本發(fā)明涉及超分子組裝和三維有序結(jié)構(gòu)材料制備領(lǐng)域。更具體地，涉及一種宏觀超分子組裝的三維有序組織工程支架及制備。

背景技術(shù)：
三維有序結(jié)構(gòu)的可控制備在光子晶體、增強(qiáng)材料以及光電器件等多種領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注與深入研究。目前，該領(lǐng)域的研究工作大多關(guān)注納米尺度的構(gòu)筑基元，而對(duì)十幾微米以上至毫米尺度的構(gòu)筑基元研究較少，其原因在于該尺寸區(qū)間的三維有序結(jié)構(gòu)制備相對(duì)困難：對(duì)于傳統(tǒng)加工而言該尺寸太小難以進(jìn)行精細(xì)操作，對(duì)于新興的微納加工技術(shù)而言，該尺寸則太大導(dǎo)致工藝繁復(fù)、耗時(shí)漫長，不具有實(shí)際可操作性。然而，十微米至一厘米的三維有序結(jié)構(gòu)對(duì)于組織工程支架、長波光子晶體領(lǐng)域具有重要研究意義。特別地，大多數(shù)細(xì)胞都處于這一尺寸范圍之內(nèi)，當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也從傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)推進(jìn)到了三維細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)筑與細(xì)胞尺寸相比擬的三維支架結(jié)構(gòu)可以為細(xì)胞生長提更加接近生物體內(nèi)環(huán)境的支架材料。因此，發(fā)展十微米至一厘米尺寸三維有序結(jié)構(gòu)的制備方法，可以為細(xì)胞生長提供合適的支架并對(duì)促進(jìn)組織工程研究產(chǎn)生重要意義。迄今為止，由于制備上的困難，十微米至一厘米尺寸三維有序結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道較少。例如，基于3D打印技術(shù)的三維生物打印(3Dbioprinting)方法可以通過噴墨打印、微擠出和激光輔助打印等方法，將含有細(xì)胞、生物相容性材料和生長因子等細(xì)胞所需培養(yǎng)環(huán)境的液體混合物作為“墨水”，利用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)構(gòu)建的三維模型，進(jìn)行組織或器官的打印和再造。然而，該方法的問題在于其分辨率有限，難以構(gòu)建精細(xì)支架材料；由于打印裝置的特殊性，該方法對(duì)設(shè)備、細(xì)胞、生物材料和生長因子都有一定的限制與要求，從而制約了其在組織工程領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，發(fā)展一種具有普適性的、溫和的、生物相容的三維有序結(jié)構(gòu)制備方法仍然是一大挑戰(zhàn)。超分子組裝，作為一種溫和的、生物相容的而且不依賴于特殊設(shè)備的方法，可以較好地解決上述問題。自提出以來，傳統(tǒng)超分子組裝的研究通常著眼于分子層次或納米尺度的構(gòu)筑基元。為了將自組裝體系從分子層次拓展到微米及以上尺度，Whitesides等人提出了“全尺度自組裝”的概念，并應(yīng)用界面自由能最小化原理在油水界面實(shí)現(xiàn)了毫米構(gòu)筑基元的組裝，形成有序陣列，該陣列通過后續(xù)的固化操作可以得到不依賴于界面而存在的結(jié)構(gòu)。為了去除對(duì)界面的依賴，Harada教授組在毫米級(jí)凝膠塊體表面引入環(huán)糊精/偶氮苯超分子官能團(tuán)，可以在簡單的震蕩條件下通過主客體識(shí)別作用實(shí)現(xiàn)凝膠構(gòu)筑基元的超分子組裝并獲得獨(dú)立存在的組裝體；他們利用光照或競(jìng)爭(zhēng)分子實(shí)現(xiàn)對(duì)組裝過程的調(diào)控。同年，申請(qǐng)人的研發(fā)小組報(bào)道了直徑17微米玻璃纖維通過金屬-羧酸間多齒配位作用在基底表面的可控組裝，構(gòu)筑有序圖案。為了進(jìn)一步理解微米以上構(gòu)筑基元的超分子組裝機(jī)理，我們引入了柔性間隔層的概念，可以實(shí)現(xiàn)多種剛性構(gòu)筑基元(PDMS，聚甲基丙烯酸甲酯)的超分子組裝，并證實(shí)其組裝機(jī)理為多重相互作用，從而為非水凝膠體系的宏觀超分子組裝提出了一種設(shè)計(jì)原則。此外，DNA雜交、靜電相互作用等組裝推動(dòng)力被用于微米以上凝膠體系的超分子組裝。這些結(jié)果表明超分子組裝具有自下而上、實(shí)驗(yàn)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，而且超分子化學(xué)中具有豐富的生物相容的分子識(shí)別體系可以用于構(gòu)筑基元的特異性組裝。然而，由于宏觀超分子組裝體的形成過程具有一定的隨機(jī)性，構(gòu)筑基元間存在一些錯(cuò)配現(xiàn)象，因而需要發(fā)展新的方法以實(shí)現(xiàn)宏觀構(gòu)筑基元的規(guī)則、取向性排列，以形成三維有序結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種宏觀超分子組裝的三維有序組織工程支架。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種宏觀超分子組裝制備三維有序組織工程支架的方法。本發(fā)明針對(duì)目前十微米至一厘米尺寸三維有序結(jié)構(gòu)制備方面的困難，以及三維有序結(jié)構(gòu)中定向引入多種生長因子的問題，提出并發(fā)展了一種超分子組裝方法實(shí)現(xiàn)十微米至一厘米三維有序結(jié)構(gòu)的制備，并在特定位點(diǎn)引入特定生長因子。用于構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)的生物相容性構(gòu)筑基元主要通過冰凍切片、微壓印、微加工等方法獲得，其特征形狀、尺寸大小可以在十幾微米至厘米尺寸范圍內(nèi)可調(diào)。在構(gòu)筑基元的制備過程中，水熱法合成的磁性納米粒子通過摻雜混合，以制備具有磁響應(yīng)性構(gòu)筑基元。所制備構(gòu)筑基元的表面修飾有超分子作用或生物識(shí)別作用的官能團(tuán)。十微米至一厘米的三維有序結(jié)構(gòu)的構(gòu)建是通過結(jié)合外磁場(chǎng)對(duì)磁響應(yīng)性構(gòu)筑基元進(jìn)行精確定位以及宏觀超分子組裝進(jìn)行構(gòu)筑基元固定實(shí)現(xiàn)的；在該三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑過程中，所需生長因子可以通過識(shí)別構(gòu)筑基元表面的特異性結(jié)合位點(diǎn)來引入。通過冰凍切片、微壓印、機(jī)械微加工模版澆鑄等方法獲得尺寸在十微米至一厘米的生物相容性構(gòu)筑基元。在構(gòu)筑基元的制備中，通過混合摻雜的方式引入磁性納米粒子以制備十微米至一厘米磁響應(yīng)的生物相容性構(gòu)筑基元。在所制備的構(gòu)筑基元表面通過交替層狀組裝技術(shù)、摻雜混合等方式修飾帶有超分子作用如主客體識(shí)別、靜電、氫鍵、配位的互補(bǔ)官能團(tuán)以及生物識(shí)別作用如生物素/親和素(biotin/avidin)、芽孢桿菌rna酶/芽孢桿菌rna酶抑制劑(barnase/barstar)的互補(bǔ)官能團(tuán)，使得上述互補(bǔ)構(gòu)筑基元可以通過超分子相互作用或生物識(shí)別作用實(shí)現(xiàn)宏觀超分子組裝。進(jìn)而，結(jié)合外磁場(chǎng)對(duì)磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元進(jìn)行精確定位和宏觀超分子組裝對(duì)磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元進(jìn)行固定的方式，自下而上逐步構(gòu)建十微米至一厘米尺寸范圍的三維有序結(jié)構(gòu)，并在構(gòu)筑過程中通過構(gòu)筑基元表面的超分子或生物識(shí)別位點(diǎn)引入生長因子，實(shí)現(xiàn)特定生長因子在三維結(jié)構(gòu)中的可控定位，最終可望用于細(xì)胞誘導(dǎo)分化模版和組織工程支架材料；本發(fā)明引入的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元是指：該構(gòu)筑基元具有良好的生物相容性，而且在外磁場(chǎng)存在的情況下，可以通過磁響應(yīng)方式被外磁場(chǎng)控制，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)和定位。本發(fā)明所述宏觀超分子組裝的三維有序組織工程支架為堆垛狀三維有序結(jié)構(gòu)，所述三維有序結(jié)構(gòu)由多個(gè)在二維方向平行地、周期性有序排列的構(gòu)筑基元構(gòu)成，兩個(gè)相互接觸的構(gòu)筑基元通過各自表面上修飾的官能團(tuán)發(fā)生超分子相互作用而實(shí)現(xiàn)兩個(gè)表面的連接；所述支架的大小為10-5～10-2m。本發(fā)明中的構(gòu)筑基元有序排列是指處于同一平面的構(gòu)筑基元，相互平行且相鄰，構(gòu)筑基元間距在十微米至一毫米的排列。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：1.磁性納米粒子的制備利用水熱法或者共沉淀法制備四氧化三鐵納米粒子。2.微米至毫米級(jí)磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元的制備對(duì)于毫米及以上尺度的生物相容性構(gòu)筑基元，可以通過向傳統(tǒng)機(jī)械加工模版內(nèi)澆鑄液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元溶液成型而實(shí)現(xiàn)批量化生物相容性構(gòu)筑基元制備，具體通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：1)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)，采用機(jī)械加工行業(yè)中的激光雕刻技術(shù)，在板材上鏤刻所需空心圖案的陣列，作為制備生物相容性構(gòu)筑基元的模版。在毫米尺度上對(duì)模版圖案的形狀、尺寸大小均進(jìn)行精確調(diào)控；2)清洗干燥模版后，將其固定于平整玻璃表面，將所制備的磁性納米粒子分散于可交聯(lián)的生物相容性構(gòu)筑基元液體中，最后澆鑄填充至模版的鏤空?qǐng)D案內(nèi)；3)通過機(jī)械夾緊的方式，形成壓板-模版-底板三明治結(jié)構(gòu)，通過加熱、光照等方式固化生物相容性構(gòu)筑基元，脫模得到分立的磁響應(yīng)的生物相容性構(gòu)筑基元。冰凍切片法制備微米尺度磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元1)選取粘度相對(duì)較大的液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元，采用“夾心”方式將分散有磁性納米粒子的可交聯(lián)液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元緊密壓制于壓板與底板之間，生物相容性構(gòu)筑基元厚度通過兩端夾板厚度調(diào)節(jié)。2)通過加熱或光照等方式對(duì)所夾分散有磁性納米粒子的液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元進(jìn)行徹底固化，形成所需厚度的薄膜，脫模得到所需厚度的薄片。3)在顯微鏡下，將薄片裁成長寬均在毫米級(jí)而且長寬比為1：1的薄片。4)用冰凍包埋劑OCT包覆上述薄片，設(shè)定冰凍切片機(jī)步進(jìn)距離，將包埋了的薄片放置在垂直于冰凍切片機(jī)刀口的位置，在步進(jìn)馬達(dá)的控制下進(jìn)行切割，可以批量得到長度為毫米級(jí)，寬度和高度均為微米級(jí)的長條狀磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元。微壓印法制備微米尺度磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元1)用紫外光刻法在硅基底表面制備所需圖形的SU8光刻膠陣列。2)在SU8光刻膠陣列上旋涂PDMS預(yù)聚體及其交聯(lián)劑的混合物，對(duì)上述陣列進(jìn)行復(fù)制，得到相反圖案的空穴陣列，作為微壓印模版。3)將分散有磁性納米粒子的可交聯(lián)液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元滴至上述PDMS模版上，并覆蓋聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片，壓緊。4)將PDMS-生物相容性構(gòu)筑基元液體混合物-PET夾層結(jié)構(gòu)通過納米熱壓儀壓制，以充分填充PDMS模版上空穴陣列，同時(shí)去除溢出空穴和殘留在PDMS模版與PET之間的液體層。5)通過加熱或光照引發(fā)液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元混合物交聯(lián)、固化。揭開PET，由于PET的表面能(～42mN/m)遠(yuǎn)比PDMS模版的表面能(～22mN/m)高，所以揭開PET過程中，所固化的生物相容性構(gòu)筑基元會(huì)粘附于PET上，可以通過剝離和收集得到分立的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元。為了區(qū)分磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元表面修飾的官能團(tuán)，在混合液體中可以摻入少量染料以作區(qū)分。對(duì)于不經(jīng)過步驟4)中納米熱壓儀壓制的情況，由于PDMS模版與PET之間液體層的存在，脫模后只能得到固定在一層薄膜上的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元陣列，而難以得到分立的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元。3.磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元表面修飾超分子或有生物識(shí)別作用的分子，基底表面修飾超分子1)采用接枝反應(yīng)或自由基共聚方式，將超分子或具有生物識(shí)別作用的分子分別接至聚電解質(zhì)上；所述超分子包括超分子給體或超分子受體；所述具有生物識(shí)別作用的分子包括生物識(shí)別給體或生物識(shí)別受體。2)將磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元通過乙醇、去離子水超聲的方式洗凈，配制交替層狀自組裝(LbL)過程所需的聚電解質(zhì)溶液，濃度在0.1-1.0mg/mL范圍。3)為了區(qū)分修飾有不同官能團(tuán)的構(gòu)筑基元，LbL修飾之前，構(gòu)筑基元以染色區(qū)分，例如紅色和綠色。將染有綠色的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元交替循環(huán)浸泡于接枝有超分子給體的a聚電解質(zhì)溶液和b聚電解質(zhì)溶液中，所述b聚電解質(zhì)是可以與a聚電解質(zhì)通過靜電、氫鍵、配位鍵等相互作用進(jìn)行LbL的聚電解質(zhì)，循環(huán)交替浸泡可以在綠色構(gòu)筑基元表面修飾一定厚度的含有該超分子給體的聚電解質(zhì)多層膜。同時(shí)，將染有紅色的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元交替浸泡于接枝有超分子受體的c聚電解質(zhì)溶液和d聚電解質(zhì)溶液中，所述d聚電解質(zhì)是可以與c聚電解質(zhì)通過靜電、氫鍵、配位鍵等相互作用進(jìn)行LbL的聚電解質(zhì)，循環(huán)交替浸泡可以在紅色構(gòu)筑基元表面修飾一定厚度的含有該超分子受體的聚電解質(zhì)多層膜。同樣，接枝有生物識(shí)別分子的聚電解質(zhì)可以通過步驟3)修飾到磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元表面。將磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元換為基底，與上述步驟1)至步驟3)相同，可在基底表面修飾超分子。4.磁誘導(dǎo)修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元構(gòu)筑三維有序結(jié)構(gòu)1)在有一定量水的培養(yǎng)皿中放置修飾有超分子的基底，在水面分散修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；2)用磁鐵或者三維磁操作裝置施加局部磁場(chǎng)，使磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元響應(yīng)外磁場(chǎng)，可以隨著磁場(chǎng)的移動(dòng)或變化而運(yùn)動(dòng)，操作磁場(chǎng)將磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元定位至指定位置；3)緩慢吸水以降低水位，使修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元與修飾有超分子的基底表面充分接觸，達(dá)到分子間作用距離，一段時(shí)間后，該磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元可以通過其表面修飾的超分子給(受)體與修飾有超分子受(給)體的基底通過超分子相互作用固定，即構(gòu)筑基元表面修飾的超分子給(受)體分子和基底表面修飾的超分子受(給)體分子發(fā)生超分子相互作用，該磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元被固定后，將不再受磁場(chǎng)變化的影響；本發(fā)明中所述超分子給受體是指一種超分子相互作用(例如靜電相互作用)涉及的作用雙方。4)重新加水，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)第二個(gè)修飾超分子給(受)體的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元，磁搬運(yùn)至指定位置，即與第一根已固定的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元長條相互平行且端點(diǎn)相互平齊的位置，二者間距可以在十微米至一毫米范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，按照上述步驟3)繼續(xù)定位和固定，可以在基底上構(gòu)筑所需要的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元圖案，形成第一層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；5)類似步驟3)和4),用磁場(chǎng)誘導(dǎo)修飾有超分子給(受)體的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元運(yùn)動(dòng)，磁搬運(yùn)至第一層已組裝的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元上方，使該修飾有超分子給(受)體的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元通過超分子相互作用固定在第一層已組裝的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元之上，形成第二層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；6)自下而上地構(gòu)筑所需層數(shù)的三維有序結(jié)構(gòu)。5.磁誘導(dǎo)修飾有超分子和/或生物識(shí)別作用的分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元構(gòu)筑在特定位點(diǎn)具有特定生長因子的三維有序結(jié)構(gòu)1)對(duì)于不同的生長因子(屬于蛋白類物質(zhì))，首先，通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基丁二酰亞胺，即EDC/NHS催化體系，在水溶液中分別對(duì)生長因子進(jìn)行特異性識(shí)別位點(diǎn)標(biāo)記，如生物素(biotin)標(biāo)記和芽孢桿菌rna酶抑制劑(barstar)標(biāo)記；2)將部分磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元修飾超分子，部分磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元同時(shí)修飾超分子和帶有生物識(shí)別作用的分子(biotin或barstar)；3)在有一定量水的培養(yǎng)皿中放置修飾有超分子的基底，在水面分散修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；4)用磁鐵或者三維磁操作裝置施加局部磁場(chǎng)，使修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元響應(yīng)外磁場(chǎng)，可以隨著磁場(chǎng)的移動(dòng)或變化而運(yùn)動(dòng)，操作磁場(chǎng)將任意一個(gè)磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元移至修飾有超分子的基底上方任意位置；5)緩慢吸水以降低水位，使修飾有超分子的生物相容性構(gòu)筑基元與修飾有超分子的基底表面充分接觸，達(dá)到分子間作用距離，一段時(shí)間后，該修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元可以通過其表面的超分子給(受)體與修飾有超分子受(給)體的基底表面通過超分子相互作用固定，即構(gòu)筑基元表面修飾的超分子給(受)體分子和基底表面修飾的超分子受(給)體分子發(fā)生超分子相互作用，該磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元被固定后，將不再受磁場(chǎng)變化的影響；6)重新加水，用磁場(chǎng)操作第二個(gè)修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元，磁搬運(yùn)至基底上指定位置，即與第一個(gè)已固定構(gòu)筑基元相互平行且端點(diǎn)相互平齊的位置，二者間距可以在十微米至一毫米范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，按照上述步驟5)繼續(xù)定位和固定，形成第一層互相平行、周期性排列的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；7)類似步驟5)和6)，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)同時(shí)修飾有超分子和生物識(shí)別作用分子(biotin)的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元運(yùn)動(dòng)，磁搬運(yùn)至第一層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元上方，其放置位置具有以下特征：與第一層構(gòu)筑基元有交點(diǎn)，與第一層所有構(gòu)筑基元之間的夾角可以在0-90度之間調(diào)節(jié)。使該磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元通過超分子相互作用固定在第一層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元上；8)類似步驟7)，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)同時(shí)修飾有超分子和另一種生物識(shí)別作用分子(barstar)的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元至同一層另一位置，或者其它層的所需位置；9)自下而上地構(gòu)筑所需層數(shù)的三維有序結(jié)構(gòu)，并在所需位置引入帶有特異性生物識(shí)別位點(diǎn)的生物相容性構(gòu)筑基元；10)將步驟9)所制備的三維有序結(jié)構(gòu)浸泡于可以和biotin、barstar特異性識(shí)別的蛋白混合溶液(即親和素avidin、芽孢桿菌rna酶barnase)中，使三維有序結(jié)構(gòu)中的生物識(shí)別位點(diǎn)可以分別通過各自的特異性生物結(jié)合作用(biotin/avidin識(shí)別，barstar/barnase識(shí)別)，識(shí)別對(duì)應(yīng)的生長因子，實(shí)現(xiàn)三維有序結(jié)構(gòu)中不同生長因子的定向引入，為進(jìn)一步細(xì)胞分化提供復(fù)雜的化學(xué)、生物三維環(huán)境；11)對(duì)于所制備的三維有序結(jié)構(gòu)，通過MTT標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)，對(duì)于吸附有間充質(zhì)干細(xì)胞的三維支架進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)，考察干細(xì)胞在所引入生長因子作用下的分化情況。所述的生物相容性構(gòu)筑基元包括PDMS、水凝膠、聚乳酸、聚乳酸-乙二醇酸、聚己內(nèi)酯、膠原、殼聚糖等。所述的宏觀超分子組裝尺度包含十微米至一厘米尺度范圍。本發(fā)明制備的宏觀超分子組裝的三維有序組織工程支架為堆垛狀三維有序結(jié)構(gòu)，所述三維有序結(jié)構(gòu)由多個(gè)在二維方向平行地、周期性有序排列的構(gòu)筑基元構(gòu)成，兩個(gè)相互接觸的構(gòu)筑基元通過各自表面上修飾的互補(bǔ)的給(受)體官能團(tuán)發(fā)生超分子相互作用而實(shí)現(xiàn)兩個(gè)表面的連接；所述支架的大小為10-5～10-2m。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供的宏觀超分子組裝制備三維有序組織工程支架的方法，通過多種微加工方法獲得尺寸在十微米至一厘米的生物相容性構(gòu)筑基元，并在生物相容性構(gòu)筑基元的制備中引入磁性納米粒子以使構(gòu)筑基元響應(yīng)外磁場(chǎng)。對(duì)所制備的生物相容性構(gòu)筑基元進(jìn)行表面修飾獲得帶有超分子作用如主客體識(shí)別、靜電、氫鍵、配位的互補(bǔ)官能團(tuán)以及生物識(shí)別作用的互補(bǔ)官能團(tuán)，使得上述互補(bǔ)生物相容性構(gòu)筑基元可以通過超分子相互作用實(shí)現(xiàn)宏觀超分子組裝而固定下來。進(jìn)而，利用外磁場(chǎng)在三維空間內(nèi)對(duì)生物相容性構(gòu)筑基元進(jìn)行準(zhǔn)確定位，并在指定位置利用操作平臺(tái)基底與生物相容性構(gòu)筑基元之間的超分子相互作用固定生物相容性構(gòu)筑基元，從而自下而上逐步構(gòu)建十微米至一厘米尺寸范圍的三維有序結(jié)構(gòu)；在三維結(jié)構(gòu)構(gòu)筑過程中，通過生物相容性構(gòu)筑基元表面生物識(shí)別位點(diǎn)可以定向引入指定生長因子，從而實(shí)現(xiàn)多種生長因子在三維支架材料內(nèi)部的定向引入。該方法可以提供一種新的制備具有復(fù)雜化學(xué)、生物環(huán)境的三維有序結(jié)構(gòu)的方法，是一種具有普適性的、溫和的、生物相容的制備方法，有望用于制備誘導(dǎo)細(xì)胞分化的模版和三維組織工程支架。附圖說明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1a和圖1b示出合成四氧化三鐵納米粒子的透射電鏡照片；圖2a示出合成純四氧化三鐵納米粒子和圖2b示出磁響應(yīng)性構(gòu)筑基元的磁滯回線；圖3示出方形亞克力模版及機(jī)械夾緊光學(xué)照片；圖4示出磁響應(yīng)性PDMS立方體構(gòu)筑基元；圖5示出磁響應(yīng)性水凝膠構(gòu)筑基元；圖6示出冰凍切片法制備構(gòu)筑基元流程示意圖；圖7示出冰凍切片法制備的PDMS條狀構(gòu)筑基元；圖8示出微壓印法制備微米級(jí)構(gòu)筑基元示意圖；圖9a，圖9b，圖9c和圖9d示出紫外光刻法制備的SU8光刻膠陣列；圖10a和圖10b示出微壓印法制備的微米級(jí)水凝膠構(gòu)筑基元熒光照片圖10c和圖10d示出微壓印法制備的微米級(jí)水凝膠構(gòu)筑基元水中剝離普通光學(xué)照片；圖11a示出合成產(chǎn)品PAA-CD核磁譜圖；圖11b示出合成產(chǎn)品PAA-Azo核磁譜圖；圖12示出交替層狀自組裝技術(shù)法修飾構(gòu)筑基元表面流程示意圖；圖13示出磁誘導(dǎo)宏觀超分子組裝構(gòu)筑三維有序結(jié)構(gòu)流程示意圖；圖14a，圖14b，圖14c和圖14d示出磁誘導(dǎo)宏觀超分子組裝所構(gòu)筑的三維有序結(jié)構(gòu)；圖15a和圖15b示出特定位點(diǎn)具有特定生長因子的三維有序結(jié)構(gòu)；圖16示出材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果；圖17a和圖17b示出細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.水熱法制備四氧化三鐵磁性納米粒子1)、將六水合三氯化鐵溶于乙二醇中，攪拌形成清亮黃色溶液。2)、加入醋酸鈉和聚乙二醇，繼續(xù)劇烈攪拌30分鐘，形成土黃色濁液，加入到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，密封，在200攝氏度下加熱10小時(shí)。3)、冷卻至室溫，用乙醇洗滌所得到的四氧化三鐵納米粒子，洗滌三次，在60攝氏度真空烘箱內(nèi)干燥6小時(shí)，獲得黑色粉體，其尺寸大小和磁滯回線分別如圖1a和圖1b、圖2a和圖2b所示。2.1機(jī)械微加工模版澆鑄法制備毫米級(jí)磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元對(duì)于毫米及以上尺度的生物相容性構(gòu)筑基元，可以通過傳統(tǒng)機(jī)械加工模版澆鑄成型的方式制備。1)采用機(jī)械加工行業(yè)中的激光雕刻技術(shù)，在聚甲基丙烯酸甲酯(亞克力)板材上鏤刻所需空心圖案，作為制備生物相容性構(gòu)筑基元的模版。借助于計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)，模版上圖案的形狀、尺寸大小均容易在毫米及以上尺度進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。以方形圖案為例，可以作為澆鑄立方體生物相容性構(gòu)筑基元的模版，如圖3所示；2)用乙醇、去離子水依次清洗模版，干燥后固定于平整玻璃表面；3)在室溫下，將液態(tài)生物相容性構(gòu)筑基元(以PDMS為例，其預(yù)聚體和交聯(lián)劑的混合物)與所制備的四氧化三鐵納米粒子充分混合分散，將所得到的混合物填充到固定在玻璃板上的模版方孔內(nèi)；4)在上方扣壓另一玻璃板，并將玻璃板-模版-玻璃板三者夾緊，在65攝氏度烘箱中加熱一段時(shí)間，固化，脫模得到分立的磁響應(yīng)性的立方體PDMS小塊作為生物相容性構(gòu)筑基元，如圖4所示。對(duì)于水凝膠生物相容性構(gòu)筑基元的制備，可以采用同樣步驟，將水凝膠單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑混合均勻后的液體，與磁性納米粒子充分混合分散，填充到模版中，通過熱引發(fā)或光引發(fā)聚合形成凝膠后，脫模即可，如圖5所示。對(duì)于聚乳酸、聚乳酸-乙二醇酸、聚己內(nèi)酯、膠原、殼聚糖等低熔點(diǎn)材料，可以在較高溫度下使其成為熔融液體，與磁性納米粒子混合后澆鑄于金屬模版中，然后冷卻至室溫固化、脫模。2.2冰凍切片法制備微米尺度磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元1)、將載玻片用Piranha洗液(濃硫酸：過氧化氫＝3：1v/v)進(jìn)行清洗，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。在密閉容器內(nèi)，滴加少量1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷，分立放置洗凈的載玻片，在60攝氏度下通過氣相沉積該全氟硅烷至載玻片上，使載玻片呈現(xiàn)疏水性。2)、如圖6所示，以PDMS為例，首先將PDMS預(yù)聚體及其交聯(lián)劑、磁性納米粒子以一定比例混合，滴于所制備的疏水載玻片上，兩端墊厚度為150微米的蓋玻片，上方按壓疏水載玻片，形成疏水載玻片-PDMS混合物-疏水載玻片夾層結(jié)構(gòu)，在65攝氏度下加熱固化，脫模得到厚度為150微米的PDMS薄片。3)、在顯微鏡下，將上述150微米的PDMS薄片裁成寬度為2毫米×2毫米×150微米的薄片。4)、用冰凍包埋劑OCT包覆上述薄片，設(shè)定冰凍切片機(jī)步進(jìn)距離，將包埋了的薄片放置在垂直于冰凍切片機(jī)刀口的位置，在步進(jìn)馬達(dá)的控制下進(jìn)行切割，可以批量得到尺寸為2毫米×150微米×10～100微米的長條，其中10～100微米為可設(shè)定可調(diào)整的步進(jìn)距離，如圖7所示。2.3微壓印法制備微米尺度磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元微壓印法流程如圖8所示：1)、以200微米×25微米×20微米水凝膠長條為例，用紫外光刻法在硅片表面制備SU8光刻膠的陣列，如圖9所示，圖9a是長條狀SU8光刻膠陣列，圖9b為其中一個(gè)長條構(gòu)筑基元的放大圖及相應(yīng)尺寸，圖9c是長條構(gòu)筑基元的橫斷面圖，圖9d是圖9c中長條橫斷面圖的尺寸。2)、在SU8光刻膠陣列上旋涂PDMS預(yù)聚體及其交聯(lián)劑的混合物，對(duì)上述陣列進(jìn)行復(fù)制，得到相反圖案的長條形空穴，作為模版。3)、將水凝膠單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和增粘劑混合，并分散磁性納米粒子，將該混合物滴至上述PDMS模版上，并覆蓋聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片，壓緊。4)、將PDMS-水凝膠單體混合物-PET夾層結(jié)構(gòu)通過納米熱壓儀壓緊，可以充分填充PDMS上長條型空穴，同時(shí)去除所溢出和殘留在模版與PET之間的液體。5)、通過365nm紫外光照或加熱引發(fā)水凝膠交聯(lián)、固化。揭開PET，由于PET的表面能與凝膠長條的表面能更加匹配，所以揭開PET過程中，所固化的凝膠塊體會(huì)粘附于PET上，可以在水中脫落和收集分立的水凝膠長條，如圖10a，圖10b，圖10c和圖10d所示。為了區(qū)分磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元表面修飾的官能團(tuán)，在混合液體中可以摻入少量染料以作區(qū)分。3.磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元表面修飾帶有超分子作用的官能團(tuán)1)用于交替層狀組裝技術(shù)的修飾有超分子的聚電解質(zhì)合成：采用接枝反應(yīng)或自由基共聚方式，將超分子環(huán)糊精和偶氮苯引入至聚丙烯酸(PAA)這一聚電解質(zhì)中，獲得聚丙烯酸-環(huán)糊精(PAA-CD)、聚丙烯酸-偶氮苯(PAA-Azo)，核磁圖如圖11a和11b所示。2)將磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元(以PDMS立方體小塊為例)通過乙醇、去離子水超聲的方式洗凈。3)配制交替層狀自組裝(LbL)過程所需的聚電解質(zhì)溶液：聚丙烯酸-環(huán)糊精(PAA-CD)、聚丙烯酸-偶氮苯(PAA-Azo)：0.1-1.0mg/mL。4)如附圖12所示，將一種生物相容性構(gòu)筑基元(染成綠色)交替循環(huán)浸泡于聚(二烯丙基二甲基氯化銨)(PDDA)和PAA-CD溶液中，獲得一定厚度的PDDA/PAA-CD多層膜；將另一種生物相容性構(gòu)筑基元(染成紅色)交替循環(huán)浸泡于PDDA和PAA-Azo溶液中，獲得一定厚度的PDDA/PAA-Azo多層膜。這樣，生物相容性構(gòu)筑基元表面即可修飾帶有環(huán)糊精或者偶氮苯的超分子。此外，可以在聚(丙烯胺鹽酸鹽)(PAH)側(cè)鏈接枝生物素(biotin)成為PAH-biotin，通過參與上述交替層狀組裝技術(shù)形成含有生物素一種超分子的PAH-biotin/PAA多層膜，或者同時(shí)帶有環(huán)糊精與生物素兩種超分子的PAH-biotin/PAA-CD多層膜。類似地，可以引入含有芽孢桿菌rna酶的聚電解質(zhì)PAH-barnase，獲得PAH-barnase/PAA-CD的多層膜。在預(yù)澆鑄溶液中混合帶有超分子的化合物，例如PAA-CD或PAA-Azo，也可以實(shí)現(xiàn)所制備生物相容性構(gòu)筑基元的表面修飾上超分子。三維有序結(jié)構(gòu)操作平臺(tái)基底(石英片、玻璃片或硅片)的表面修飾：首先，用Piranha洗液(濃硫酸：過氧化氫＝3：1v/v)對(duì)石英片或玻璃片或硅片進(jìn)行清洗，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?；然后將石英片或玻璃片或硅片交替循環(huán)浸泡于PDDA和PAA-CD溶液中，獲得一定厚度的PDDA/PAA-CD多層膜。4.磁誘導(dǎo)修飾有超分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元組裝構(gòu)筑三維有序結(jié)構(gòu)1)以長條狀磁響應(yīng)性PDMS生物相容性構(gòu)筑基元為例，在有一定量水的培養(yǎng)皿中放置修飾有PDDA/PAA-CD多層膜的石英片或玻璃片或硅片基底，在水面分散修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條；2)如圖13所示，用磁鐵或者三維磁操作裝置施加局部磁場(chǎng)，使修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條響應(yīng)外磁場(chǎng)，可以隨著磁場(chǎng)的移動(dòng)或變化而運(yùn)動(dòng)，操作磁場(chǎng)將修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條定位至基底上的任意位置；3)緩慢吸水以降低水位，使修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條與操作平臺(tái)基底表面充分接觸，達(dá)到分子間作用距離，一段時(shí)間后，該P(yáng)DMS條可以通過其表面的偶氮苯超分子與操作平臺(tái)基底表面的環(huán)糊精超分子通過超分子相互作用使修飾有偶氮苯超分子的PDMS條固定在基底上的任意位置，其固定后不再受磁場(chǎng)變化的影響；4)重新加水，用磁場(chǎng)操作第二根修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條，磁搬運(yùn)至基底上與第一根PDMS長條相互平行且端點(diǎn)相互平齊的位置，二者間距可以在十微米至一毫米范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，按照上述步驟3)繼續(xù)定位和固定，可以在操作平臺(tái)基底上構(gòu)筑所需要的修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條的圖案，形成第一層平行、周期性排列的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；5)重新加水，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)修飾有環(huán)糊精超分子的PDMS長條運(yùn)動(dòng)，磁搬運(yùn)至第一層修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條上方，其放置位置具有一下特征：與第一層PDMS條有交點(diǎn)，與第一層所有PDMS條之間的夾角可以在0-90度之間調(diào)節(jié)。按照這一排列方式，修飾有環(huán)糊精超分子的PDMS長條通過超分子作用固定在修飾有偶氮苯超分子的PDMS層上，形成第二層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；6)自下而上地構(gòu)筑所需層數(shù)的三維有序結(jié)構(gòu)，對(duì)于所得到的三維有序結(jié)構(gòu)，其磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元的位置、間距和層數(shù)均在三維空間內(nèi)可調(diào)，如圖14a，圖14b，圖14c和圖14d所示。5.磁誘導(dǎo)修飾有超分子和/或生物識(shí)別作用的分子的磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元組裝構(gòu)筑在特定位點(diǎn)具有特定生長因子的三維有序結(jié)構(gòu)1)以引入兩種不同的生長因子，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)為例，首先，通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基丁二酰亞胺，即EDC/NHS催化體系，在水溶液中對(duì)兩種生長因子VEGF和FGF進(jìn)行生物素(biotin)標(biāo)記和芽孢桿菌rna酶抑制劑(barstar)標(biāo)記，得到VEGF-biotin，F(xiàn)GF-barstar；2)以長條狀磁響應(yīng)性PDMS生物相容性構(gòu)筑基元為例，將部分PDMS長條修飾環(huán)糊精或偶氮苯超分子，部分PDMS長條同時(shí)修飾環(huán)糊精超分子和親和素(avidin)分子，部分PDMS長條同時(shí)修飾環(huán)糊精超分子和芽孢桿菌rna酶分子，部分PDMS長條同時(shí)親和素分子和偶氮苯超分子，部分PDMS長條同時(shí)修飾芽孢桿菌rna酶分子和偶氮苯超分子；3)在有一定量水的培養(yǎng)皿中放置修飾有PDDA/PAA-CD多層膜的石英片或玻璃片或硅片基底，在水面分散修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條；4)用磁鐵或者三維磁操作裝置施加局部磁場(chǎng)，使修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條響應(yīng)外磁場(chǎng)，可以隨著磁場(chǎng)的移動(dòng)或變化而運(yùn)動(dòng)，操作磁場(chǎng)將修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條定位至基底上的指定位置；5)緩慢吸水以降低水位，使修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條與操作平臺(tái)基底表面充分接觸，達(dá)到分子間作用距離，一段時(shí)間后，該修飾有偶氮苯超分子的PDMS條可以通過其表面的偶氮苯超分子與操作平臺(tái)基底表面的環(huán)糊精超分子通過超分子相互作用固定，其固定后不再受磁場(chǎng)變化的影響；6)重新加水，用磁場(chǎng)操作第二根修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條，磁搬運(yùn)至基底上的指定位置，按照上述步驟5)繼續(xù)定位和固定，可以在操作平臺(tái)基底上構(gòu)筑所需要的修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條的圖案，形成第一層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；7)重新加水，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)同時(shí)修飾有環(huán)糊精超分子和親和素分子的PDMS長條運(yùn)動(dòng)，磁搬運(yùn)至第一層修飾有偶氮苯超分子的PDMS長條上方，使修飾有環(huán)糊精超分子和親和素分子的PDMS長條通過超分子相互作用固定在修飾有偶氮苯超分子的PDMS層上，形成第二層磁響應(yīng)性生物相容性構(gòu)筑基元；8)類似步驟7)，用磁場(chǎng)誘導(dǎo)同時(shí)含有芽孢桿菌rna酶分子和環(huán)糊精超分子的PDMS長條，固定至同一層另一位置，或者磁誘導(dǎo)同時(shí)含有芽孢桿菌rna酶分子和偶氮苯超分子的PDMS長條固定至相鄰層的指定位置，也可以是磁誘導(dǎo)同時(shí)含有親和素分子和偶氮苯超分子的PDMS長條固定至相鄰層的指定位置；9)自下而上地構(gòu)筑所需層數(shù)的三維有序結(jié)構(gòu)，并在所需位置引入帶有特異性識(shí)別位點(diǎn)(如avidin，barstar)的PDMS生物相容性構(gòu)筑基元，如圖15a和圖15b所示；10)將步驟9)所制備的結(jié)構(gòu)浸泡于VEGF-biotin和FGF-barstar的混合溶液中，使三維有序結(jié)構(gòu)中的avidin位點(diǎn)和barnase位點(diǎn)可以分別通過biotin/avidin或barnase/barstar特異性結(jié)合作用，識(shí)別對(duì)應(yīng)的VEGF-biotin和FGF-barstar生長因子，實(shí)現(xiàn)三維有序結(jié)構(gòu)中不同生長因子的定向引入，為進(jìn)一步細(xì)胞分化提供復(fù)雜的化學(xué)、生物三維環(huán)境；11)對(duì)于步驟9)所制備的結(jié)構(gòu)，通過MTT標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明所用材料沒有細(xì)胞毒性(如圖16所示)。培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)，對(duì)于吸附有間充質(zhì)干細(xì)胞的三維支架進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)，考察干細(xì)胞在所引入生長因子作用下的分化情況。細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖17a和圖17b所示，體現(xiàn)了較好的細(xì)胞吸附、遷移、生長和分化效果。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。