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一種具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制備方法與流程

文檔序號(hào):11966082閱讀:來源:國(guó)知局
一種具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制備方法與流程

技術(shù)特征:
1.一種膠原蛋白海綿的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:1)取動(dòng)物跟腱,清洗、冰凍切片后除脂、清洗,備用;2)取步驟1)的跟腱片,分散于水中,再加入胰蛋白酶處理并清洗;3)取步驟2)的跟腱片加酸浸泡后分散,再在分散液中加入胃蛋白酶,反應(yīng)后收集酶解液;4)在步驟3)中獲得的酶解液中加入硫酸鈉水溶液,攪拌后靜置,取沉淀產(chǎn)物離心后收集沉淀物A;5)取步驟4)中獲得的沉淀物A,加水重溶并調(diào)節(jié)pH,靜置,將再次沉淀產(chǎn)物重復(fù)進(jìn)行離心清洗后收集沉淀物B;6)將步驟5)中獲得的沉淀物B,加酸溶解后純化,純化完成后收集液體;7)將6)中收集到的純化后膠原蛋白液體進(jìn)行透析,透析后脫水濃縮,獲得膠原原液,再將膠原原液進(jìn)行冷凍干燥,即得膠原蛋白海綿;所述除脂是將跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗;所述除脂液為碳酸氫鈉與乙醇水溶液的混合液;步驟2)中,所述跟腱片與水的質(zhì)液比為1:10-100;所述胰蛋白酶與水加入的質(zhì)液比為25-250:100000;所述胰蛋白酶處理?xiàng)l件為:反應(yīng)溫度:35-40℃,反應(yīng)時(shí)間:0.5-2h;步驟4)中,所述硫酸鈉水溶液與酶解液加入的體積之比為1:1-4;所述攪拌條件為:攪拌時(shí)間為1-10min,攪拌器轉(zhuǎn)速:1~10rpm/min;所述靜置時(shí)間為12-24h;步驟6)中,所述酸為弱酸稀溶液,所述弱酸稀溶液為乙酸水溶液,其摩爾濃度為0.01-0.3M;所述純化采用Akata蛋白純化系統(tǒng),在Superdex-200凝膠柱中純化;步驟7)中,所述脫水濃縮的條件為:透析外液:分子量十萬以上的聚乙二醇水溶液,透析外液濃度:0.1-10%,脫水濃縮時(shí)間:12-20h,濃縮后膠原蛋白液體的濃度:5-20mg/mL;所述冷凍干燥采用凍干機(jī)凍干方式進(jìn)行。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白海綿的制備方法,其特征在于,步驟1)中,所述冰凍的條件為:冰凍溫度:-20至-40℃,冰凍時(shí)間≥12h,所述動(dòng)物跟腱避免反復(fù)凍融;所述除脂是將跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗;所述跟腱片與除脂液加入的質(zhì)液比為1:10-25。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白海綿的制備方法,其特征在于,步驟3)中,所述跟腱片與酸加入的質(zhì)液比為1:50-150;所述酸選自乙酸、鹽酸中的任意一種;所述酸浸泡時(shí)間為0.5-4h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白海綿的制備方法,其特征在于,步驟3)中,所述跟腱片與胃蛋白酶加入的質(zhì)量之比為20-200:1;所述酶解的條件為:反應(yīng)溫度:0-20℃,反應(yīng)時(shí)間:24-96h,攪拌周期:每隔1h攪拌5-15min,攪拌速率:50~100rpm/min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白海綿的制備方法,其特征在于,步驟7)中,所述透析依次分別采用透析外液、純化水進(jìn)行透析;所述透析外液為磷酸氫二鈉水溶液;所述透析條件為:透析溫度:2-8℃,透析外液的透析次數(shù):1次,透析外液的一次透析時(shí)間:12-24h,純化水的透析次數(shù):2-5次,純化水的一次透析時(shí)間:3-9h。6.一種膠原蛋白海綿,由權(quán)利要求1-5任一所述的膠原蛋白海綿的制備方法制得。
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