本發(fā)明涉及一種抑制鏈球菌和/或預(yù)防鏈球菌感染的疫苗。

背景技術(shù)：
A型鏈球菌（GroupAStreptococcuspyogenes,以下簡(jiǎn)稱A鏈菌）,又稱A族鏈球菌或A群鏈球菌，可引起多種疾病，輕者包括扁桃體炎、膿皰病、丹毒等各種類型的皮膚及軟組織感染，重者則為嚴(yán)重的侵襲性感染，可危及生命，如肺炎、菌血癥、中毒性休克和急性壞死性肌膜炎（NecrotizingFasciitis）。后者在12-24小時(shí)出現(xiàn)大片組織壞死導(dǎo)致死亡，死亡率高達(dá)60％，幸運(yùn)者常以截肢為代價(jià)，因而以“食人菌”著稱，并有成為生物恐怖武器的可能。A鏈菌引起人們重視的另一重要原因是它與自身免疫性疾病有關(guān)。反復(fù)發(fā)作的A鏈菌性扁桃體炎可導(dǎo)致自身免疫性后遺癥，如急性風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎以及牛皮癬等。其中風(fēng)濕性心臟病在世界心血管疾病死亡率中占首位，因此一直為世界衛(wèi)生組織和科學(xué)家所重視。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)表明全球每年有180萬(wàn)人嚴(yán)重感染A鏈菌，50多萬(wàn)人因A鏈菌感染而死亡，約有1.1億人表淺感染，6.1億人扁桃體炎和咽炎，并有1800多萬(wàn)人因A鏈菌感染導(dǎo)致自身免疫性疾病。此外，歷史上造成人類死亡最多的流感，其死亡原因的90%是繼發(fā)細(xì)菌性肺炎導(dǎo)致的急性肺損傷，主要的致病菌是肺炎鏈球菌和A鏈菌。目前在國(guó)內(nèi)外都沒(méi)有A鏈菌的疫苗。由于A鏈菌有>150種菌型，并且決定A鏈菌血清型的M蛋白與人組織蛋白有相似性，被認(rèn)為是引起自身免疫性疾病的原因。這些嚴(yán)重阻礙了A鏈菌疫苗的研發(fā)進(jìn)程。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)安全、有效、廣譜、和易于推廣應(yīng)用的疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種抑制鏈球菌和/或預(yù)防鏈球菌感染的疫苗。本發(fā)明提供的疫苗，其活性成分由成分甲和成分乙組成；所述成分甲為分選酶（sortase）、具有所述分選酶的融合蛋白、所述分選酶與佐劑蛋白共軛連接的蛋白、所述分選酶與多糖的連接復(fù)合物或攜帶所述分選酶的編碼基因的DNA表達(dá)載體；所述成分乙為霍亂毒素B亞單位或具有霍亂毒素B亞單位的融合蛋白；所述疫苗的功能為如下（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）抑制革蘭氏陽(yáng)性致病菌；（Ⅱ）預(yù)防和/或治療革蘭氏陽(yáng)性致病菌感染；（Ⅲ）預(yù)防革蘭氏陽(yáng)性致病菌導(dǎo)致的人粘膜系統(tǒng)感染；（Ⅳ）降低或防止革蘭氏陽(yáng)性致病菌在人粘膜系統(tǒng)的定居和感染。所述分選酶可為分選酶A、分選酶B、分選酶C、分選酶D或分選酶E。所述分選酶為從革蘭氏陽(yáng)性菌中提取的分選酶、大腸桿菌表達(dá)的分選酶、酵母表達(dá)的分選酶或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的分選酶。所述分選酶為大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白、酵母表達(dá)的重組蛋白或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白形式的分選酶。所述酵母表達(dá)為釀酒酵母、漢遜酵母或畢氏酵母等酵母表達(dá)系統(tǒng)。所述分選酶可源自A型鏈球菌但不限于A型鏈球菌。細(xì)菌分選酶A具有高度同源性，普遍存在于革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中，具有將細(xì)菌毒力因子連接到細(xì)菌表面的功能。已發(fā)現(xiàn)的分選酶除了分選酶A以外，還有分選酶B、C、D和E，它們有與分選酶A相似的功能，但同源性和所連接的蛋白種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于分選酶A。病原微生物表面分子的持續(xù)變異是疫苗研究面臨的最大挑戰(zhàn)，選擇病原菌的共有分子是疫苗設(shè)計(jì)的重要策略。分選酶A的同源性無(wú)疑是廣譜鏈球菌疫苗的理想選擇。所述分選酶A具體可為如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列3自N末端第22至189位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b）將（a）經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。所述“具有所述分選酶的融合蛋白”具體可為如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（d）將（c）經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。所述多糖為A型鏈球菌的多糖、B型鏈球菌的莢膜多糖或肺炎球菌的莢膜多糖。所述霍亂毒素B亞單位可為源自霍亂弧菌的霍亂毒素B亞單位。所述霍亂毒素B亞單位可以以單體或多聚體的形式存在。所述霍亂毒素B亞單位具體可為如下（e）或（f）：（e）由序列表中序列4所述氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（f）將（e）經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。所述成分甲和所述成分乙的質(zhì)量配比為20:1-2。所述革蘭氏陽(yáng)性致病菌可為鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、糞腸球菌或炭疽桿菌。所述鏈球菌可為A型鏈球菌、B型鏈球菌、C型鏈球菌、G型鏈球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌或馬鏈球菌。所述的A型鏈球菌具體可為A型鏈球菌M1型、A型鏈球菌M12型、A型鏈球菌M28型或A型鏈球菌M49型。所述人粘膜系統(tǒng)可為呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)或皮膚。所述疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮內(nèi)注射、生殖道注入或肛內(nèi)注入。本發(fā)明提供的疫苗的推薦使用方法：成分甲的蛋白用量為20-30μg/次，成分乙的蛋白用量為1-2μg/次，免疫次數(shù)為3-5次，間隔一周。免疫方式為鼻腔吸入。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述成分甲和以上任一所述成分乙在制備抑制疫苗中的應(yīng)用；所述疫苗的功能為如下（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）抑制革蘭氏陽(yáng)性致病菌；（Ⅱ）預(yù)防和/或治療革蘭氏陽(yáng)性致病菌感染；（Ⅲ）預(yù)防革蘭氏陽(yáng)性致病菌導(dǎo)致的人粘膜系統(tǒng)感染；（Ⅳ）降低或防止革蘭氏陽(yáng)性致病菌在人粘膜系統(tǒng)的定居和感染。所述成分甲和所述成分乙的質(zhì)量配比為20:1-2。所述革蘭氏陽(yáng)性致病菌可為鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、糞腸球菌或炭疽桿菌。所述鏈球菌可為A型鏈球菌、B型鏈球菌、C型鏈球菌、G型鏈球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌或馬鏈球菌。所述的A型鏈球菌具體可為A型鏈球菌M1型、A型鏈球菌M12型、A型鏈球菌M28型或A型鏈球菌M49型。所述人粘膜系統(tǒng)可為呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)或皮膚。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期深入研究發(fā)現(xiàn)A型鏈球菌經(jīng)呼吸道粘膜免疫后產(chǎn)生以Th17為主的免疫反應(yīng)，并對(duì)此菌的再次感染有顯著保護(hù)作用。Th17細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類T細(xì)胞，粘膜免疫后產(chǎn)生的免疫記憶Th17細(xì)胞能迅速遷移到感染的粘膜部位，在抗粘膜細(xì)菌感染起重要作用。與B細(xì)胞提供的免疫不同，T細(xì)胞提供的免疫具有耐受抗原變異的特點(diǎn)，能提供對(duì)同種異型細(xì)菌的交叉免疫保護(hù)，是新型疫苗構(gòu)建的理論基礎(chǔ)。Th17細(xì)胞活化后釋放的細(xì)胞因子IL-17激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬，有效地殺死進(jìn)入機(jī)體的病原菌。發(fā)明人已證明A鏈菌的粘膜免疫保護(hù)依賴于Th17細(xì)胞的活化。因此激活Th17免疫反應(yīng)是粘膜感染細(xì)菌A鏈菌疫苗的目標(biāo)和重要評(píng)價(jià)依據(jù)。亞單位疫苗的弱點(diǎn)之一是常需要連接在載體上以獲得較好的免疫原性。粘膜佐劑不僅能促進(jìn)Th17細(xì)胞的活化，還促進(jìn)疫苗亞單位在粘膜部位被抗原加工細(xì)胞攝取，顯著增強(qiáng)其免疫原性和免疫效果，同時(shí)避免肌肉或皮下免疫因佐劑會(huì)引起的局部組織反應(yīng)。分選酶經(jīng)粘膜免疫能有效的降低或防止鏈球菌在人粘膜系統(tǒng)的定居和感染率。本發(fā)明提供的疫苗的使用方式包括鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮內(nèi)注射、生殖道注入、肛內(nèi)注入等。本發(fā)明提供的疫苗可用于各種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌導(dǎo)致的粘膜系統(tǒng)（呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)或皮膚）感染的預(yù)防和治療。本發(fā)明利用分選酶A在鏈球菌中的普遍性和同源性、粘膜免疫佐劑增強(qiáng)抗原免疫原性和粘膜途徑免疫誘導(dǎo)Th17活化的特性設(shè)計(jì)了合理的疫苗配方，顯著提高了Th17細(xì)胞和活化和IL-17細(xì)胞因子的水平，可以達(dá)到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的作用，且對(duì)不同血清型A鏈菌均具有保護(hù)效果，具有高效、廣譜、和低價(jià)的優(yōu)越性。同時(shí)本發(fā)明提供的疫苗采用粘膜免疫的途徑，具有無(wú)組織損傷、無(wú)局部副作用和使用簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，易于推廣使用。附圖說(shuō)明圖1為制備分選酶A基因過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為制備分選酶A過(guò)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖3為實(shí)施例2的結(jié)果（鼻腔吸入分選酶A和CTB蛋白后對(duì)A型鏈球菌感染的免疫保護(hù)）。圖4為實(shí)施例3的結(jié)果（分選酶A和CTB蛋白粘膜免疫誘導(dǎo)以Th17細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)）。圖5為實(shí)施例4的結(jié)果（分選酶A和CTB免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)A型鏈球菌的Th17免疫記憶反應(yīng)）。圖6為實(shí)施例5的結(jié)果（在細(xì)菌感染小鼠之前應(yīng)用抗體中和IL-17A可以顯著降低免疫小鼠清除細(xì)菌的能力）。圖7為實(shí)施例6的結(jié)果（給予分選酶A和CTB后，無(wú)抗體小鼠的Th17細(xì)胞明顯增高，但無(wú)抗體測(cè)出，并顯示獲得了與野生型小鼠相似的免疫保護(hù)）。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。A型鏈球菌M1型：來(lái)源于明尼蘇達(dá)州立大學(xué)微生物系，參考文獻(xiàn)：WangB,DileepanT,BriscoeS,HylandKA,KangJ,KhorutsA,ClearyPP.InductionofTGF-beta1andTGF-beta1-dependentpredominantTh17differentiationbygroupAstreptococcalinfection.ProcNatlAcadSciUSA.2010;107(13):5937-42.。A型鏈球菌M12型：參考文獻(xiàn)：RetnoningrumDS,PodbielskiA,ClearyPP.TypeM12proteinfromStreptococcuspyogenesisareceptorforIgG3.JImmunol.1993Mar15;150(6):2332-40.。A型鏈球菌M28型：參考文獻(xiàn)：GreenNM,ZhangS,PorcellaSF,NagiecMJ,BarbianKD,BeresSB,LeFebvreRB,MusserJM.GenomesequenceofaserotypeM28strainofgroupastreptococcus:potentialnewinsightsintopuerperalsepsisandbacterialdiseasespecificity.JInfectDis.2005Sep1;192(5):760-70.。A型鏈球菌M49型：參考文獻(xiàn)：HaanesEJ,ClearyPP.IdentificationofadivergentMproteingeneandanMprotein-relatedgenefamilyinStreptococcuspyogenesserotype49.J.Bacteriol.1989Dec;171(12):6397-408.?；魜y弧菌：參考文獻(xiàn)RolfsA,MontorWR,YoonSS,HuY,BhullarB,KelleyF,McCarronS,JepsonDA,ShenB,TaycherE,MohrSE,ZuoD,WilliamsonJ,MekalanosJ,Labaer.ProductionandsequencevalidationofacompletefulllengthORFcollectionforthepathogenicbacteriumVibriocholerae.J.ProcNatlAcadSciUSA.2008March18;105(11):4364–4369.。載體pET28a(+)：Novagen公司,Cat.No.69846-3。大腸桿菌BL21gold(DE3)plysS：購(gòu)自北京康為試劑生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號(hào):CW0810A。BALB/c小鼠：購(gòu)自CharlesRiver；STRAINCODE：028。無(wú)抗體小鼠：此種小鼠沒(méi)有B細(xì)胞，不能產(chǎn)生抗體；購(gòu)自美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)（JacksonLabs），品系號(hào)002288。CTB蛋白（霍亂毒素B亞單位）：購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)C9903，如序列表的序列4所示。使用時(shí)，用PBS緩沖液(pH為7.4)溶解，得到CTB蛋白溶液。實(shí)施例1、分選酶A的制備1、以A型鏈球菌M1型的基因組DNA為模板，用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。F1：5’-CTTACATATGGTCTTGCAAGCACAAATGG-3’；R1：5’-ATGTTCTCGAGCTAGGTAGATACTTGGTTATAAGA-3’。2、用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切載體pET28a(+)，回收約6000bp的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-SrtA。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-SrtA進(jìn)行結(jié)果描述如下：在載體pET28a(+)的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列1自5’末端第244-750位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。插入的雙鏈DNA分子與載體骨架上的部分DNA形成序列表的序列2所示的融合基因，表達(dá)序列表的序列3所示的融合蛋白。5、將重組質(zhì)粒pET28a-SrtA導(dǎo)入大腸桿菌BL21gold(DE3)plysS，得到重組菌。6、將步驟5得到的重組菌接種于含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)至OD560nm=0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)并使其濃度為40μg/ml，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。7、取步驟6的培養(yǎng)體系，4℃、6000rpm離心10分鐘收集菌體沉淀，用pH7.4的PBS緩沖液懸浮菌體沉淀并進(jìn)行超聲破碎（功率為200W，每工作4秒間歇8秒，循環(huán)99次），然后12000rpm離心20分鐘，收集上清液。8、將步驟7得到的上清液上樣于GE公司NiSepharose6FastFlow，先用溶液Ⅰ(pH為7.4，溶劑為水，含20mMNa2HPO4和500mMNaCl)進(jìn)行10個(gè)柱體積的洗脫以去除雜蛋白，然后用溶液Ⅱ（pH為7.4，溶劑為水，含200mM咪唑、20mMNa2HPO4和500mMNaCl）進(jìn)行2個(gè)柱體積的洗脫以獲得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ洗脫時(shí)的過(guò)柱后溶液，將其命名為分選酶A溶液。每升步驟6的培養(yǎng)體系可獲得90%純度以上的蛋白50毫克。制備分選酶A蛋白過(guò)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。圖2中，泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為步驟7得到的上清液，泳道3為采用溶液Ⅰ洗脫時(shí)的過(guò)柱后溶液，泳道4為分選酶A蛋白。實(shí)施例2、鼻腔吸入分選酶A和CTB蛋白后對(duì)A型鏈球菌感染的免疫保護(hù)一、將4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，分組處理如下：PBS組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液；分選酶A/CTB組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)。實(shí)驗(yàn)第21天，用活菌（A型鏈球菌M1型、A型鏈球菌M12型、A型鏈球菌M28型或A型鏈球菌M49型）通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒18小時(shí)后處死小鼠，分離鼻相關(guān)淋巴組織(NasalAssociatedLymphoidTissue,簡(jiǎn)稱NALT),制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖3A-D，每個(gè)黑點(diǎn)代表1只小鼠（縱坐標(biāo)指的是每只小鼠的整個(gè)NALT中A鏈菌的CFU數(shù)量）。A型鏈球菌M1型攻擊后，分選酶A/CTB組小鼠NALT中的活菌數(shù)明顯比PBS組少，表明本發(fā)明提供的疫苗經(jīng)呼吸道粘膜免疫能有效地清除A型鏈球菌M1型的感染。A型鏈球菌M12型、A型鏈球菌M28型或A型鏈球菌M49型攻擊后，分選酶A/CTB組小鼠NALT中的活菌數(shù)均明顯比與PBS組少，表明本發(fā)明提供的疫苗對(duì)不同血清型的A型鏈球菌感染均有抑制作用，可以有效保護(hù)動(dòng)物。二、將4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，分組處理如下：PBS組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液；分選酶A20μg/CTB1μg組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)；分選酶A20μg/CTB2μg組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和2μgCTB蛋白)。實(shí)驗(yàn)第21天，用活菌（A型鏈球菌M1型）通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒18小時(shí)后處死小鼠，分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖3E，每個(gè)黑點(diǎn)代表1只小鼠（縱坐標(biāo)指的是每只小鼠的整個(gè)NALT中A鏈菌的CFU數(shù)量）。分選酶A與CTB的比列在20：1與20：2之間均有免疫保護(hù)效果，其間無(wú)顯著差異（P=0.43）。實(shí)施例3、分選酶A和CTB蛋白粘膜免疫誘導(dǎo)以Th17細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)Th17細(xì)胞在粘膜免疫保護(hù)中起主要作用，本實(shí)施例的目的為驗(yàn)證分選酶A和CTB蛋白誘導(dǎo)Th17細(xì)胞活化的效應(yīng)。將4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組，分組處理如下：PBS組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液；分選酶A組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入實(shí)施例1制備的分選酶A溶液（每只小鼠每次給予20μg分選酶A）；CTB組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入CTB蛋白溶液（每只小鼠每次給予1μgCTB蛋白）；分選酶A/CTB組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)。實(shí)驗(yàn)第21-24天，分離NALT。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠NALT中各類T細(xì)胞的變化，見(jiàn)圖4A（各組均為6只小鼠的平均值）。與PBS組相比，疫苗液免疫后Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，而分選酶A或者CTB蛋白單獨(dú)免疫后Th17細(xì)胞的數(shù)量均沒(méi)有明顯變化。Th1細(xì)胞的數(shù)量在分選酶A和CTB蛋白單獨(dú)或共同免疫的小鼠中都與PBS組相似，即保持在基礎(chǔ)水平。說(shuō)明分選酶A和CTB蛋白共同免疫誘導(dǎo)以Th17細(xì)胞為主的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。CD4+細(xì)胞中的細(xì)胞因子IL-17在分選酶和CTB免疫后大量表達(dá)，而Th1細(xì)胞的標(biāo)志性因子IFN-γ雖比對(duì)照有明顯增高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于增高的IL-17。這些數(shù)據(jù)表明，分選酶A和CTB聯(lián)合免疫能活化Th17細(xì)胞和IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)第21-24天，用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒18小時(shí)后處死小鼠，分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)。見(jiàn)圖4B，每個(gè)黑點(diǎn)代表1只小鼠（縱坐標(biāo)指的是每只小鼠的整個(gè)NALT中A鏈菌的CFU數(shù)量）。分選酶A/CTB組活菌數(shù)明顯比PBS組降低，而分選酶A或CTB蛋白單獨(dú)免疫的小鼠與PBS組相比沒(méi)有差別。即NALT中活菌數(shù)的存留與Th17細(xì)胞的變化相符，說(shuō)明有效的免疫保護(hù)與Th17細(xì)胞的活化相關(guān)。攻毒18小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)NALT中Th17細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子的表達(dá)量，以GAPDH的表達(dá)量為內(nèi)參。見(jiàn)圖4C。用于通過(guò)RT-PCR鑒定IL-17amRNA的引物如下：上游引物：CGCAAAAGTGAGCTCCAGA；下游引物：TGAGCTTCCCAGATCACAGA。用于通過(guò)RT-PCR鑒定IFN-γmRNA的引物如下：上游引物：GCGTCATTGAATCACACCTG；下游引物：GAGCTCATTGAATGCTTGGC。用于通過(guò)RT-PCR鑒定GAPDHmRNA的引物如下：上游引物：CATGGCCTTCCGTGTTCCTA；下游引物：GCGGCACGTCAGATCCA。實(shí)施例4、分選酶A和CTB免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)A型鏈球菌的Th17免疫記憶反應(yīng)本實(shí)施例為證明疫苗配方免疫能建立對(duì)A型鏈球菌的Th17記憶反應(yīng)。一、將4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組，分組處理如下：PBS組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液；分選酶A組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入實(shí)施例1制備的分選酶A溶液（每只小鼠每次給予20μg分選酶A）；CTB組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入CTB蛋白溶液（每只小鼠每次給予1μgCTB蛋白）；分選酶A/CTB組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)。實(shí)驗(yàn)第21-24天，用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒72小時(shí)后處死小鼠，分離NALT并檢測(cè)感染后Th17細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果見(jiàn)圖5A（各組均為8只小鼠的平均值）。CD4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)在各組中沒(méi)有明顯變化，CD4+IL-17+T細(xì)胞僅在分選酶A/CTB組小鼠中明顯升高，表明本發(fā)明提供的疫苗配方建立了對(duì)A型鏈球菌的Th17的免疫記憶反應(yīng)。二、將4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為六組，分組處理如下：PBS/PBS組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第24天用PBS緩沖液通過(guò)鼻腔滴注小鼠（每只小鼠滴注10μl）；PBS/分選酶A組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第24天用實(shí)施例1制備的分選酶A溶液通過(guò)鼻腔滴注小鼠（每只小鼠每次給予20μg分選酶A，每只小鼠滴注10μl）；PBS/M1組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第24天用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）；分選酶A/CTB/M1組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)，實(shí)驗(yàn)第24天用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）；分選酶A/CTB/M28組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)，實(shí)驗(yàn)第24天用A型鏈球菌M28型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）；分選酶A/CTB/M49組：實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)，實(shí)驗(yàn)第24天用A型鏈球菌M49型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl）。攻毒72小時(shí)后處死小鼠，分離NALT并檢測(cè)Th17細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果見(jiàn)圖5B（各組均為8只小鼠的平均值）和圖5C。Th17記憶反應(yīng)不僅能被M1菌株，也能被不同血清型的A型鏈球菌誘導(dǎo)。分選酶A/CTB免疫小鼠在M28、M49和M1攻擊后CD4+IL-17+T細(xì)胞數(shù)顯著增加，但在沒(méi)有進(jìn)行分選酶A/CTB免疫的小鼠中沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果說(shuō)明分選酶A/CTB免疫后活化的Th17細(xì)胞能在不同血清型的A型鏈球菌感染時(shí)擴(kuò)增，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。實(shí)施例5、在細(xì)菌感染小鼠之前應(yīng)用抗體中和IL-17A可以顯著降低免疫小鼠清除細(xì)菌的能力IL-17中和抗體：購(gòu)自BioXCell公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17F3。同型對(duì)照抗體：購(gòu)自BioXCell公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MOPC-21。IL-17A是Th17細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子。為證明本發(fā)明提供的疫苗配方通過(guò)活化Th17細(xì)胞提供免疫保護(hù)和考慮到IL-17A-/-缺陷小鼠有其它可能的免疫缺損，本實(shí)施例中采用了中和抗體體內(nèi)阻斷的方法。PBS組：取4-6周齡的雌性BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第15天、第17天、第19天和第21天分別腹腔注射PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第21天用A型鏈球菌M1型或A型鏈球菌M28型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小時(shí)后分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)。IL-17中和抗體組：取4-6周齡的雌性BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)，實(shí)驗(yàn)第15天、第17天、第19天和第21天分別腹腔注射IL-17中和抗體（每只小鼠每次給予100μgIL-17中和抗體），實(shí)驗(yàn)第21天用A型鏈球菌M1型或A型鏈球菌M28型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小時(shí)后分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)。同型對(duì)照抗體組：用等體積和等濃度的同型對(duì)照抗體代替IL-17中和抗體，其它同IL-17中和抗體組。結(jié)果見(jiàn)圖6（每個(gè)黑點(diǎn)代表1只小鼠，縱坐標(biāo)指的是每只小鼠的整個(gè)NALT中A鏈菌的CFU數(shù)量）。分別用A鏈菌M1型（圖6A）和M28型菌株（圖6B）攻擊后，免疫分選酶A/CTB和注射同型對(duì)照抗體的小鼠的NALT中的活菌數(shù)顯著低于免疫分選酶A/CTB和注射IL-17中和抗體的小鼠，免疫分選酶A/CTB和注射IL-17中和抗體的小鼠的NALT中的活菌數(shù)與未免疫分選酶A/CTB且未注射IL-17中和抗體的小鼠無(wú)明顯差別。結(jié)果證明分選酶A/CTB誘導(dǎo)的IL-17A在抗不同血清型GAS粘膜感染中有重要作用。實(shí)施例6、給予分選酶A和CTB后，無(wú)抗體小鼠的Th17細(xì)胞明顯增高，但無(wú)抗體測(cè)出，并顯示獲得了與野生型小鼠相似的免疫保護(hù)PBS組：取4-6周齡的雌性BALB/c小鼠（Wt）或4-6周齡的無(wú)抗體小鼠（μMT），實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)第21天用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小時(shí)后分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)、取血和口鼻洗液并分別通過(guò)ELISA檢測(cè)分選酶A特異性抗體。攻毒72小時(shí)后，分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，檢測(cè)Th17細(xì)胞。分選酶A/CTB組：取4-6周齡的雌性BALB/c小鼠（Wt）或4-6周齡的無(wú)抗體小鼠（μMT），實(shí)驗(yàn)第1天、第7天和第14天分別經(jīng)鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是將實(shí)施例1制備的分選酶A溶液和CTB蛋白溶液混合得到的，每只小鼠每次給予20μg分選酶A和1μgCTB蛋白)，實(shí)驗(yàn)第21天用A型鏈球菌M1型通過(guò)鼻腔滴注對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒（菌液的濃度為2×108CFU/10μl，每只小鼠滴注10μl），攻毒18小時(shí)后分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，用血平板培養(yǎng)檢測(cè)NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)、取血和口鼻洗液并分別通過(guò)ELISA檢測(cè)分選酶A特異性抗體。攻毒72小時(shí)后，分離NALT,制成單細(xì)胞懸液，檢測(cè)Th17細(xì)胞。NALT中的A型鏈球菌活菌數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖7A（每個(gè)黑點(diǎn)代表1只小鼠，縱坐標(biāo)指的是每只小鼠的整個(gè)NALT中A鏈菌的CFU數(shù)量），Th17細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖7B（各組均為8只小鼠的平均值）。結(jié)果顯示，μMT小鼠表現(xiàn)出與野生型小鼠相似的保護(hù)能力，并伴有升高的Th17細(xì)胞。ELISA檢測(cè)的分選酶抗體結(jié)果見(jiàn)圖7C和7D（各組均為8只小鼠的平均值）。免疫分選酶A和CTB的BALB/c小鼠的血清型抗體和分泌型抗體都明顯升高，而在免疫的μMT小鼠未檢出。這些結(jié)果表明，分選酶A/CTB能誘導(dǎo)抗體和Th17免疫反應(yīng)，但抗體在分選酶A介導(dǎo)的免疫保護(hù)中不起作用。綜合上述結(jié)果，Th17細(xì)胞是提供免疫保護(hù)的主要免疫力。