本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗結(jié)核桿菌作用的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.etArn.)為馬鞭草科紫珠屬植物，產(chǎn)自我國海南、廣西、廣東，印度、越南、馬來西亞等地也有分布，其根、葉可入藥，具有收斂止血、消炎解毒等功效。近兩年對裸花紫珠的抗結(jié)核桿菌的作用有少量研究，如《裸花紫珠對臨床分離結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用》(中華中醫(yī)藥雜志，2014,29(11)：3630-3632)、《裸花紫珠收斂止血及對結(jié)核分枝桿菌的抗菌作用研究》(湖南師范大學(xué)，2014年碩士論文)，初步研究了對裸花紫珠干浸膏對結(jié)核分枝桿菌的作用，但尚未明晰其物質(zhì)基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種裸花紫珠藥物組合物，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種藥物組合物，其特征在于含有重量份為1份裸花紫珠石油醚萃取有效部位B和3-5份裸花紫珠提取物C，其中所述裸花紫珠石油醚萃取有效部位B的制備方法為：(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90％-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，過濾后所得濾液濃縮成浸膏A，(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中，加入石油醚萃取，除去溶劑，濃縮，干燥得到石油醚萃取有效部位B，所述裸花紫珠提取物C的制備方法為：(1)取裸花紫珠切碎，加水提取，提取溫度85℃-95℃，提取液濾過，濾液濃縮至相對密度1.05－1.15(60℃)，(2)向步驟(1)所得濾液中加乙醇至含醇量40％-50％，靜置10-14小時，濾過，(3)向步驟(2)所得濾液中加乙醇至含醇量60％-70％，靜置10-14小時，濾過，濾液濃縮，干燥得裸花紫珠提取物C。作為上述方案的優(yōu)選，所述石油醚萃取有效部位B的制備方法步驟(1)為：取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加熱回流提取3次，得提取液，過濾后所得濾液減壓濃縮得浸膏A。作為上述方案的優(yōu)選，所述裸花紫珠提取物C的制備方法步驟(1)為：取裸花紫珠切 碎，加6-8倍量水提取1-3次，提取溫度85℃-95℃，提取液濾過，濾液濃縮至相對密度1.05－1.15(60℃)；所述裸花紫珠提取物C的制備方法步驟(2)中含醇量為45％；所述裸花紫珠提取物C的制備方法步驟(3)中含醇量為65％。本發(fā)明藥物組合物中所述裸花紫珠提取物C的重量份優(yōu)選為4份。本發(fā)明的另一個目的是提供所述藥物組合物在制備具有抗結(jié)核桿菌作用藥物中的用途和在制備治療結(jié)核病藥物中的用途。本發(fā)明所述的藥物組合物，可以含有有效量的上述任一項所述藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料，制備成藥物制劑。裸花紫珠的化學(xué)成分有黃酮及苷類、三萜及苷類、二萜、苯乙醇苷類、酚酸類、甾體類、揮發(fā)油等，目前已從中分離得到100余個化合物。然而現(xiàn)有的對裸花紫珠成分與抗結(jié)核分枝桿菌作用的研究相對薄弱，已有研究結(jié)論推測主要作用成分是黃酮類。眾所周知，中藥成分復(fù)雜，一般通過多組分、多靶點、整體協(xié)同作用發(fā)揮抗結(jié)核作用，多重耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)使得控制結(jié)核病仍然是一個急需解決的全球性難題。發(fā)明人在前期研究基礎(chǔ)上，對抗結(jié)核桿菌活性成分群做了深入的研究，通過采用溶劑(水、甲醇、乙醇、丙酮等)提取，結(jié)合大孔樹脂或活性碳或陶瓷膜或萃取等等分離方法，聯(lián)合質(zhì)譜、液相等分析技術(shù)，最終得出本發(fā)明的技術(shù)方案，其實驗效果與對比例、陽性對照藥等對比見具體實施方式。低溫提取(低溫動態(tài)提取)后所得濾液加入不同濃度的乙醇進行分層次的醇沉獲得的裸花紫珠提取物，其抗結(jié)核作用顯著提升，一方面采用低溫動態(tài)提取，盡可能保留容易被氧化的黃酮類、苯乙醇苷類等有效物質(zhì)群，另一方面不同濃度的乙醇醇沉有利于更充分的去除裸花紫珠粗提物中粘液質(zhì)、多糖、色素等非活性成分和可能對抗結(jié)核作用產(chǎn)生拮抗作用的物質(zhì)，進一步富集和純化有效活性成分，提高單位提取物的生物活性。本發(fā)明的有益效果：(1)獲得抗結(jié)核分枝桿菌作用較強的藥物組合物，(2)制備方法操作簡便。具體實施方式以下將進一步通過舉例詳細說明，發(fā)明人通過不同制備工藝得到相應(yīng)的實施例和對比例，并測得實施例、對比例、陽性對照藥的MIC值，詳見表1。發(fā)明人通過如下工藝制得實施例：1、裸花紫珠石油醚萃取有效部位B的制備：(1)取裸花紫珠藥材，粉碎成粗粉，加入90％-95％乙醇加熱回流提取1-3次，得提取液，過濾后所得濾液濃縮成浸膏A，(2)步驟(1)所得浸膏A均勻分散于水中，加入石油醚萃取，除去溶劑，濃縮，干燥得到石油醚萃取有效部位B，2、裸花紫珠提取物C的制備：(1)取裸花紫珠切碎，加6-8倍水提取1-3次，提取溫度85℃-95℃，提取液濾過，濾液濃縮至相對密度1.05－1.15(60℃)，(2)向步驟(1)所得濾液中加乙醇至含醇量40％-50％，靜置10-14小時，濾過，(3)向步驟(2)所得濾液中加乙醇至含醇量60％-70％，靜置10-14小時，濾過，濾液濃縮，干燥得裸花紫珠提取物C。3、將裸花紫珠石油醚萃取有效部位B與裸花紫珠提取物C以1:3-5的重量比混合即得。各實施例、對比例、陽性對照藥對抑制結(jié)核分枝桿菌的實驗方法如下：1.材料1.1菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MTBH37Rv(湖南省結(jié)核病防治所提供)1.2培養(yǎng)基及抗菌藥物基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良羅氏培養(yǎng)基；抗菌藥物為各實施例、對比例、陽性對照藥。1.3試劑：Middlebrook7H9肉湯OADC增菌液購自BDDifco公司；陽性對照藥異煙肼、利福平、乙胺丁醇購自sigma公司；DMSO去離子水、吐溫-80購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為化學(xué)分析純；96微孔板(Corning，美國)；Alamarblue(Serotec，英國)；7H9(Difco，美國)；OADC(BD，美國)。2.實驗和方法2.1菌落的準(zhǔn)備：依照改良羅氏法配制出基礎(chǔ)液將結(jié)核桿菌接種培養(yǎng)；2.2原液濃度的配制：取約16g本發(fā)明所得藥物組合物用DMSO溶解，充分溶解后以0.22um濾膜過濾，除菌，備用。對比例所得樣品同此法配制。異煙肼5g,乙胺丁醇5g分別用水充分溶解后以0.22um濾膜過濾，除菌，備用。利福平5g用DMSO溶解后以0.22um濾膜過濾，除菌，備用。2.3實驗將200ul的無菌去離子水加入到所有無菌的96孔板的外周界的孔，以盡量減少孵育期間在測試孔中的介質(zhì)的蒸發(fā)。以無菌Middlebrook7H9肉湯稀釋裸花紫珠原液和其他三種陽性藥物4倍最大期望最終檢測濃度(裸花紫珠為32mg/ml，異煙肼為1.6μg/ml，乙胺丁醇為40μg/ml，利福平為8μg/ml)加入檢測孔中100μl，然后對藥物進行2倍系列稀釋分別稀釋至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64。每個藥物部分濃度重復(fù)2孔。選取羅氏培養(yǎng)基上生長2-3周的新鮮菌落，用玻璃珠磨菌，稀釋至1個麥?zhǔn)蠞舛?McFarland1,相當(dāng)于(3-6) ×107CFU/ml」，再以1：25稀釋后向微孔板加入100ul菌液，菌液的終濃度約為106CFU/ml。每個菌株設(shè)1個不含藥物的生長對照孔(陽性對照)和只含有7H9不含藥物和菌液的無菌對照孔(陰性對照)，各菌株平行進行3次測試。96孔板于37℃孵育5d后在生長對照孔加入20ulAlamarblue和50ulTweerr80(5％)的混合液，37℃孵育24h，如果顏色從藍色變?yōu)榉凵瑒t在各實驗藥物孔內(nèi)加入上述量的Alamarblue和Tweerr80混合液，37℃孵育24h記錄各孔的顏色，藍色孔為無生長，粉紅色孔為有生長。如出現(xiàn)紫紅色孔，則繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24h，如果不變?yōu)榉奂t色且其相連的藍色孔仍為藍色，則記錄為有生長。MIC定義為阻止顏色變化(從藍色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度。上述方法平行試驗,應(yīng)用相同的菌液和濃度以及藥物在同日內(nèi)操作,進行3次。報告的MIC結(jié)果為2次及2次以上相同的MIC值。實驗結(jié)果見下表1。表1各實施例、空白對照組、陽性對照藥組的止血作用的實驗方法如下：將90只健康昆明小白鼠隨機分9組(每組10只，雌雄各半)，分為實驗組(實施例1-7)、陽性對照藥組(云南白藥組)、空白對照組，連續(xù)給藥7天，實驗組和陽性對照藥組的劑量0.5g/kg，灌胃體積0.2mL/10g體重，空白對照組給予等體積生理鹽水，最后一天給藥45min后，用剪尾法測定小鼠出血時間(BT)，用毛細玻管法測凝血時間(CT)，評價藥物止血效果。實驗結(jié)果見下表2。表2本發(fā)明組合物對小鼠止血作用的影響(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，N＝10)組別劑量BT(秒)CT(秒)空白對照組20.56±2.3266.91±4.85實施例10.5g/kg14.27±1.35**45.08±3.16**實施例20.5g/kg14.02±1.57**46.12±3.41**實施例30.5g/kg13.81±1.31**43.59±4.07**實施例40.5g/kg13.55±1.42**43.18±3.76**實施例50.5g/kg13.28±1.25**42.71±3.93**實施例60.5g/kg14.09±1.44**43.46±3.25**實施例70.5g/kg13.62±1.18**42.15±3.52**云南白藥組0.5g/kg13.98±2.03**46.15±3.87***P<0.05，**P<0.01與空白對照組比較。表1表明本發(fā)明所得藥物組合物的抗結(jié)核桿菌作用較強，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有顯著差異，可用于制備抗結(jié)核桿菌作用的藥物中，而且所得藥物組合物具有收斂止血作用(見表2)，可充分發(fā)揮收斂止血和抗結(jié)核桿菌的綜合作用，用于治療結(jié)核病。當(dāng)前第1頁1 2 3