本發(fā)明涉及生物技術(shù)、生物科學(xué)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別地涉及對(duì)分子進(jìn)行修飾以便改善其藥物代謝動(dòng)力學(xué)，其中增加其在血液中的半衰期和其生物學(xué)活性。現(xiàn)有技術(shù)近年來(lái)，生物分子用于在人類(lèi)中的治療用途的使用有所增加，這主要是由于：(1)發(fā)現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)和肽分子，(2)對(duì)于體內(nèi)作用機(jī)制有了更好的理解，(3)改善了蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)和肽的合成，和(4)改善了制劑或分子修飾技術(shù)，其使得能夠改善藥效動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。在藥物的修飾釋放領(lǐng)域中的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)使得能夠引入許多改變可注射藥物的釋放的系統(tǒng)，以便改善治療劑的藥效動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。新的藥物釋放系統(tǒng)可以通過(guò)制劑的變化(例如，持續(xù)釋放產(chǎn)品或脂質(zhì)體)或者通過(guò)向藥物分子進(jìn)行添加(例如，PEG化，其僅為將藥物共價(jià)結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)分子)來(lái)產(chǎn)生。新的釋放形式導(dǎo)致半衰期的增加、副作用的減少、藥物功效的提高以及患者的更好的生活質(zhì)量。持續(xù)釋放系統(tǒng)以受控的且預(yù)定的方式釋放藥物，并且尤其適合于其中避免在血漿中的濃度大幅波動(dòng)是重要的那些藥物。由于保護(hù)了對(duì)于降解敏感的蛋白質(zhì)以及經(jīng)延長(zhǎng)或經(jīng)修飾的釋放，已經(jīng)廣泛地研究了通過(guò)使用生物可降解的微球來(lái)進(jìn)行的分子的全身性釋放(Sinha，V.R.和Trehan，A.(2003).Biodegradablemicrospheresasproteindelivery，J.ControlledRelease，90(3)：261-280)。PEG化提供了一種用于修飾治療性蛋白質(zhì)以使生物分子的許多藥理學(xué)限制最小化的方法。例如，在血液中的半衰期由于數(shù)個(gè)原因而增加，其中包括：聚合物殘基可以阻止蛋白酶的攻擊以及該藥物被免疫系統(tǒng)識(shí)別，以及所述綴合物的相對(duì)于天然蛋白質(zhì)而言顯著更大的流體動(dòng)力學(xué)體積使得腎濾過(guò)明顯地減少。雖然在許多情況下蛋白質(zhì)的體外生物學(xué)活性受到PEG化影響，但是在血液中的壽命的重大增加使得其治療作用是更有效的(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。PEG化的另一個(gè)益處為物理穩(wěn)定性的增加，這是由于其在空間上阻斷由疏水相互作用所誘導(dǎo)的降解途徑，并且產(chǎn)生減少在所述蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性中所牽涉的分子間相互作用的非特異性空間障礙。物理穩(wěn)定性的增加使得能夠獲得更穩(wěn)定的制劑(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。由于第二代經(jīng)活化的PEG的出現(xiàn)，能夠擁有允許更有選擇性的PEG化的基團(tuán)(例如：優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的N-末端的醛基團(tuán))和支化結(jié)構(gòu)(RobertsM.J.，BentleyM.D.，HarrisJ.M.(2002)ChemistryforpeptideandproteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：459-476)。所開(kāi)發(fā)出的支化PEG包括具有兩個(gè)分枝的單官能PEG(專(zhuān)利號(hào)US5,932,462)、具有四個(gè)分枝的四官能PEG和具有八個(gè)分枝的八官能PEG。關(guān)于治療性蛋白質(zhì)的綴合，更有用的經(jīng)活化的PEG為單官能PEG，因?yàn)槠浔苊庠摰鞍踪|(zhì)與該P(yáng)EG聚合物之間的交聯(lián)。支化PEG還具有傘型效應(yīng)，其允許更好的對(duì)于蛋白質(zhì)表面的保護(hù)。具有兩個(gè)分枝的單官能PEG使得能夠獲得與干擾素α-2a的綴合物，其顯示出在臨床上比天然蛋白質(zhì)更好的結(jié)果(RajenderReddyK.，ModiM.W.，PedderS.(2002).Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitisC.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：571-586)。存在有關(guān)于許多其中應(yīng)用了不同的修飾釋放技術(shù)的蛋白質(zhì)的報(bào)道，其中包括重組的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)(rhEPO)。EPO為具有165個(gè)氨基酸的糖蛋白。取決于其糖基化程度，通過(guò)使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(縮寫(xiě)為SDS-PAGE)而估計(jì)的它的分子量在27kDa和39kDa之間變化(Mikaye，T.等人，(1977).PurificationofHumanerythropoietin.J.Biol.Chem.252：5558-5564)。在調(diào)查研究中已證明，通過(guò)撤除低氧刺激，在血液中EPO的信使核糖核酸(mRNA)快速減少，其中可能在3小時(shí)時(shí)無(wú)法檢測(cè)，這表明其半衰期是短的(Lacombe，C.等人，(1988)Peritubularcellsarethesiteoferythropoietinsynthesisinthemurinehypoxickidney.J.Clin.Invest.81：620-623；Koury，S.T.等人，(1989)Quantitationoferythropoietinproducingcellsinkidneysofmicebyinsituhybridation：Correlationwithhematocrit，renalerythropoietinmRNAandserumerythropoietinconcentration.Blood74：645-651)。據(jù)估計(jì)，EPO在血漿中的半衰期在4小時(shí)和13小時(shí)之間變化；當(dāng)與其他具有治療用途的分子相比較時(shí)，該時(shí)間是非常短的。這使得需要有規(guī)律地使用該激素的患者必須頻繁地注射以維持接近正常水平的紅細(xì)胞水平(Spivak，J.L.1992.Themechanismofactionoferythropoietin：Erythroidcellresponse.J.W.Fisher(Ed.)BiochemicalPharmaeologyofBloodandBlood-FormingOrgans.Springer-VerlagBerlin.HandbookofExperimentalPharmacology.101：49-114；Jelkmann，W.(1986).RenalErythropoietin：PropertiesandProduction.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.104：139-205)。為了增加rhEPO的半衰期，對(duì)該分子進(jìn)行了突變以增加N-糖基化位點(diǎn)(Burke，Paul(2003).Deviceforthesustainedreleaseofaggregation-stabilized，biologicallyactiveagent.美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030133979)，它被包囊在微球(MorlockM.等人，(1998).ErythropoietinloadedmicrospherespreparedfrombiodegradableLPLG-PEO-LPLGtriblockcopolymers：proteinstabilizationandin-vitroreleaseproperties.JControlRelease4，56(1-3)：105-115)和脂質(zhì)體(MoriyaH.等人，(1997).Pharmacokineticandpharmacologicalprofilesoffreeandliposomalrecombinanthumanerythropoietinafterintravenousandsubcutaneousadministrationsinrats.PharmRes.14(11)：1621-1628)中，并且已經(jīng)報(bào)道獲得了rhEPO的二聚體，這旨在增加其生物學(xué)活性(BrunoD.等人，(2001).Dimericerythropoietinfusionproteinwithenhancederythropoieticactivityinvitroandinvivo.Blood，Vol.97，No.12，3776-3782)。在臨床中具有最多結(jié)果的修飾之一為rhEPO與聚合物的化學(xué)綴合(JollingK.等人，(2005).Mixed-EffectsModellingoftheInterspeciesPharmacokineticScalingofPegylatedHumanErythropoietin.EurJPharmSci；24：465-475)。在該經(jīng)PEG化的rhEPO的開(kāi)發(fā)中，所遇到的困難為綴合過(guò)程的低的產(chǎn)率，這是由于形成了單PEG化種類(lèi)和二PEG化種類(lèi)，其中后者是該過(guò)程的污染物。由于所有上面所陳述的內(nèi)容，仍然令人感興趣的是獲得新的EPO與聚合物的綴合物，其提供相對(duì)于未修飾的分子而言的治療優(yōu)勢(shì)。發(fā)明描述本發(fā)明通過(guò)提供這樣的綴合物而解決了上面所提出的問(wèn)題，所述綴合物包含促紅細(xì)胞生成素(EPO)和含有兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。以這種方式，本發(fā)明提供了包含單官能支化PEG結(jié)構(gòu)的綴合物，所述單官能支化PEG結(jié)構(gòu)具有與由Papadimitriou所使用的(專(zhuān)利號(hào)US7,202,208)類(lèi)似的分子大小，但其采用具有二條有著不同分子量的鏈的PEG結(jié)構(gòu)。出人意料地，該備選方案給該藥物提供了新的優(yōu)勢(shì)。在本發(fā)明的綴合物中，所述具有兩個(gè)分枝的PEG的聚合物結(jié)構(gòu)的總分子量在27kDa和37kDa之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，mPEG1的分子量為12kDa，并且mPEG2的分子量為20kDa。使用具有所示分子量的不對(duì)稱(chēng)的支化PEG鏈(而非線(xiàn)性PEG鏈)使得能夠減少二PEG化的污染物的形成，并且出人意料地，顯著地增加該分子的半衰期以及其物理化學(xué)穩(wěn)定性。另一個(gè)預(yù)料不到的結(jié)果是，所述具有該不對(duì)稱(chēng)支化單官能PEG的經(jīng)PEG化的分子的生物學(xué)活性保持完整。在文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛報(bào)道了具有PEG化的生物分子的生物學(xué)活性的喪失(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003).Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。具有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的單官能PEG通過(guò)將兩個(gè)具有不同分子大小的線(xiàn)性PEG鏈結(jié)合在核心上來(lái)獲得。其他作者使用了類(lèi)似的過(guò)程，其中取得良好的結(jié)果(專(zhuān)利號(hào)US5,932,462)。為了能夠?qū)蓚€(gè)線(xiàn)性PEG鏈結(jié)合至核心，需要它們具有活性基團(tuán)。該基團(tuán)可以從在現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種基團(tuán)中選擇。例如，該活性基團(tuán)尤其可以為：琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、琥珀酰亞胺基碳酸酯、對(duì)-硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亞胺基丙酸酯、琥珀酰亞胺基丁酸酯。在本發(fā)明中優(yōu)選的線(xiàn)性PEG為用琥珀酰亞胺基碳酸酯進(jìn)行活化的那種。這是由于兩個(gè)主要原因：a)它與氨基基團(tuán)之間的反應(yīng)的良好的產(chǎn)率，和b)獲得該經(jīng)官能化的PEG的工藝過(guò)程是容易的。獲得該經(jīng)官能化的PEG的工藝過(guò)程是在該
技術(shù)領(lǐng)域：
中工作的人員所已知的(MironT.，WilchekM.(1993).ASimplifiedMethodforthePreparationofSuceinimidylCarbonatePolyethyleneGlycolforCouplingtoProteins.BioconjugateChem.4：568-569)。一旦該線(xiàn)性PEG被活化，則隨后使其與被選擇作為核心的分子進(jìn)行反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核心為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸，因?yàn)樗巧锵嗳菪苑肿?，其具有可以用于稍后進(jìn)行活化的兩個(gè)游離的氨基基團(tuán)和一個(gè)羧基基團(tuán)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將EPO綴合至如下所示的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)：在一個(gè)特別的實(shí)施例中，在形成為該綴合物的一部分的所述聚合物結(jié)構(gòu)中，mPEG1的分子量為12kDa且mPEG2的分子量為20kDa，或者mPEG1的分子量為20kDa且mPEG2的分子量為12kDa。該具有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的衍生物可以通過(guò)使用色譜法來(lái)進(jìn)行純化，然后用不同的反應(yīng)性基團(tuán)來(lái)進(jìn)行活化以用于與生物分子進(jìn)行綴合。任何用于活化其他PEG結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)均可以用于在本發(fā)明中所描述的不對(duì)稱(chēng)支化PEG。這些官能團(tuán)的例子尤其為：N-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基碳酸酯、不同類(lèi)型的醛、馬來(lái)酰亞胺。另一種類(lèi)型的允許該結(jié)構(gòu)結(jié)合至蛋白質(zhì)的官能團(tuán)為螯合基團(tuán)，例如次氮基三乙酸酯，其可以借助于過(guò)渡金屬而綴合至存在于肽主鏈中的組氨酸。待使用的反應(yīng)性基團(tuán)的選擇取決于想要在其上結(jié)合PEG的蛋白質(zhì)的殘基。在由Huang所提交的專(zhuān)利申請(qǐng)(EP1479711A1)的實(shí)施例中，顯示了支化的PEG結(jié)構(gòu)，其在所述分枝的每一個(gè)中具有不同的分子量；但是所述分枝的分子大小比本發(fā)明的小。在專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朎P1479711A1中，發(fā)明人提出，相對(duì)于未修飾的藥物的生物學(xué)活性而言，該綴合物的生物學(xué)活性降低。然而，在本發(fā)明中，出人意料地，EPO與總分子量在27kDa和37kDa之間的具有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的單官能PEG的綴合物的生物學(xué)活性與未修飾的EPO的生物學(xué)活性類(lèi)似。另一方面，在本發(fā)明中證明，根據(jù)由Huang所提交的專(zhuān)利申請(qǐng)的具有兩個(gè)有著較低分子量的分枝的PEG結(jié)構(gòu)的半衰期短于本發(fā)明的EPO與具有兩個(gè)分別為12kDa和20kDa的分枝的PEG的綴合物的半衰期。在本發(fā)明中所獲得的該結(jié)果是出人意料的。用該包含不對(duì)稱(chēng)聚合物結(jié)構(gòu)(PEG2，32K)的綴合物，實(shí)現(xiàn)了不限制生物學(xué)活性的所述分子的空間分布，通過(guò)減少多PEG化產(chǎn)物的形成而改善了綴合反應(yīng)，并且顯著地改善了藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。這使得能夠減少在需要治療的人中的治療劑量。在本發(fā)明中用于獲得具有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的PEG結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)原料為12kDa的mPEG(12KPEG)和20kDa的mPEG(20KPEG)。這些mPEG的分子量具有由制造商所確立的范圍，因?yàn)镻EG為多分散聚合物。例如，根據(jù)制造商之一的說(shuō)明書(shū)，多分散性應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.1％。在該情況下，由該制造商所報(bào)告的分子量范圍對(duì)于12KPEG將為12.0±1.2kDa；20KPEG的分子量范圍將為20.0±2.0kDa。為了測(cè)定每批PEG起始材料之間的分子量的該差異是否影響藥物代謝動(dòng)力學(xué)的結(jié)果，用具有相應(yīng)于所述說(shuō)明書(shū)的極值的分子量的PEG批次來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例11)。取分子量為11kDa的12KPEG和分子量為18kDa的20KPEG用于形成EPO與總分子量為29kDa的具有兩個(gè)分枝的PEG結(jié)構(gòu)的綴合物(PEG2，29K-EPO)。還取分子量為13kDa的12KPEG和分子量為22kDa的20KPEG用于形成EPO與總分子量為35kDa的具有兩個(gè)分枝的PEG結(jié)構(gòu)的綴合物(PEG2，35K-EPO)。結(jié)果顯示，當(dāng)使用不同起始批次的12KPEG和20KPEG時(shí)，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)是類(lèi)似的。因此，由PEG2，29K-EPO和PEG2，35K-EPO的結(jié)構(gòu)所形成的綴合物被認(rèn)為與由具有由制造商所指明的理論重量的結(jié)構(gòu)所形成的那些，即EPO與具有兩個(gè)分枝(其中之一為12kDa，和另一為20kDa)的PEG的綴合物(PEG2，32K-EPO)，基本上相同。蛋白質(zhì)與經(jīng)活化的PEG的綴合在合適的緩沖液中進(jìn)行。除了其他因素外，緩沖劑的特征尤其取決于該聚合物的官能團(tuán)以及綴合的目的。例如，如果希望通過(guò)游離的氨基基團(tuán)與被官能化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的PEG進(jìn)行綴合，那么可以根據(jù)綴合反應(yīng)的pH在一定程度上預(yù)測(cè)綴合位點(diǎn)。在8.0和9.0之間的pH有利于通過(guò)賴(lài)氨酸的ε-氨基基團(tuán)來(lái)進(jìn)行綴合。一旦獲得綴合物，就使用各種技術(shù)來(lái)對(duì)其進(jìn)行表征。分析所述綴合物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于經(jīng)純化的綴合物的可能的最完全的表征。例如，所述綴合物的濃度通常可以通過(guò)紫外光譜學(xué)(在280nm處的吸光度)來(lái)測(cè)定，因?yàn)镻EG殘基實(shí)際上不影響該蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)。經(jīng)純化的產(chǎn)物的純度優(yōu)選地通過(guò)SDS-PAGE來(lái)測(cè)定，因?yàn)樯V法例如凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)于相應(yīng)于目的綴合物的信號(hào)和相應(yīng)于污染物的信號(hào)的區(qū)分很差。其他物理化學(xué)特性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用操作程序來(lái)進(jìn)行研究。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素(EPO)”是指保持了其生物學(xué)活性的EPO分子的任何變體；例如，截短的分子。所述EPO可以通過(guò)重組脫氧核糖核酸(DNA)技術(shù)來(lái)獲得，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表達(dá)和純化系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含rhEPO。本發(fā)明的目標(biāo)綴合物還包含通過(guò)上面所描述的方法在經(jīng)由現(xiàn)有技術(shù)的任何操作程序(例如，氨基酸置換)進(jìn)行修飾后而獲得的任何EPO變體。本發(fā)明的目標(biāo)還為藥物組合物，其包含任何在本文中所公開(kāi)的PEG-EPO綴合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面為用于獲得經(jīng)PEG化的EPO的方法，其特征在于，將所述蛋白質(zhì)綴合至含有兩個(gè)mPEG分枝的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。通過(guò)本發(fā)明的方法，引起在施用了所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物的血液中所述EPO的半衰期增加，如果與未與PEG進(jìn)行綴合的EPO的半衰期相比較。因此，本發(fā)明提供了用于改善所述蛋白質(zhì)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，以便減少施用給有此需要的受試者的劑量。在本發(fā)明的背景下，EPO的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改善是指所述蛋白質(zhì)的半衰期和/或平均停留時(shí)間的增加。以該方式，本發(fā)明公開(kāi)了化學(xué)修飾EPO分子的方法，以便增加所述分子的半衰期，其特征在于，將所述蛋白質(zhì)綴合至含有兩個(gè)mPEG分枝的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在所述不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)中所述mPEG分枝之一的分子量為12kDa，和另一mPEG分枝的分子量為20kDa。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，綴合至EPO的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)如下所示：在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在綴合至EPO的不對(duì)稱(chēng)支化聚合物結(jié)構(gòu)中，mPEG1的分子量為12kDa且mPEG2的分子量為20kDa，或者mPEG1的分子量為20kDa且mPEG2的分子量為12kDa。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，所述EPO為rhEPO。附圖簡(jiǎn)述圖1.EPO與PEG2，32K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物的具有雙重染色(考馬斯亮藍(lán)和碘)的SDS-PAGE的結(jié)果。樣品1相應(yīng)于EPO的陽(yáng)性對(duì)照，和樣品2相應(yīng)于EPO與PEG2，32K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物。圖2.EPO與PEG2，40K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物的具有雙重染色(考馬斯亮藍(lán)和碘)的SDS-PAGE的結(jié)果。樣品1相應(yīng)于EPO的陽(yáng)性對(duì)照，和樣品2相應(yīng)于EPO與PEG2，40K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物。圖3.通過(guò)使用凝膠過(guò)濾色譜法而獲得的用于評(píng)價(jià)不同PEG-EPO綴合物的色譜圖。圖4.通過(guò)紅細(xì)胞正常的小鼠的方法測(cè)定的天然的EPO和單PEG化的EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。圖5.通過(guò)胰蛋白酶降解測(cè)定法而獲得的關(guān)于PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和未修飾的EPO的結(jié)果。呈現(xiàn)了通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行追蹤的降解動(dòng)力學(xué)。圖6.通過(guò)紅細(xì)胞正常的小鼠的方法測(cè)定的不同PEG-EPO綴合物和未修飾的EPO的生物學(xué)活性。實(shí)施方式的詳細(xì)描述/實(shí)施例實(shí)施例1.被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的PEG的獲得mPEG20K-OH的活化反應(yīng)將50g未活化的分子量為20kDa的mPEG(mPEG20K-OH)在450mL甲苯中共沸干燥3小時(shí)。在該時(shí)間過(guò)后，抽取出200mL溶劑，并讓溶液冷卻直至達(dá)到環(huán)境溫度。然后，添加60mL無(wú)水二氯甲烷(DCM)作為助溶劑。稱(chēng)取4.9g二琥珀酰亞胺基碳酸酯，并將其溶解在40mL二甲基甲酰胺中。將上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的燒瓶中。稱(chēng)取2.5g二甲氨基吡啶，并將其溶解在20mLDCM中。將上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的燒瓶中，并開(kāi)始攪拌。讓其在環(huán)境溫度下反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)使用玻璃纖維膜來(lái)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行過(guò)濾，以去除固體產(chǎn)物。用1.5L無(wú)水乙醚使濾液沉淀，并在真空中進(jìn)行過(guò)濾。在真空中收集沉淀物，在高度真空中干燥4小時(shí)，并貯存于-20℃。實(shí)現(xiàn)以PEG琥珀酰亞胺基碳酸酯(PEG20K-SC)的形式回收了初始的mPEG20K-OH質(zhì)量的96％，其中活化度為96.0±0.8％。mPEG12K-OH的活化反應(yīng)依照用于mPEG20K-OH的活化反應(yīng)的相同操作程序，但在本情況下，使用未活化的分子量為12kDa的mPEG(mPEG12K-OH)作為起始原料。L-賴(lài)氨酸與PEG20K-SC和PEG12K-SC的反應(yīng)稱(chēng)取9.1gL-賴(lài)氨酸，并將其溶解在30mL的0.1M硼酸溶液(pH8.0)中。添加20g的PEG20K-SC和15mL的L-賴(lài)氨酸在硼酸中的溶液。使溶液在攪拌下保持12小時(shí)。然后，用300mL蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物，并且用鹽酸溶液將混合物的pH調(diào)整至3.5。將混合物轉(zhuǎn)移至其中加入了100mLDCM的分液漏斗中。手動(dòng)攪拌，并抽取出下面的相(有機(jī)相)。共進(jìn)行5次萃取。將20g硫酸鈉加入到包含有機(jī)相的燒瓶中，并手動(dòng)攪拌直至該相完全清澈。通過(guò)使用玻璃纖維膜，在真空中進(jìn)行過(guò)濾。盡最大可能地，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮。添加500mL乙醚并手動(dòng)攪拌，以使產(chǎn)物沉淀。在真空中進(jìn)行過(guò)濾，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將產(chǎn)物(20K的單PEG化的L-賴(lài)氨酸)在真空中干燥1小時(shí)。在第二個(gè)反應(yīng)步驟中，將9gPEG12K-SC添加至15g20K的單PEG化的L-賴(lài)氨酸。將反應(yīng)物溶解在215mLDCM中，并添加0.14mL三乙胺。通過(guò)使用玻璃纖維膜，將反應(yīng)混合物在真空中進(jìn)行過(guò)濾。盡最大可能地，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮。添加300mL乙醚并手動(dòng)攪拌2分鐘，以使產(chǎn)物沉淀。在真空中進(jìn)行過(guò)濾，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將所獲得的產(chǎn)物(具有兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的PEG，所述不對(duì)稱(chēng)分枝之一為12kDa，和另一為20kDa(PEG2，32K-COOH))在真空中干燥1小時(shí)。該過(guò)程的總產(chǎn)率大于70％。PEG2，32K-COOH的純化在高度為80cm的DEAE-Sepharose柱中進(jìn)行PEG2，32K-COOH的純化，并且采用40mL/分鐘的體積流量。預(yù)先用4.5L的0.2M氫氧化鈉溶液對(duì)凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。將柱用50mM硼酸溶液(pH9.0)進(jìn)行平衡。然后，將柱用5L蒸餾水進(jìn)行洗滌。施加溶解在水中的PEG2，32K-COOH樣品，直至達(dá)到40μS/cm的電導(dǎo)率，其大于水的電導(dǎo)率。在施加樣品之后，將柱用3L純化水進(jìn)行洗滌。用5L的10mM氯化鈉溶液來(lái)進(jìn)行樣品的洗脫。收集500mL的級(jí)分。然后，用3L的1M氯化鈉溶液使柱再生。該過(guò)程的總回收率大于90％，其中純度大于95％。被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的支化PEG(PEG2，32K-NHS)的獲得將1gPEG2，32K-COOH溶解在DCM中。添加0.01gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.02g二環(huán)己基碳二亞胺。使反應(yīng)混合物在攪拌下保持12小時(shí)。然后，用5mLDCM進(jìn)行稀釋?zhuān)⑶彝ㄟ^(guò)玻璃纖維膜進(jìn)行過(guò)濾。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮，并添加400mL乙醚以使產(chǎn)物沉淀。將混合物在真空中進(jìn)行過(guò)濾，并收集固體產(chǎn)物(PEG2，32K-NHS)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該固體產(chǎn)物在真空中干燥1小時(shí)。達(dá)到大于95％的活化度，以及大于90％的初始聚合物質(zhì)量的回收。實(shí)施例2.與PEG2，32K-NHS相綴合的EPO的獲得綴合反應(yīng)將6克PEG2，32K-NHS添加到在50mM硼酸鹽溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始濃度包含1grhEPO的溶液中。使反應(yīng)物體系在4℃下保持2小時(shí)，其中緩慢地進(jìn)行攪拌。通過(guò)用50mM硼酸(pH8.0)進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度來(lái)終止反應(yīng)。如在圖1中所顯示的，通過(guò)經(jīng)SDS-PAGE而獲得的凝膠的光密度分析法來(lái)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)率?？偦厥章蚀笥?0％，其中多PEG化的產(chǎn)物小于3％。單PEG化的EPO的純化為了將rhEPO與PEG的綴合反應(yīng)的產(chǎn)物分開(kāi)，即將單PEG化的EPO與游離的EPO和二PEG化的EPO分開(kāi)，設(shè)計(jì)了通過(guò)陰離子交換色譜法的純化方案。通過(guò)使用高度為12cm的裝填有Q-Sepharose的柱來(lái)進(jìn)行該分開(kāi)過(guò)程。預(yù)先用22mL的0.2M氫氧化鈉溶液對(duì)凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。通過(guò)33mL純化水，隨后通過(guò)33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在該平衡溶液中進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的濃度的、來(lái)自綴合反應(yīng)的樣品。通過(guò)使用氯化鈉濃度從0.175M至0.5M漸增的相同的平衡緩沖液來(lái)順次進(jìn)行包含EPO與PEG2，32K-NHS的綴合物(PEG2，32K-EPO)的樣品的洗脫。體積流量為1.2mL/分鐘，和負(fù)載量為0.58mg蛋白質(zhì)/mL凝膠。該過(guò)程的回收率為40％的單PEG化的EPO，和純度為97％。實(shí)施例3.被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的支化PEG(PEG2，40K-NHS)的獲得為了獲得PEG2，40K-NHS，依照在實(shí)施例1中所描述的操作程序，但在與賴(lài)氨酸的反應(yīng)的第二個(gè)步驟中使用PEG20K-SC。實(shí)現(xiàn)大于50％的總產(chǎn)率，其中活化度大于90％。實(shí)施例4.與PEG2，40K-NHS相綴合的EPO的獲得綴合反應(yīng)將6克PEG2，40K-NHS添加到在50mM硼酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始濃度包含1grhEPO的溶液中。使反應(yīng)物體系在4℃下保持2小時(shí)，其中緩慢地進(jìn)行攪拌。通過(guò)用50mM硼酸(pH8.0)進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度來(lái)終止反應(yīng)。如在圖2中所顯示的，通過(guò)經(jīng)SDS-PAGE而獲得的凝膠的光密度分析法來(lái)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)率。總回收率大于40％，其中多PEG化的產(chǎn)物小于1％。單PEG化的EPO的純化為了將EPO與PEG的綴合反應(yīng)的產(chǎn)物分開(kāi)，即將單PEG化的EPO與游離的EPO和二PEG化的EPO分開(kāi)，設(shè)計(jì)了通過(guò)陰離子交換色譜法的純化方案。通過(guò)使用高度為12cm的裝填有Q-Sepharose的柱來(lái)進(jìn)行該分開(kāi)過(guò)程。預(yù)先用22mL的0.2M氫氧化鈉溶液對(duì)凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。通過(guò)33mL蒸餾水，隨后通過(guò)33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在該平衡溶液中進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的濃度的、來(lái)自綴合反應(yīng)的樣品。通過(guò)使用氯化鈉濃度從0.175M至0.5M漸增的相同的平衡緩沖液來(lái)順次進(jìn)行包含EPO與PEG2，40K-NHS的綴合物(PEG2，40K-EPO)的樣品的洗脫。體積流量為1.2mL/分鐘，和負(fù)載量為0.58mg蛋白質(zhì)/mL凝膠。該過(guò)程的回收率為40％，并且獲得97％的純度。實(shí)施例5.經(jīng)PEG化的EPO的物理化學(xué)表征綴合物濃度的測(cè)定通過(guò)在分光光度計(jì)中測(cè)量在280nm處的吸光度來(lái)進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)使用0.743的關(guān)于EPO的摩爾消光系數(shù)來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算。通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法來(lái)進(jìn)行表征通過(guò)使用高效液相色譜法(HPLC)的泵和具有226nm濾波器的紫外線(xiàn)檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行色譜法分開(kāi)。施加質(zhì)量為100μg蛋白質(zhì)。用Superdex-200基質(zhì)來(lái)進(jìn)行所述色譜法。分析經(jīng)PEG化的EPO的兩種變化形式(PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO)和未修飾的EPO。在圖3中觀察到在對(duì)于每種變化形式所估計(jì)的分子量和所得的保留時(shí)間之間存在的對(duì)應(yīng)關(guān)系。以較短的保留時(shí)間洗脫出PEG2，40K-EPO綴合物，因?yàn)槠渚哂休^大的分子大??；隨后洗脫出PEG2，32K-EPO綴合物；和最后洗脫出未修飾的EPO。實(shí)施例6.PEG2，32K-EPO綴合物的生物學(xué)表征通過(guò)紅細(xì)胞正常的小鼠的方法來(lái)進(jìn)行經(jīng)PEG化的EPO的效力的測(cè)定。按照三只動(dòng)物/組，用0.2mL的不同稀釋度(300、450和600IU/mL，其相當(dāng)于3、4.5和6μg/小鼠)的PEG2，40K-EPO和PEG2，32K-EPO樣品、參考材料(作為陽(yáng)性對(duì)照)以及陰性對(duì)照(僅稀釋劑)通過(guò)皮下途徑對(duì)處女雌性B6D2F1系小鼠(16-18g)進(jìn)行接種。另外還使用兩只動(dòng)物，向其接種50mM硼酸鹽緩沖溶液(pH8.0)，以便評(píng)價(jià)其毒性。在接種72小時(shí)后，通過(guò)眶后途徑抽取每只動(dòng)物的血液樣品，并放置在包含4μL肝素鈉(5000IU)的小瓶中。取40μL外周血，并將其與120μL由0.3mM亞甲藍(lán)、1.29mM檸檬酸鈉、5mL生理鹽水和10mL蒸餾水構(gòu)成的溶液相混合，并且將其在37℃的水浴中溫育1小時(shí)。之后，通過(guò)用由0.08mMEDTA四鈉、0.15mM氯化銨和9.98mM碳酸氫鈉構(gòu)成的裂解溶液進(jìn)行處理來(lái)實(shí)施選擇性溶血6分鐘。通過(guò)用生理鹽水進(jìn)行過(guò)度稀釋來(lái)終止紅細(xì)胞裂解，并在Neubauer計(jì)數(shù)池中以目視方式對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)使用模式的和未知形式的平行線(xiàn)的隨機(jī)設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和效力計(jì)算，以在α＝0.05的顯著性水平下檢測(cè)線(xiàn)性和平行性的有效性。所獲得的值必須符合歐洲藥典的規(guī)定，所述歐洲藥典規(guī)定，基于該假設(shè)而計(jì)算出的效力的關(guān)聯(lián)性值(以百分比表示)不應(yīng)當(dāng)?shù)陀?0％，也不應(yīng)當(dāng)高于125％，并且所計(jì)算出的效力的置信界限應(yīng)當(dāng)位于在64％和156％之間的范圍內(nèi)。在圖4中觀察到從網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中直接獲得的數(shù)據(jù)的圖，在所述實(shí)驗(yàn)中施用漸增的量(以“IU的效力”測(cè)量的)的EPO。應(yīng)用用于比較平均值的Tukey-Kramer統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以便分析體內(nèi)活性值。所述數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，在所述值之間沒(méi)有顯著差異(P＜0.05)。在經(jīng)PEG化的EPO和用作陽(yáng)性對(duì)照的未修飾的EPO之間的生物學(xué)活性的差異位于該測(cè)定法的變化范圍之內(nèi)(±50％)。重要的是強(qiáng)調(diào)，用于實(shí)施該測(cè)定法的劑量為300、450和600IU的效力。這些是已被確立用于檢測(cè)天然EPO的生物學(xué)活性的劑量，然而使用Amgen公司的產(chǎn)品(MirceraTM，其為綴合至分子量為30kDa的線(xiàn)性聚合物結(jié)構(gòu)的EPO(PEG1，30K-EPO))來(lái)進(jìn)行的測(cè)定法所需要的最小劑量為6000IU的效力。但是，在本發(fā)明中所進(jìn)行的測(cè)定法之中，以低20倍的劑量，檢測(cè)到了經(jīng)PEG化的EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。實(shí)施例7.對(duì)于蛋白酶降解的抗性為了驗(yàn)證不同PEG-EPO分子對(duì)于蛋白酶降解的抗性，進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，在該體外實(shí)驗(yàn)中用胰蛋白酶消化經(jīng)PEG化的EPO和天然蛋白質(zhì)(作為對(duì)照)。EPO的所述兩種經(jīng)PEG化的變化形式均顯示出比天然EPO更強(qiáng)的對(duì)于蛋白酶降解的抗性。在圖5中顯示了用作對(duì)照的EPO以及兩種經(jīng)PEG化的變化形式即PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO的降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果?？梢杂^察到，經(jīng)PEG化的EPO的所述兩種變化形式呈現(xiàn)出比天然EPO更強(qiáng)的對(duì)于蛋白酶降解的抗性。實(shí)施例8.PEG2，32K-EPO綴合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)通過(guò)比較未修飾的EPO、PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和PEG1，30K-EPO綴合物來(lái)進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。使用重2kg的新西蘭品系的兔子。半衰期(t1/2)、曲線(xiàn)下面積(縮寫(xiě)為AUC)和平均停留時(shí)間(縮寫(xiě)為MRT)的結(jié)果顯示在表1中。表1.EPO、PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和PEG1，30K-EPO綴合物的比較藥物代謝動(dòng)力學(xué)?？梢钥闯?，所有經(jīng)PEG化的EPO具有比未修飾的EPO更長(zhǎng)的半衰期。PEG2，32K-EPO綴合物的半衰期比用PEG1，30K-EPO所獲得的半衰期長(zhǎng)得多(2.4倍)?？紤]到這兩種綴合物具有非常相似的分子大小，該結(jié)果是出人意料的。該不對(duì)稱(chēng)支化分子還具有比PEG2，40K-EPO綴合物(其也是支化的并且具有更大的分子量)更長(zhǎng)的半衰期，這也未預(yù)料到。實(shí)施例9.不同EPO綴合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)結(jié)果的比較通過(guò)比較下列綴合物來(lái)進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究：PEG2，32K-EPO綴合物，其具有一個(gè)分子量為12kDa的分枝和另一個(gè)分子量為20kDa的分枝；綴合至不對(duì)稱(chēng)PEG結(jié)構(gòu)的EPO，所述不對(duì)稱(chēng)PEG結(jié)構(gòu)具有一個(gè)分子量為5kDa的分枝和另一個(gè)分子量為7kDa的分枝(PEG2，12K-EPO)；EPO與對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的綴合物，所述對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)各為7kDa的分枝(PEG2，14K-EPO)；以及EPO與分子量為12kDa的線(xiàn)性PEG的綴合物(PEG1，12K-EPO)。為了實(shí)施該研究，以與PEG2，32K-EPO綴合物類(lèi)似的方式來(lái)獲得PEG2，12K-EPO綴合物，但使用具有更低分子量的mPEG。以與PEG2，40K-EPO綴合物類(lèi)似的方式來(lái)獲得PEG2，14K-EPO綴合物，但使用具有更低分子量的mPEG。通過(guò)如下方式來(lái)獲得PEG1.12K-EPO綴合物：如在實(shí)施例1的開(kāi)始部分所描述的，活化分子量為12kDa的mPEG；隨后，如在實(shí)施例2中所描述的，進(jìn)行與rhEPO的綴合。為了進(jìn)行比較，使用重2kg的新西蘭品系的兔子。結(jié)果顯示在表2中。本發(fā)明的綴合物(PEG2，32K-EPO)顯示出具有比其余所分析的綴合物更長(zhǎng)的半衰期。表2.不同EPO綴合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。實(shí)施例10.不同EPO綴合物的生物學(xué)活性的比較以與在實(shí)施例6中所描述的類(lèi)似的方式來(lái)測(cè)量所述綴合物的生物學(xué)活性。比較對(duì)于下列綴合物所獲得的結(jié)果：(1)PEG2，32K-EPO；(2)PEG2，12K-EPO；(3)PEG2，14K-EPO；和(4)PEG1，12K-EPO。作為對(duì)照，使用未修飾的rhEPO。在圖6中可以觀察到，本發(fā)明的綴合物(PEG2，32K-EPO)保持了未修飾的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，這與其余所分析的綴合物不同，在其余所分析的綴合物中生物學(xué)活性在PEG化發(fā)生時(shí)降低。實(shí)施例11.藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，其中使用形成PEG2，32K-EPO綴合物的兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)分枝的mPEG的分子量極限由于PEG是多分散的并且用于形成不對(duì)稱(chēng)PEG結(jié)構(gòu)即PEG2，32K的起始材料可能與12kDa和20kDa的分子量的理論值有變化，因而進(jìn)行EPO與分子量為29kDa(PEG2，29K-EPO)和35kDa(PEG2，35K-EPO)的不對(duì)稱(chēng)PEG結(jié)構(gòu)的綴合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。這些是形成為本發(fā)明的EPO綴合物的一部分的PEG的總分子量的界限。以與PEG2，32K-EPO綴合物相同的方式來(lái)獲得PEG2，29K-EPO綴合物和PEG2，35K-EPO綴合物。使用重2kg的新西蘭品系的兔子。結(jié)果顯示在表3中。正如可以看出的，在所研究的綴合物變化形式中，在藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面沒(méi)有差異。表3.有著具有不同分子量的PEG的綴合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的結(jié)果。參數(shù)PEG2，32K-EPOPEG2，29K-EPOPEG2，35K-EPOt1/2(小時(shí))165.93+/-74.41159.24+/-19.84174.01+/-25.66AUC(IU/mL·小時(shí))83.59+/-44.6379.76+/-21.6785.55+/-34.75MRT(小時(shí))238.94+/-12.05243.42+/-18.54235.34+/-12.43當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3