的針孔拍攝圖像。

集落形成檢驗(yàn).將膠質(zhì)瘤細(xì)胞一式三份地接種，然后用氯吉林、NMI和TMZ處理48小時(shí)。然后除去培養(yǎng)基，并更換為新鮮培養(yǎng)基(無藥物)。將細(xì)胞溫育另外8～10天；通過用1％亞甲基藍(lán)染色使集落可視化并進(jìn)行定量。

MTS檢驗(yàn).將膠質(zhì)瘤細(xì)胞一式四份地接種，并添加氯吉林和NMI 48小時(shí)。根據(jù)制造商說明(Promega,Madison,WI)確定活力；并相對(duì)于未處理對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。使用SigmaPlot 12.0繪制數(shù)據(jù)。

遷移檢驗(yàn).用絲裂霉素C(10μg/ml)(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)處理細(xì)胞2小時(shí)；使用200μL滅菌尖頭(sterile tip)進(jìn)行刮擦。然后用藥物處理細(xì)胞：并在0小時(shí)和20～24小時(shí)照相。使用ImageJ通過測(cè)定對(duì)照組v.s.處理組覆蓋的面積將遷移定量。

體內(nèi)研究.所有動(dòng)物程序由USC的國際動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。顱內(nèi)植入如之前所述進(jìn)行(6)。對(duì)于MAOA KO研究(7)，使用C57bl/6小鼠。將2×10⁴個(gè)熒光素酶標(biāo)記的GL-26小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞顱內(nèi)植入野生型(WT)(n＝4)和MAOA KO(n＝4)小鼠中；在植入后6天和10天成像。對(duì)于處理研究，植入腫瘤細(xì)胞，并在6天后開始處理。所有化合物溶解在10％DMSO+45％甘油+45％乙醇中并皮下注射；通過灌胃提供TMZ。每天處理動(dòng)物直到死亡，并記錄存活。

對(duì)于異種移植物模型，使用無胸腺(nu/nu)小鼠。將熒光素酶-陽性(2x10⁵)TMZ-抗性人膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251R)顱內(nèi)注射，7天后成像。腫瘤可視化后開始每天(21天)處理；僅在前10天施用TMZ。

在皮下異種移植物研究中，將5×10⁵個(gè)熒光素酶-陽性細(xì)胞皮下注入無胸腺小鼠中。每天施用藥物持續(xù)21天；監(jiān)視腫瘤尺寸。用載劑處理對(duì)照動(dòng)物。

免疫組織化學(xué)(IHC).冷凍組織在丙酮中固定。IHC如之前所述進(jìn)行(8)。使用以下一抗：F4/80、TGF-β、TNF-α(Abcam,Cambridge,MA)、Ki67(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA)、CD31(BD Biosciences,San Jose,CA)、MMP 9MAO A(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz)和生物素化二抗(Vector Laboratories,Berlingame,CA)。對(duì)照不包含一抗。使用Image J軟件分析圖像。

統(tǒng)計(jì)分析.使用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)分析所有參數(shù)數(shù)據(jù)，以計(jì)算顯著性值(significance value)。認(rèn)為概率值(p)<0.05是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。

B.NMI的合成

通常的合成方法

所有試劑和溶劑獲自商業(yè)來源，并且原樣使用，除非另外說明。涉及水分敏感性試劑的所有反應(yīng)利用無水溶劑和經(jīng)火焰干燥玻璃器皿在氬氣氣氛下進(jìn)行。吸濕性液體經(jīng)由注射器轉(zhuǎn)移，并通過橡膠隔膜引入反應(yīng)容器中。在30-150mm Hg使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將反應(yīng)產(chǎn)物溶液濃縮。使用試劑級(jí)溶劑在硅膠(230目～400目)上進(jìn)行柱色譜。在玻璃底的預(yù)包被板(0.25mm,硅膠60,F-254,EM Science)上進(jìn)行分析薄層色譜(TLC)。使用Shimadzu LC-10A VP泵和Shimadzu SPD 10A VP UV-可見光可變波長檢測(cè)器在Microsorb-MV C₈反相柱(250×4.6mm,Varian)上進(jìn)行分析HPLC。用C₈反相制備柱(Grace Davison)進(jìn)行制備型HPLC純化。制備型反相HPLC的流速是4mL/分鐘。在所有情況下，使用在0.1％水性三氟乙酸(TFA)中的5％-95％梯度的乙腈作為洗脫劑。水(18MΩ)獲自Barnstead水純化系統(tǒng)，所有緩沖液經(jīng)0.2μm過濾。在規(guī)定的溶劑中在儀器上收集核磁共振(NMR)譜。通過¹H NMR(Varian Mercury 400MHz)和質(zhì)譜(Agilent 6520飛行時(shí)間系統(tǒng))確認(rèn)各中間體和終產(chǎn)物的身份和純度。NMI合成的概述記載于圖1中。

叔丁基(3-溴丙基)氨基甲酸鹽(1)

向配備有磁力攪拌器的100-mL圓底燒瓶添加3-溴丙基胺氫溴酸鹽(6.57g,30mmol,1.0eq.)和二氯甲烷(160mL)。向所得溶液中添加在二氯甲烷(110mL)中的碳酸二叔丁酯(6.54g,30mmol,1.0當(dāng)量)，然后添加三乙胺(4.8mL,34.5mmol,1.15當(dāng)量)。在室溫?cái)嚢枞芤?5分鐘。將反應(yīng)物用飽和碳酸氫鈉(70mL,40mL)洗滌2次，并用飽和氯化鈉(100mL)洗滌1次。將有機(jī)相在硫酸鈉上干燥，過濾，并真空除去溶劑以產(chǎn)生1(6.91g,，97％收率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:4.67(bs,1H),3.43(t,J＝6Hz,2H),3.26(m,2H),2.04(m,2H),1.43(s,9H)。

叔丁基3-(2,4-二氯苯氧基)丙基氨基甲酸鹽(3)

向配備有磁力攪拌器的20-mL閃爍管添加2,4-二氯苯酚(2,237mg,1.45mmol,1.0當(dāng)量)，然后添加1,2-二氯乙烷(5mL)。向所得溶液中添加1(346mg,1.45mmol,1.0當(dāng)量)，四丁基氯化銨(44.2mg,0.159mmol,0.11當(dāng)量)，然后添加碘化鉀(24.1mg,0.145mmol,1.0當(dāng)量)。添加NaOH(5mL，10％)，并在80℃攪拌混合物1小時(shí)。分配兩相混合物，用DCM(7mL)提取水性層2次。匯集有機(jī)相，在硫酸鎂上干燥，過濾，然后濃縮。然后將材料(512.7mg)以硅膠過柱(2.5”×1”，高度×寬度)，用100mL在己烷中的10％乙酸乙酯、100mL在己烷中的15％乙酸乙酯和100mL 25％乙酸乙酯洗脫。產(chǎn)物3在15％乙酸乙酯級(jí)分中洗脫。收率310mg(67％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.32(d,J＝2.4Hz,1H),7.14(dd,J₁＝8.8Hz,J₂＝2.4,1H),6.80(d,J₁＝5.2Hz,1H),5.18(bs,1H),4.04(t,J＝6Hz,2H),3.34(m,2H),2.00(m,2H),1.41(s,9H)。

叔丁基3-(2,4-二氯苯氧基)丙基(丙-2-炔基)氨基甲酸鹽(4)

向20-mL閃爍管添加3(500mg,1.57mmol,1.0當(dāng)量)，然后添加氫化鈉(63mg,1.57mmol,1.0當(dāng)量)。在通向大氣的情況下所得溶液攪拌15分鐘，然后添加炔丙基溴(470μL在甲苯中的80％溶液(w/v),3.14mmol,2.0當(dāng)量)。注意：當(dāng)添加炔丙基溴時(shí)溶液顏色從淡黃色變色為褐色。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，通過氣流除去溶劑，并真空干燥殘留物。將殘留物在5mL DCM中重建，添加1.65g硅藻土-545。然后蒸發(fā)混合物至干燥。將該材料加載至用己烷平衡的5”×1”(高度×寬度)SiO₂塞，并將產(chǎn)物用100mL在己烷中的2％乙酸乙酯、200mL在己烷中的5％乙酸乙酯和200mL在己烷中的30％乙酸乙酯洗脫。匯集含有產(chǎn)物的級(jí)分(產(chǎn)物在己烷中的5％～30％乙酸乙酯中洗脫)。產(chǎn)生292.6mg的4(52％收率)¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.35(d,J＝2.8Hz,1H),7.16(dd,J₁＝9.2Hz,J₂＝2.8,1H),6.82(d,J₁＝8.8Hz,1H),5.18(bs,1H),4.05(m,4H),3.55(t,J＝7.2Hz,2H),2.18(t,J＝2.4Hz,2H),2.00(m,2H),1.43(s,9H)。

N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔基-1-三氟乙酸銨

在攪拌的同時(shí)在室溫向在配備有攪拌棒的20mL閃爍管中的于4mL DCM中的叔丁基3-(2,4-二氯苯氧基)丙基(丙-2-炔基)氨基甲酸鹽4(147.6mg,412μmol)的溶液中添加1mL TFA。15分鐘后，HPLC(5-95％B(A＝0.05％TFA水溶液；B＝乙腈)超過20分鐘，0.8mL/min)表明反應(yīng)完成。減壓除去溶劑。將殘留物與ACN共蒸發(fā)數(shù)次，然后用于下一步驟而無需進(jìn)一步純化。

叔丁基(3-氧丙基)氨基甲酸鹽(5)

向100mL圓底燒瓶添加叔丁基(3-羥丙基)氨基甲酸鹽(1.8g,10.3mmol,1.0當(dāng)量)，然后添加35mL的CHCl₃和35mL的0.5M NaHCO₃/0.05M K₂CO₃。在劇烈攪拌下向該混合物添加四丁基氯化銨(288mg,1.04mmol,0.1當(dāng)量)、TEMPO(162mg,1.04mmol,0.1當(dāng)量)和N-氯代琥珀酰亞胺(2.1g,15.7mmol,1.53當(dāng)量)。3小時(shí)后分離相，將有機(jī)層干燥，并除去溶劑以提供粘性橙色油。使該材料在使用4”×1”(高度×寬度)的SiO₂塞的硅膠上進(jìn)行柱色譜，用75mL己烷、100mL在己烷中的20％乙酸乙酯、100mL在己烷中的30％乙酸乙酯、50mL乙酸乙酯洗脫。收率732.8mg(41％)。

叔丁基(3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基-1-基)氨基)丙基)氨基甲酸鹽(6)

向配備有攪拌棒的100-mL圓底燒瓶添加在25mL 1,2-DCE中的N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔基-1-三氟乙酸銨4(1.25g,3.36mmol,1.0當(dāng)量)。接下來，添加5(0.641mg,3.4mmol,1.1當(dāng)量)，然后添加DIPEA(584μL,3.36mmol,1.0當(dāng)量)、乙酸(330μL,5.81mmol,1.73當(dāng)量)和三乙酰氧基硼氫化鈉(1.14g,5.38mmol,1.6當(dāng)量)。將反應(yīng)攪拌5.5小時(shí)，直到達(dá)到約85％的轉(zhuǎn)換，在此時(shí)用碳酸氫鈉(100mL)將有機(jī)層洗滌2次，在無水MgSO₄上干燥，過濾，真空除去溶劑以提供1.12g粗品6。該材料用于下一步驟而無需進(jìn)一步純化。

N1-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)-N1-(丙-2-炔-1-基)丙烷-1,3-二銨(diaminium)2,2,2-三氟乙酸鹽(7)

機(jī)械攪拌在含有248mg HCl的10mL乙酸乙酯中的N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)-N-(丙2-炔-1-基)丙烷-1,3-氯化二銨(diaminium chloride)7(16mg,38.5μmol)的溶液。將所得反應(yīng)物在室溫下攪拌80分鐘，直至通過LC/MS確認(rèn)反應(yīng)完成。將產(chǎn)物減壓蒸發(fā)，用于下一步驟而無需進(jìn)一步純化。

向20-mL閃爍管添加MHI-148染料8(5.79mg,8.47μmol)，然后添加DMF(500μL)、DIPEA(1.1μL,8.47μmol,1.0當(dāng)量)和HBtU(3.2mg,8.47μmol,1.0當(dāng)量)。在室溫下將混合物攪拌10分鐘，其后添加在DMF(500μL)中的7(4.6mg,8.47μmol,1.0當(dāng)量)和DIPEA(2.2μL,16.94μmol,2.0當(dāng)量)。將反應(yīng)用箔覆蓋，在室溫下攪拌過夜。通過氣流蒸發(fā)DMF，在制備型硅膠板上使用DCM/異丙醇1:1作為洗脫劑將殘留物純化。NMI收率1.2mg(14％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.49(m,2H,γ-CH₂(COOH)),1.56(m,2H,γ-CH₂(CONHCH₂-)),1.67(s,6H,CH₃),1.71(s,6H,CH₃),1.80(m,2H,β-CH₂),1.82(m,2H,β-CH₂),1.86(m,2H,δ-CH₂),1.88(m,2H,δ-CH₂),1.94(s,2H,O-CH₂CH₂CH₂N-),1.97(s,2H,NH-CH₂CH₂CH₂N-),2.09(s,2H,CH₂),2.56-2.57(m,4H,α-CH₂),2.68-2.70(m,4H,CH₂NCH₂),2.71(s,2H,CH₂C＝),2.75(s,2H,CH₂C＝),3.38(m,2H,-NHCH₂),4.04(t,1H,HCΞC-),4.05(t,4H,N-CH₂),4.05(t,2H,O-CH₂),4.07(t,2H,CH₂CΞ),4.57(bs,1H,NH-CH₂CH₂),6.04(d,1H,CH＝CH),6.32(d,1H,CH＝CH),6.85(d,1H,Ar-H),7.05(d,1H,Ar-H),7.17–7.42(m,9H,Ar-H),8.28(d,1H,CH＝CH),8.40(d,1H,CH＝CH).HRMS對(duì)于C₅₇H₆₉Cl₃N₃O₄S C₅₇H₇₀Cl₃N₄O₄計(jì)算m/z 979.4457；觀察到m/z 979.4463。

MHI-148-氯吉林綴合物

S-3-溴代丙基乙酰硫(ethanethioate)的合成

組裝配備有在玻璃套管中熱電偶、磁力攪拌器、有氬氣入口(中柱)的vigreux柱和套管橡膠隔膜塞的250mL三頸圓底燒瓶，并在Ar流動(dòng)下用熱槍干燥。在Ar下經(jīng)由插管(cannula)添加約110-120mL的無水DMF。將AcSK(11.68g,102.3mmol)逐份添加到燒瓶中，同時(shí)用冰-MeOH浴冷卻。在約-10℃使反應(yīng)進(jìn)行7小時(shí)。通過添加165mL水猝滅反應(yīng)后除去冰-MeOH浴。用300mL MTBE和700mL水將反應(yīng)混合物分配(partitioned)。通過200mL MTBE洗滌水層。依次用水、鹽水和NaHCO₃洗滌MTBE層，通過MgSO₄干燥，過濾并蒸發(fā)。收率98.7％(19.1g)。

S-3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙基乙酰硫的合成

向在配備有攪拌棒的5mL小瓶中的在100μL ACN中的N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔基-1-銨2,2,2-三氟乙酸鹽(2.14mg,0.05mmol)的溶液中，添加12.1mg(0.09mmol)K₂CO₃和142.4mg(0.720mmol)S-3-溴代丙基乙酰硫。在油浴中加熱至50℃的同時(shí)攪拌混合物。在反應(yīng)過程之后進(jìn)行TLC(硅膠，MTBE:己烷＝9:1，以檢測(cè)原料，和MTBE:己烷＝1:9，以檢測(cè)硫代醋酸酯試劑的消耗)。向在配備有攪拌棒的20mL小瓶中的在800μL ACN中的N-(3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)丙-2-炔基-1-銨2,2,2-三氟乙酸鹽(17.1mg,0.05mmol)的溶液中，添加120.0mg(0.870mmol)K₂CO₃和95.2mg(0.48mmol)S-3-溴代丙基乙酰硫。在50℃油浴中加熱5小時(shí)的同時(shí)將混合物攪拌。將兩個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)混合物合并，過濾和蒸發(fā)。獲得粗產(chǎn)物(168.4mg)，與己烷一起共蒸發(fā)3次，以除去ACN。使用硅膠柱(1.25g)來純化粗產(chǎn)物。收率14％(2.6mg)。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)由NMR和LC-MS證明。

3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙烷-1-硫醇的合成

將在200μL ACN中的S-3-((3-(2,4-二氯苯氧基)丙基)(丙-2-炔基)氨基)丙基乙酰硫(1.17mg,3.10μmol)的溶液添加到配備有攪拌棒的20mL小瓶中，蒸發(fā)，然后與MeOH一起共蒸發(fā)3次，以除去ACN。向小瓶中添加MeOH/HCl(200μL)，然后通過85℃油浴將小瓶加熱6小時(shí)。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，依次通過MeOH共蒸發(fā)3次和ACN共蒸發(fā)3次，然后用于下一步驟而無需進(jìn)一步純化。

MHI 148-氯吉林綴合物的合成

向配備有攪拌棒的20mL小瓶中添加MHI-148(4.7mg,6.2mmol)和EDC(1.5-2.4mg,7.8-12mmol)，然后添加1.5mg DMAP(12mmol)。添加ACN(400μL)以制造溶液。在室溫將之前步驟的反應(yīng)混合物逐滴轉(zhuǎn)移到具有200μL ACN的小瓶。通過HPLC(GRACE Davison Apollo C₈ 5u柱,250mm×10mm)將反應(yīng)混合物純化。

實(shí)施例1

MAO A在人膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)

結(jié)果顯示，在GBM組織中存在MAO A的顯著染色，而在非腫瘤腦組織中未觀察到可檢測(cè)的染色(圖2A)?；谛螒B(tài)學(xué)，GBM的染色似乎與腫瘤細(xì)胞相關(guān)。如免疫染色所示(圖2B)，敏感(U251S)和抗性(U251R)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞都表達(dá)MAO A。然后使用血清素作為底物(圖2C)分析這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的MAO活性(5)，并且顯示這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)MAO A催化活性；與之相反，正常對(duì)照星形膠質(zhì)細(xì)胞不展現(xiàn)可檢測(cè)的MAO A活性。

MAO A活性也在小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL26中測(cè)得；這些腫瘤細(xì)胞顯示高水平的MAO A活性?；谠撔畔?，選擇GL26細(xì)胞來評(píng)價(jià)不同MAO抑制劑的抑制作用。氯吉林和苯乙肼抑制MAO A活性，分別具有10^-9和10^-11M的低IC₅₀。反苯環(huán)丙胺和丙炔苯丙胺抑制MAO A活性，IC₅₀值為低的微摩爾范圍。該抑制特征確認(rèn)了MAO A確實(shí)存在于GL26細(xì)胞中?？傊@些結(jié)果顯示MAO A存在于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人GBM組織中，但是它們?cè)谡Ｐ切文z質(zhì)細(xì)胞中不可檢測(cè)。

實(shí)施例II

MAO A抑制劑氯吉林和NMI(近紅外染料綴合的MAO抑制劑)減少TMZ敏感性和抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、活力和遷移

MAO A抑制劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中都靶向MAO A表達(dá)。為了將MAOA特異性靶向腦癌細(xì)胞，將MAO抑制劑氯吉林綴合至近紅外(NIR)腫瘤特異性染料MHI-148，以產(chǎn)生新型藥物NMI(圖5A)，其優(yōu)先聚集在癌化病變中。NMI已經(jīng)根據(jù)圖1中所示的步驟合成。

為了評(píng)價(jià)NMI在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的細(xì)胞攝入，使用共聚焦顯微鏡。與載劑相比，用NMI(1μM,5μM)處理的腫瘤細(xì)胞的圖像分析顯示顯著的劑量依賴性攝入。如通過線粒體特異性染料MitoTracker Green所確定(圖5B)，該化合物在U251R細(xì)胞中快速累積并定位至線粒體。在GL26小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(其具有豐富的MAO A活性)上進(jìn)行NMI對(duì)MAO A活性的抑制作用。結(jié)果顯示NMI抑制MAO A，具有低的微摩爾IC₅₀₍圖3)。這些結(jié)果表明NMI特異性靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體，并在體外抑制MAO A活性。

腫瘤復(fù)發(fā)歸因于TMZ抗性的發(fā)展。因此，使用抗性(U251R)膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)查氯吉林和NMI對(duì)TMZ-抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性。使用TMZ-敏感性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251S)用于比較。對(duì)于TMZ-敏感性細(xì)胞U251S，氯吉林(10μM)自身將集落形成減少20％(p<0.05)，TMZ(15μM)將之減少60％。氯吉林和TMZ的組合處理將其進(jìn)一步減少65％(圖4A)。這些結(jié)果表明氯吉林體外增加藥物敏感性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251S)中的TMZ敏感性。

在U251S細(xì)胞中NMI單獨(dú)以5μM和10μM處理分別將集落形成減少60％和90％(圖5C(a))。組合NMI(5μM)和TMZ(15μM)將集落形成減少90％(圖5C(a))。這些結(jié)果表明NMI體外增加藥物敏感性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251S)中的TMZ敏感性。

然后評(píng)價(jià)NMI對(duì)藥物抗性人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251R的影響。如所預(yù)期的，TMZ(μM)無影響。NMI展現(xiàn)集落形成的濃度依賴性降低，在1μM、5μM和10μM時(shí)分別降低20％、40％和80％。10μM的NMI使TMZ-抗性細(xì)胞對(duì)TMZ處理敏感化，展現(xiàn)出增殖降低大于95％。(圖5C(b))。這些結(jié)果顯示NMI使TMZ-抗性細(xì)胞對(duì)TMZ敏感化。氯吉林自身或者其與TMZ組合不顯示任何效果(圖4B)。

還使用MTS檢驗(yàn)(圖5D(a)和(b))研究氯吉林和NMI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用；結(jié)果證明，用氯吉林進(jìn)行處理在U251S和U251R中分別產(chǎn)生50％抑制濃度(IC₅₀)為約175μM和136μM的劑量響應(yīng)曲線。相比之下，用NMI處理在兩個(gè)細(xì)胞系中都以IC₅₀值為5μM抑制細(xì)胞活力，表明與氯吉林相比NMI的功效高30～35倍。因此，NMI單獨(dú)或者其與TMZ組合在藥物抗性膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞中是有效的細(xì)胞毒性劑。

GBM是高度侵襲性的腫瘤；因此影響腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的化學(xué)治療劑會(huì)是臨床上非常有用的。使用遷移檢驗(yàn)研究NMI抑制U251S和U251R細(xì)胞遷移的能力。將細(xì)胞用氯吉林(10μM)和NMI(1μM、5μM和10μM)處理20～24小時(shí)，這取決于在載劑處理細(xì)胞中完成匯合(closure)所需的時(shí)間。氯吉林自身對(duì)于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移速率無影響(圖4C&D)。但是，NMI(5μM)在敏感性細(xì)胞(U251S)中將遷移速率降低50％，在抗性細(xì)胞(U251R)中將遷移速率降低30％(圖5E(a)和(b))。這些結(jié)果表明，與氯吉林相比，NMI在降低U251TMZ-抗性細(xì)胞的遷移速率方面更有效。

實(shí)施例III

遺傳修飾的MAO A敲除(MAO A KO)動(dòng)物展示增加的存活。

使用IHC確定MAO A在人GBM組織中表達(dá)(圖2B)，相比之下MAO A在非腫瘤腦中的較少染色。這些結(jié)果顯示，MAO A在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GBM組織中的較高表達(dá)表明MAO A參與GBM進(jìn)展。

為了檢查MAO A對(duì)腫瘤生長的體內(nèi)作用，在C57bl/6小鼠中在MAO A敲除小鼠(KO)中分析腫瘤進(jìn)展。在這些研究中使用源自C57bl/6小鼠的小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(GL26)，因?yàn)檫@些腫瘤細(xì)胞顯示高水平的MAO A活性(圖2C)。將腫瘤細(xì)胞用熒光素酶標(biāo)記，并顱內(nèi)植入MAO A KO和WT C57bl/6小鼠中；在第10天進(jìn)行熒光素酶成像。結(jié)果顯示腫瘤負(fù)擔(dān)減少75％(圖6A和B)，存活增加17.6％(3天)(圖6C)。

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定WT和AKO小鼠的腫瘤和周圍組織中的MAO A活性。結(jié)果表明與WT相比在腫瘤組織中MAO A KO具有低MAO A活性。令人感興趣的是，這些結(jié)果表明在KO小鼠中無MAO A活性的周圍組織可能影響腫瘤組織中MAO A的活性(圖6D)。在MAO A KO和WT小鼠中皮下植入GL26腫瘤細(xì)胞獲得相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，腫瘤和腫瘤微環(huán)境中MAO A的減少降低GBM進(jìn)展。

實(shí)施例IV

在皮下異種移植物膠質(zhì)瘤小鼠模型中氯吉林抑制人腫瘤細(xì)胞的生長。

為了確定氯吉林對(duì)腫瘤進(jìn)展的體內(nèi)影響，將U251S熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞皮下植入裸小鼠中；當(dāng)腫瘤通過成像可視化時(shí)，每天施用溶解在無菌水中的氯吉林(30mg/kg)21天。載劑對(duì)照組用水處理。治療和對(duì)照組中的所有小鼠顯示的重量損失不超過10％的類似體重變化，表明該治療方案是良好耐受的。從第28天開始，氯吉林治療組顯示腫瘤生長的一致性降低，在第41天降低70％(圖7A&7B)。這些結(jié)果證明MAO A的抑制減少體內(nèi)腫瘤生長。

實(shí)施例V

在顱內(nèi)小鼠腫瘤模型中單獨(dú)的氯吉林和單獨(dú)的NMI，或者它們與TMZ的組合增加存活響應(yīng)

為了確定MAO A抑制劑是否在體內(nèi)也對(duì)TMZ-抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞有效，將人TMZ-抗性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251R)顱內(nèi)植入，并在7天后成像。然后將小鼠分組(n＝4)并用以下處理：氯吉林、NMI、TMZ以及/或者TMZ和氯吉林或NMI的組合。每天皮下施用藥物21天，除了TMZ之外，其以1mg/kg的劑量通過口服灌胃法施用10天。氯吉林以10mg/kg注射，NMI以5mg/kg注射。體內(nèi)NIR成像顯示NMI在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的特異性攝入和累積。在每天皮下注射NMI(5mg/kg/天)10天后，記錄熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞的生物發(fā)光以及NMI的熒光。將生物發(fā)光與NIR圖像重疊顯示，NMI穿過血腦屏障，并且定位至腫瘤位置，在整個(gè)體內(nèi)不具有可檢測(cè)的分布(圖8A)。在第7、14、21、24天將動(dòng)物成像(圖8B)。28天(植入后7天和治療21天)后，停止治療，記錄腫瘤生長和存活(圖8C和8D)。存活數(shù)據(jù)顯示，載劑組中的所有動(dòng)物在第28天時(shí)死亡，來自TMZ和氯吉林組的動(dòng)物分別在第34天(p<0.05)和第36天(p<0.05)死亡。氯吉林與TMZ的組合治療從腫瘤植入之日起將存活增加至40天(p<0.05)。用NMI單獨(dú)治療展示將存活增加12天(死于第41天，p<0.005)；TMZ和NMI的組合治療將存活進(jìn)一步增加16天(死于第44天，p<0.005)；顯示這些數(shù)據(jù)的Kaplan–Meier繪圖在圖4D中提出。所有p值均相對(duì)于載劑報(bào)道。在試驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)時(shí)間，在治療和對(duì)照組中的所有小鼠顯示相似的不超過10％的體重變化。這些數(shù)據(jù)表明，用單獨(dú)的氯吉林或NMI，或者NMI與TMZ組合進(jìn)行治療能夠延緩腫瘤生長并且顯著地增加存活時(shí)間。

實(shí)施例VI

在體內(nèi)氯吉林和NMI降低增殖和血管生成，并且誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答

為了鑒定氯吉林或NMI處理動(dòng)物的存活增加的潛在機(jī)制，死亡時(shí)收獲腫瘤組織，并且分析數(shù)種特征，包括細(xì)胞增殖、微血管密度(MVD)、炎性細(xì)胞浸潤和生長因子的分泌。為了確定細(xì)胞增殖是否受MAO A抑制劑影響，將腫瘤組織用Ki67染色。結(jié)果顯示，與載劑處理動(dòng)物(圖9A,第1行)相比，在氯吉林和NMI(p<0.05,圖9C)處理動(dòng)物中陽性細(xì)胞(紅色沉淀)的數(shù)量降低。分析組織的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)，其是負(fù)責(zé)胞外基質(zhì)的破壞并由此增加腫瘤侵襲的酶(13,14)。結(jié)果(圖9A，第2行)表明與氯吉林或NMI處理動(dòng)物相比，在載劑組織有更多針對(duì)MMP9的染色陽性。這些數(shù)據(jù)表明MAO抑制劑減少腫瘤細(xì)胞侵襲。通過針對(duì)CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)染色來評(píng)估對(duì)于腫瘤進(jìn)展而言關(guān)鍵的血管生成和血管密度(10)。結(jié)果(圖9A，第3行；圖9C)顯示氯吉林(p<0.01)和NMI(p<0.05)處理動(dòng)物具有顯著降低的MVD。這些數(shù)據(jù)證明，氯吉林和NMI顯著地降低增殖、侵襲和腫瘤中的血管生成，由此有助于增加存活。

先天性免疫響應(yīng)對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤生長有重要貢獻(xiàn)(11)。因此，分析經(jīng)處理動(dòng)物的腫瘤中的炎性細(xì)胞。將腫瘤組織用F4/80(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)染色(圖9B，第1行)。結(jié)果顯示，與載劑對(duì)照相比，在MAO抑制劑處理動(dòng)物中的巨噬細(xì)胞顯著增加(p<0.01,圖9C)。這些數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞可能參與延遲的腫瘤進(jìn)展。炎性細(xì)胞因子負(fù)責(zé)有助于巨噬細(xì)胞的多數(shù)活性。為了確定在腫瘤組織中檢測(cè)出的巨噬細(xì)胞是否是促炎性的，針對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)-α(強(qiáng)效的促炎性生長因子)將組織試樣染色。染色結(jié)果證明在來自MAO抑制劑處理的動(dòng)物的腫瘤中，TNF-α陽性群增加(圖9B，第2行)。這些結(jié)果表明，MAO抑制劑上調(diào)促炎響應(yīng)，其與巨噬細(xì)胞存在和腫瘤進(jìn)展降低相關(guān)(12)。轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ(免疫抑制性生長因子)不受MAO A抑制劑治療影響(圖9B，第3行)；TGFβ染色在所有三個(gè)組中相似。腫瘤組織的該染色數(shù)據(jù)提供令人信服的證據(jù)證明氯吉林和NMI抑制劑改變腫瘤環(huán)境從而減少體內(nèi)腫瘤生長。

實(shí)施例VII

在顱內(nèi)小鼠模型中MAO A抑制劑增加動(dòng)物存活

檢查了其它MAO A抑制劑對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響。將經(jīng)標(biāo)記的小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(GL26)顱內(nèi)植入，并在植入后7天成像。隨后將動(dòng)物隨機(jī)分組(n＝5)；藥物治療組是TMZ(1mg/kg)、苯乙肼(10mg/kg)、苯乙肼+TMZ、和嗎氯貝胺(10mg/kg)。苯乙肼是MAO A和MAO B抑制劑，嗎氯貝胺是MAO A特異性可逆抑制劑。除TMZ之外的所有藥物每天皮下施用；TMZ口服施用。存活數(shù)據(jù)顯示，所有載劑處理動(dòng)物在12天內(nèi)死亡；TMZ和苯乙肼(p<0.05)組在14天內(nèi)死亡。苯乙肼+TMZ(p<0.005)和嗎氯貝胺(p<0.005)處理小鼠分別死于第14和16天。顯示這些數(shù)據(jù)的Kaplan–Meier繪圖在圖10A中提出。所有p值均相對(duì)于載劑報(bào)道。這些結(jié)果顯示，苯乙肼與TMZ組合和嗎氯貝胺增加存活。

為了更好地理解MAO活性在腫瘤進(jìn)展中的作用，收獲腦組織，并且對(duì)MAO A活性進(jìn)行分析。苯乙肼和嗎氯貝胺分別展現(xiàn)酶活性降低87％和62％(圖10B)。這些結(jié)果表明，存活增加與MAO A活性降低相關(guān)。

實(shí)施例VIII

支持本發(fā)明的預(yù)料不到性質(zhì)的進(jìn)一步結(jié)果

圖18公開的數(shù)據(jù)表明前列腺癌和膠質(zhì)瘤具有MAO A活性并且可以用MAO I和MHI-氯吉林治療，而胰腺癌和淋巴瘤不具有MAO A活性，因此不能用氯吉林和MHI-氯吉林治療。

圖19證明氯吉林和MHI-氯吉林都誘導(dǎo)干細(xì)胞細(xì)胞毒性，并且MHI-氯吉林比氯吉林自身更有效。

雖然本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)具體示例性實(shí)施方式和實(shí)施例進(jìn)行了描述，但應(yīng)意識(shí)到在此公開的實(shí)施方式僅是說明性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種改進(jìn)和變化，而無需背離由所附權(quán)利要求提出的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。

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各自引用以下參考文獻(xiàn)，并且在此并入其全部內(nèi)容。

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