該申請(qǐng)要求了2013年11月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/907,980的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用全部并入到本申請(qǐng)中。
技術(shù)領(lǐng)域：
在某些方面，提供的實(shí)施例基于在此證明的胃泌素在老化腸道-卵巢軸調(diào)節(jié)中的作用和在逆轉(zhuǎn)胃泌素介導(dǎo)的骨質(zhì)流失中針對(duì)胃泌素活性的影響。本發(fā)明提供了用于治療、穩(wěn)定、改善和預(yù)防骨疾病和病情的方法、組合物和制劑，包括胃泌素拮抗劑。
背景技術(shù)：
：特征為骨質(zhì)流失和高風(fēng)險(xiǎn)骨折的骨質(zhì)疏松癥是最普通的疾病之一，特別是在老年當(dāng)中，估計(jì)在全球范圍內(nèi)其影響著約1億的人口。當(dāng)老年人骨折的發(fā)生率逐漸增加時(shí)，治療方法的選擇會(huì)受到限制。目前，抗骨質(zhì)再吸收劑(例如二膦酸鹽、迪諾塞麥和激素治療)最常用來治療骨質(zhì)疏松癥。設(shè)計(jì)這些制劑來減慢骨重建以及增加骨密度。然而，它們與顯著的副作用相關(guān)，包括頜骨壞死、非典型性骨折、心房顫動(dòng)和增加中風(fēng)或癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。同化劑可被用來在患有骨質(zhì)疏松癥的患者中產(chǎn)生新骨。然而，找到增加骨量以及調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和骨髓肥胖之間平衡的合成代謝因子是個(gè)挑戰(zhàn)。此外，市場上可獲得的唯一同化劑(特立帕肽)不僅非常昂貴以及難以給藥，而且與包括降低血壓、惡心、疼痛、虛弱以及萎靡不振的副作用相關(guān)。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在大鼠中使用特立帕肽會(huì)引起惡性腫瘤的生長(成骨細(xì)胞癌)?？傊琴|(zhì)疏松癥的治療選擇是有限的，刺激骨形成的新的治療方法的發(fā)展是優(yōu)先考慮的。雖然卵巢衰竭和骨脫礦質(zhì)作為骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵因素是公認(rèn)的，但是準(zhǔn)確的病原尚未完全解決。更好地了解骨質(zhì)疏松癥和相關(guān)骨疾病或病情的病因可產(chǎn)生用于治療骨質(zhì)疏松癥和其他骨疾病和病情的新的替代方法和組合物。需要用于治療骨質(zhì)疏松癥和其他骨疾病和病情的方法和組合物。本申請(qǐng)克服了上述要注意的問題，并提供了一種用于通過調(diào)節(jié)胃泌素的影響來治療、穩(wěn)定和/或預(yù)防骨疾病或病情進(jìn)展的新方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜谕ㄟ^向有需要的主體施用藥劑來治療，例如穩(wěn)定和/或預(yù)防，例如預(yù)防骨疾病或失調(diào)進(jìn)展的方法、用途、化合物和組合物。在一些實(shí)施例中，骨疾病或失調(diào)的特征為骨質(zhì)疏松癥。在其他實(shí)施例中，向有需要的主體施用的藥劑靶向(例如抑制或拮抗)胃泌素和/或胃泌素受體，例如胃泌素或胃泌素受體拮抗劑。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，施用的藥劑靶向CCK2受體。在某些方面，本發(fā)明提供的實(shí)施例涉及激素胃泌素直接或間接地調(diào)節(jié)骨形成，因此提高了隨之而來的與骨質(zhì)疏松性改變一致的骨病理生理學(xué)的骨質(zhì)流失的證明(見圖57)。在某些方面，在本發(fā)明中提供的實(shí)施例涉及阻斷該胃泌素的作用(例如，使用靶向CCK2受體的胃泌素拮抗劑)在骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型中具有有益的效果，因此在骨質(zhì)疏松癥和其他骨疾病和病情的治療、預(yù)防和改善中有用的證明。因此，在一些實(shí)施例中提供的為在骨疾病和病情(例如臨床、病理或影像上的特征為骨質(zhì)疏松癥)中的胃泌素拮抗劑的方法、化合物和用途，例如拮抗胃泌素活性的藥劑。在某些方面，方法和用途涉及包括疾病和病情的疾病和病情的治療、改善和/或預(yù)防。在某些方面，提供的為用于使用靶向胃泌素和/或胃泌素受體的藥劑(例如胃泌素拮抗劑)治療、改善骨(例如特征為骨質(zhì)疏松癥的那些)疾病/病情的方法和組合物，例如，在i)老年人(男性或女性)；ii)患有卵巢功能下降或卵巢功能衰竭的女性；iii)患有高胃泌素血癥的個(gè)體，包括患有天生高胃泌素血癥(例如，腫瘤高胃泌素血癥與胃粘膜萎縮相關(guān)的高胃泌素血癥)和/或發(fā)生抑酸藥物的使用后果的高胃泌素血癥(例如，藥劑的分類，包括全質(zhì)子泵抑制劑或所有短期或長期起作用的組胺兩種受體拮抗劑的分類)和/或iv)胃切除手術(shù)的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，使用胃泌素靶向藥劑(例如胃泌素拮抗劑，如胃泌素靶向或胃泌素受體靶向藥劑；例如胃泌素或胃泌素受體拮抗劑，如靶向CCK2受體的藥劑)進(jìn)行治療、改善和/或預(yù)防。在一些實(shí)施例中，提供的為用于通過向主體施用胃泌素或胃泌素受體靶向藥劑治療或預(yù)防主體中骨疾病或病情的方法、用途和藥劑，因此治療或預(yù)防疾病或病情或其進(jìn)展。在一些實(shí)施例中，胃泌素或胃泌素受體靶向藥劑為胃泌素拮抗劑或胃泌素受體拮抗劑，例如選擇性胃泌素受體拮抗劑，例如選擇性的CCK2受體拮抗劑，如不能拮抗其他受體或其他胃泌素受體的一種。選擇性的CCK2受體拮抗劑的示例為YF476。在一些實(shí)施例中，骨疾病或病情是特征為骨質(zhì)疏松癥的疾病或病情，例如，已經(jīng)在臨床上、病理上或放射學(xué)上被定性為骨質(zhì)疏松癥的一種。在一些實(shí)施例中，主體為患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性。在其他方面，主體：(a)為患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性，(b)患有高胃泌素血癥。在一些方面，主體：(a)為患有有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性，(b)患有高胃泌素血癥，(c)已經(jīng)經(jīng)歷了胃切除。在一些方面，主體患有天然的高胃泌素血癥，該高胃泌素血癥為腫瘤高胃泌素血癥或與抑酸藥物相關(guān)的高胃泌素血癥，例如用質(zhì)子泵抑制劑或組胺2受體給藥。在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括與胃泌素或胃泌素靶向藥劑一起同時(shí)或以任何順序地向主體施用質(zhì)子泵抑制劑或組胺2受體拮抗劑。在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括同時(shí)或以任何順序施用藥劑治療另一種骨質(zhì)疏松癥。在一些實(shí)施例中，用于治療有需要的主體中的與高胃泌素血癥有關(guān)的骨疾病或病情的方法包括向主體施用至少一劑治療上有效量的胃泌素受體靶向藥劑，從而治療與高胃泌素血癥有關(guān)的骨疾病或病情。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括靜脈注射施用多劑胃泌素受體靶向藥劑。在另一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括口服施用多劑胃泌素受體靶向藥劑。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括特征為骨質(zhì)疏松癥的疾病或病情。在其他實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括施用選擇性CCK2受體拮抗劑。在另一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括施用選擇性CCK2受體拮抗劑YF476。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括患有卵巢功能下降或卵巢衰竭的女性的主體。在其他實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括：(a)患有卵巢功能下降或卵巢衰竭女性以及(b)患有高胃泌素血癥的主體。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括(a)患有卵巢功能下降或卵巢衰竭女性；(b)患有高胃泌素血癥；(c)已經(jīng)經(jīng)歷了胃切除。而在另一些實(shí)施例中，高胃泌素血癥為腫瘤高胃泌素血癥或與抑酸藥物相關(guān)的高胃泌素血癥。在其他實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括與治療上有效量的質(zhì)子泵抑制劑(PPI)或組胺2受體(H2R)拮抗劑同時(shí)或以任何順序一起施用選擇性胃泌素受體靶向藥劑。而在另一實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括，其中PPI為奧美拉唑，H2R拮抗劑為拉伏替丁(loxtidine)。在其他實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括以0.2-14μg/kg的主體體重施用治療上有效量的胃泌素受體靶向藥劑。在另外的實(shí)施例中，胃泌素受體靶向藥劑的治療上有效量為10-25納摩爾。在一些實(shí)施例中，通過皮下注射向主體施用胃泌素受體靶向藥劑。在另一些實(shí)施例中，通過靜脈注射向主體施用胃泌素受體靶向藥劑。在一些實(shí)施例中，以每日片劑20-100mg的劑量向主體口服施用胃泌素受體靶向藥劑。本發(fā)明還提供了藥劑和組合物，例如在提供的方法中使用的制藥組合物和試劑盒，例如包括胃泌素和胃泌素受體靶向藥劑的藥劑和組合物，例如拮抗劑和含有所述拮抗劑的試劑盒，所述拮抗劑和試劑盒帶有向這些主體施用拮抗劑的說明書。附圖說明圖1是顯示骨重塑的調(diào)節(jié)子的圖。卵巢功能(和雌性激素分泌)與骨維護(hù)成正相關(guān)。維生素D被認(rèn)為是對(duì)其的補(bǔ)充，然而，低的維生素D與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)，這可能是維生素D受體突變沒有與增加的骨折風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的附帶現(xiàn)象。甲狀旁腺產(chǎn)生的PTH負(fù)面地調(diào)節(jié)骨生理，通過低水平的循環(huán)鈣放大的效果。雌性激素拮抗PTH的負(fù)影響。雖然胃激素的作用還不清楚，但是已知胃切除會(huì)增加骨質(zhì)流失。這被認(rèn)為是反映了酸的損失，以及由此引發(fā)的鈣攝入的降低。圖2顯示了骨生理和結(jié)構(gòu)以及強(qiáng)度測量。微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(MicroCT)和骨彎曲以及鋨攝入和PCR被用來評(píng)價(jià)不同動(dòng)物模型中的骨動(dòng)力學(xué)和骨質(zhì)疏松性特征。MicroCT評(píng)估了骨小梁和皮層骨的密度和體積?？梢赃M(jìn)行皮層骨的半徑和周長的測定。可以進(jìn)行骨的連接密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)以及剛度(所有結(jié)構(gòu)的測定)的計(jì)算。極慣性矩(pMOI)以及骨折和工作負(fù)荷確定潛在的骨強(qiáng)度。鋨攝入能夠確定成脂表型的改變，而PCR能評(píng)價(jià)骨活性中涉及的轉(zhuǎn)錄本活性。圖3為證實(shí)G細(xì)胞作為鈣傳感器的系列圖(3A-3D)。CaC12(4mM)刺激鈣內(nèi)流(FITC位移：>5倍向右–用流式細(xì)胞儀測量)，其在缺乏CaC12的情況下，沒有觀察到(3A)。劑量依賴性的CaC12刺激了胃泌素的釋放(EC50＝4.1mM，8倍)并通過采用鈣通道拮抗劑硝苯吡啶(lμm)的預(yù)培養(yǎng)被抑制(10分鐘)(3B)。該鈣介導(dǎo)的胃泌素分泌物與cAMP產(chǎn)物不相關(guān)(3C)，并且不能被PKA抑制劑H-89或MAPK抑制劑PD98059(0.1μM)抑制，這兩者都與cAMP/MAPK介導(dǎo)的胃泌素分泌物有關(guān)(3D)。相比之下，PI3K信號(hào)通路抑制劑渥曼青霉素(lnM)顯著地抑制了CaC12介導(dǎo)的胃泌素釋放。這些結(jié)果證明胃泌素分泌物與通過PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)換的被鈣通道調(diào)節(jié)的鈣傳感機(jī)制耦合。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未受刺激的細(xì)胞相比，*p<0.05，WORT：渥曼青霉素。圖4為顯示PTH刺激的G細(xì)胞功能的系列圖(4A-4D)。PTH刺激的胃泌素釋放了估計(jì)的EC50＝60nM的～8倍(4A)，通過用PKA抑制劑H-89(10μM)預(yù)培養(yǎng)10分鐘能夠抑制的效果(4B)。同樣劑量依賴性的PTH刺激了cAMP產(chǎn)生(E50＝4nM，250％)(4C)，通過H-89逆轉(zhuǎn)的應(yīng)答(預(yù)培養(yǎng)：10分鐘-10μM)(4D)。這些結(jié)果證實(shí)胃泌素分泌與PTH受體介導(dǎo)的PKA活性和cAMP信號(hào)耦合。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未受刺激的細(xì)胞或單獨(dú)的PTH相比，*p<0.05。圖5為證實(shí)鈣抑制G細(xì)胞功能的兩個(gè)圖(5A-5B)。降鈣素抑制了估計(jì)值為IC50＝l.9nM的胃泌素的釋放(～20％，5A)，通過采用PKA抑制劑H-89(10μM)的預(yù)培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)的效果。劑量依賴性的降鈣素抑制了cAMP產(chǎn)生(I50＝3.8nM，20％)(5B)。這些結(jié)果證實(shí)胃泌素分泌與降鈣素受體介導(dǎo)的PKA抑制cAMP信號(hào)耦合。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未受刺激的相比，*p<0.05；與降鈣素介導(dǎo)的抑制相比，#p<0.05。圖6為證實(shí)雌激素抑制G細(xì)胞功能的系列圖(6A-6C)。G細(xì)胞表達(dá)ESRα轉(zhuǎn)錄本(6A)，17β-雌二醇抑制cAMP的合成(IC50＝1.1x10-12M，-15％)和胃泌素的釋放(IC50＝4.6x10-12M，～20％)(6B)。此外，采用該ESRα拮抗劑的預(yù)培養(yǎng)抑制了MAPK的磷酸化(75％，6C)。這些結(jié)果確認(rèn)胃泌素分泌通過雌激素受體α介導(dǎo)的PKA/cAMP產(chǎn)生和MAPK信號(hào)發(fā)出而被抑制。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與單獨(dú)的17β-雌二醇(1nM)相比，*p<0.05。圖7為G細(xì)胞調(diào)節(jié)的模型。含有直接或非直接的膳食鈣的魯米諾藥劑通過腺苷酸環(huán)化酶的活化(AC)(通過與導(dǎo)致胃泌素分泌的Gas耦合)誘導(dǎo)ERK磷酸化。PTH通過耦合PTH1受體的G蛋白也通過這種途徑刺激胃泌素的釋放。ERK磷酸化可正影響Ca2+的流入，其通過飲食直接被增加。L型鈣通道同樣地通過激活PKC調(diào)節(jié)分泌。胃泌素分泌的抑制劑包括降鈣素(通過cAMP的抑制)以及激活ERα來抑制cAMP和MAPK通路的雌性激素。AC：腺苷酸環(huán)化酶；GAS：胃泌素；PDK：磷酸肌醇依賴性蛋白激酶；PKA：蛋白激酶A；虛線反映的是抑制，實(shí)線反映的是刺激。圖8是顯示人類PTH分泌的胃泌素刺激的兩個(gè)圖(8A-8B)。胃泌素(CCK2)和組胺(H1)的受體在從臨床手術(shù)切除中分離的PTH主細(xì)胞中被表達(dá)(8A)。這些細(xì)胞表達(dá)高水平(3倍)的PTH(5A)。胃泌素刺激了PTH的合成(EC50＝10-9M，40％)和釋放(EC50＝4.2x10-10M，50％)(8B)。這些結(jié)果證明PTH的合成和分泌與胃泌素受體(CCK2)介導(dǎo)的活性耦合。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。圖9為顯示胃泌素刺激甲狀腺C細(xì)胞(MTC-SK)功能的系列圖(9A-9D)。胃泌素刺激的cAMP產(chǎn)生(EC50＝6.7x10-13M，～5倍)通過選擇性CCK2受體拮抗劑YF476逆轉(zhuǎn)(9A)。YF476單獨(dú)沒有顯著的效果。胃泌素對(duì)cAMP的刺激效應(yīng)可通過采用PKA抑制劑H-89(l0μM)的預(yù)培養(yǎng)被抑制(9B)。降鈣素分泌物被胃泌素劑量依賴性地影響，由YF476逆轉(zhuǎn)的效果(9C)。胃泌素(0.1nM)刺激(～3倍)降鈣素基因的轉(zhuǎn)錄，由采用H-89(10μM)的預(yù)培養(yǎng)的逆轉(zhuǎn)效果(9D)。CCK2受體的表達(dá)沒有被H-89抑制(9D)。這些結(jié)果確定了降鈣素的合成和釋放由胃泌素受體(CCK2)介導(dǎo)的PKA活性和cAMP信號(hào)調(diào)節(jié)。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未受刺激的相比，#p<0.05；與單獨(dú)的胃泌素(0.1nM)相比，*p<0.05。圖10是顯示胃泌素對(duì)PTH以及MTC-SK的合成和分泌的影響–共培養(yǎng)模型系統(tǒng)的圖示(10A)、顯微照片(10B)和系列圖(10C-10F)。從手術(shù)樣品中分離的人類PTH細(xì)胞與MTC-SK細(xì)胞系共培養(yǎng)。在圖10A中包括清晰說明細(xì)胞定位和靶標(biāo)位點(diǎn)的圖，而顯微照片展示了這些細(xì)胞類型中的每一種的生長(10B)。將胃泌素添加到共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著地刺激了PTH的轉(zhuǎn)錄(～75％，10C)和分泌(～60％，10D)。這些效果可被采用選擇性CCK2受體拮抗劑YF476(l0nM)的預(yù)培養(yǎng)(10分鐘)逆轉(zhuǎn)。相比之下，胃泌素抑制了降鈣素的轉(zhuǎn)錄(基底的–10E)和釋放(～70％-10F)。這些結(jié)果確定了胃泌素在模型系統(tǒng)中的基本影響是刺激PTH以及抑制降鈣素。相比之下，后一種影響與在單培養(yǎng)(單獨(dú)的MTC-SK細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)中的胃泌素的刺激效應(yīng)形成對(duì)照。CON＝對(duì)照，GAS＝胃泌素(10-10M)，G+INH＝胃泌素+YF476(10-11M)。PET＝聚酯膜(0.4mm)。平均值±SEM，n＝3。與對(duì)照相比，*p<0.05(未受刺激的)；與胃泌素(10-10M)相比，**p<0.05。圖11為顯示CCK2受體在分離的骨源細(xì)胞和骨中的表達(dá)的圖(11A)和一系列的顯微照片(11B-11H)。CCK2受體的轉(zhuǎn)錄本水平在顱骨的成骨細(xì)胞、hFOB細(xì)胞系(hFOB)中以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)中被確定(11A)。使用免疫組織化學(xué)法，在骨骺板(EP)中以及在骨髓細(xì)胞(箭頭)中確定(11B，11C–100x放大)特異免疫染色。參與軟骨內(nèi)骨化的細(xì)胞表達(dá)受體(11D、E、F)，成骨細(xì)胞也如此(11F)。有CCK2R陽性的成骨細(xì)胞沿骨內(nèi)膜排列成行(11G)以及在愈合骨骼中(11H)的證據(jù)。我們解釋這些結(jié)果以表明CCK2R在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)骨髓細(xì)胞中表達(dá)，并且CCK2R參與調(diào)節(jié)骨化和骨骼愈合。靶向受體可能調(diào)節(jié)這些現(xiàn)象。CCK2R免疫染色＝棕色細(xì)胞(DAB)，復(fù)染色＝蘇木精。11D-H：放大率＝400x。圖12是顯示在人骨骨髓樣品中胃泌素/CCK2表達(dá)的照片(12A)、序列分析(12B)、以及照片(12C)。標(biāo)準(zhǔn)PCR鑒定出源于動(dòng)脈粥樣硬化誘導(dǎo)的肢體缺血(沒有骨髓炎的證據(jù))的切除中分離的皮層骨骨髓樣品中的～320個(gè)堿基對(duì)(箭頭)(12A)。序列分析(BioEdit)鑒定出與典型的CCK2基因具有92％同源性(12B)。蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)了在研究的10個(gè)樣品中表達(dá)CCK2(箭頭–50kD)(12C)。圖13為展示胃泌素和靶向CCK2在骨源細(xì)胞增殖上的影響的一組圖(13A和13B)。在所有的細(xì)胞類型中，胃泌素以EC50＝1-2x10-11M劑量依賴性地刺激BrdU攝入(13A)。這不會(huì)被選擇性的CCK2受體拮抗劑YF476逆轉(zhuǎn)，這確實(shí)看似增加了增殖，特別是在BMMSC中(13B)。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未受刺激的相比，*p<0.05；與胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。圖14為展示胃泌素和靶向CCK2在骨源細(xì)胞礦化上的影響的一組圖(14A和14B)。在所有的細(xì)胞類型中，胃泌素以IC50＝3.2x10-11–1.3x10-10M劑量依賴性地抑制骨礦化(用Ostemalge測定)(14A)。這沒有被選擇性CCK2受體拮抗劑YF476逆轉(zhuǎn)，這增加了增殖，特別是在顱骨的成骨細(xì)胞中(14B)。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未被受刺激的相比，*p<0.05；與胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。圖15為展示胃泌素和靶向CCK2在骨源細(xì)胞基因表達(dá)上的影響的一組圖。在所有的細(xì)胞類型中，胃泌素(1nM)抑制了成骨細(xì)胞分化基因、堿性磷酸酶(ALKP)的表達(dá)(頂行)。這被選擇性CCK2受體拮抗劑YF476(1nM)逆轉(zhuǎn)。在成骨細(xì)胞中，胃泌素還抑制了M-CSH和RANKL，其被YF476正常化了(底行)。平均值±SEM(n＝4次實(shí)驗(yàn))。與未被受刺激的相比，*p<0.05，與胃泌素(0.1nM)相比，#p<0.05。圖16展示了在乳鼠屬(Mastomys)模型中，短期和慢性高胃泌素血癥對(duì)循環(huán)激素水平的影響。在處理的第8周(～2倍)和第16周(～3.5倍)顯著升高了胃泌素水平。在短和長期高胃泌素的動(dòng)物中，雌性激素(雌二醇)均下降了(～50％)。PTH在第8周顯著地升高了(～75％)，但是在第16周顯著地減少了(～3倍)。這些結(jié)果證明在活體內(nèi)模型中短期的高胃泌素血癥抑制了雌性激素的釋放和PTH分泌物的相互活化。長期高胃泌素血癥還與雌二醇的降低有關(guān)，但這并不導(dǎo)致PTH升高。后者的機(jī)理還不清楚，但可能顯示了暴露于長期胃泌素刺激的甲狀旁腺中CCK2受體或其信號(hào)應(yīng)答的下調(diào)。平均值±SEM，與對(duì)照動(dòng)物相比，*p<0.05。與8周處理的動(dòng)物相比，#p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖17是顯示鈣軸相關(guān)受體PTH1R、ERα和CaSR在乳鼠屬模型的胃中的表達(dá)的一對(duì)圖(17A和17B)和照片(17C)。來自正常(n＝4)的胃粘膜的PCR和蛋白印跡法的結(jié)果分別與用拉伏替丁處理8周(n＝4)和16周(n＝5)的動(dòng)物相比。在底部，短期(8周)和長期(16周)高胃泌素血癥均顯著增加了HDC，但分別降低了PTH1R和Erα表達(dá)(17A)。在竇部，高胃泌素血癥與胃泌素轉(zhuǎn)錄的顯著增加以及PTH1R、ERα和CaSR表達(dá)的提高有關(guān)(17B)。這些影響在長期高胃泌素血癥中更為明顯。在蛋白水平上總結(jié)了RNA的影響(蛋白質(zhì)印跡法–17C)。特別是，PTH1R表達(dá)在底部降低了(F)但在竇部增加了(A)–頂部板。竇的ERα表達(dá)在16周被提高了(中部板)CaSR也提高了(底部板)。這些結(jié)果證明底部和竇部應(yīng)答與鈣骨軸相關(guān)的受體的差異合成和表達(dá)的短期和長期的高胃泌素血癥。特別是，功能受體在胃的組胺合成部分(底部)下調(diào)，但是這些在胃泌素分泌(竇部)的胃部是增加的。在一些方面，這反映了竇部以及鈣敏G細(xì)胞的致敏性。平均值±SEM，與對(duì)照(未受處理的)動(dòng)物相比，*p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖18展示了在甲狀旁腺和甲狀腺中CCK2受體的表達(dá)。CCK2受體的免疫染色確定了甲狀旁腺內(nèi)的甲狀旁腺細(xì)胞大部分為CCK陽性(不同的染色反映了膜結(jié)合的表達(dá)[箭頭]和細(xì)胞核]18A)。在甲狀腺內(nèi)，單個(gè)C細(xì)胞可通過CCK2抗體染色來確定(染色反映了膜結(jié)合的表達(dá)[箭頭]-18B、18C(下方的兩個(gè)箭頭))。相比之下，乳鼠屬甲狀腺內(nèi)的滲透免疫細(xì)胞為CCK2陰性(上面的三個(gè)箭頭，藍(lán)色的僅為核)(18C)。這些結(jié)果展示了在PTH和甲狀腺細(xì)胞中CCK2受體的膜表達(dá)。這與顯示胃泌素對(duì)從這些結(jié)構(gòu)中分離的細(xì)胞的影響的活體外結(jié)果一致。核染色＝DAPI，其他染色＝FITC標(biāo)記的CCK2。購自Abeam的抗體(ab14439，兔多克隆，1:100稀釋)。圖19顯示了用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(microCT)測定的在短期和長期高胃泌素性動(dòng)物模型中的骨小梁變化。骨體積(19A)以及骨體積與骨小梁體積的比例(19B)在短期和長期的高胃泌素性動(dòng)物中降低了，但是在短期處理的動(dòng)物中這一點(diǎn)更明顯(50％比30％)。兩種密度表觀密度(19C)和組織密度(19D)的測量在兩個(gè)胃泌素群組中顯著地降低了(～100％)。連接密度(每單位體積骨小梁的數(shù)量的測定)在長期高胃泌素群組中顯著地降低了(～60％)(19E)。短期胃泌素與從更像板狀的結(jié)構(gòu)(SMI接近0)到更像桿狀的結(jié)構(gòu)(SMI增加>1)的骨的轉(zhuǎn)換相關(guān)(19F)。這在長期高胃泌素性動(dòng)物中沒有那么明顯。這些結(jié)果證明胃泌素顯著地改變了乳鼠屬模型的骨表型。這些改變與“骨質(zhì)疏松”表型一致。BV＝骨體積，TV＝骨小梁體積，ConnDens＝連接密度，SMI＝結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(桿狀：板狀幾何比的測定)。平均值±SEM，與對(duì)照動(dòng)物相比，*p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖20為顯示基于鋨染色的骨脂肪組織活化的一系列照片。脂肪細(xì)胞攝取鋨并在骨中易于識(shí)別。對(duì)照動(dòng)物(右股骨，n＝5，上部板)主要顯示出在脛骨骨骺中的鋨攝取。短期高胃泌素性動(dòng)物也顯示出在骨骺中的鋨攝取，但在干骺端中顯著的攝取也被注意到(n＝5，底板)。這些結(jié)果與脂肪組織的胃泌素活化以及“老化”表型一致。圖21為顯示來自對(duì)照、8周和16周拉伏替丁處理的乳鼠屬的甲苯胺藍(lán)、TRAP染色的股骨的一系列的顯微照片，證明骨礦化和吸收腔的模式。一方面，拉伏替丁處理后的動(dòng)物中的改變反映了骨礦化的流失和增加的吸收——與骨質(zhì)疏松癥的表型一致的特征。BM＝骨礦化，RC＝吸收腔。圖22是顯示乳鼠屬模型中的microCT和碎骨比較的系列圖(22A-22C)。用伺服液壓測試機(jī)器(Instronmodel8874)載荷至失效(四點(diǎn)彎曲)。注意到在骨的剛度和骨折載荷之間存在顯著相關(guān)性(R2＝0.86，p<0.01)(22A)，表明增加骨的剛度將需要更大的骨折載荷。我們評(píng)價(jià)了骨屈伸和骨小梁和皮質(zhì)密度的microCT測定之間的關(guān)系。這些確定了骨小梁密度與使骨斷裂所需的力呈負(fù)相關(guān)(R2＝-0.54)(22B)，而增加皮質(zhì)密度與較高的骨折載荷相關(guān)(R2＝0,71，22C)。這些結(jié)果證明在該模型中，使骨頭骨折需要的機(jī)械力與骨結(jié)構(gòu)和密度相關(guān)，并且這兩種方法的結(jié)合提供了生理上相關(guān)的信息。N＝7只動(dòng)物，uCT＝microCT。圖23為總結(jié)在乳鼠屬模型中胃泌素介導(dǎo)的變化的圖表。與對(duì)照(未受處理、正常飲食的動(dòng)物)相比，短期的拉伏替丁處理提高了循環(huán)的胃泌素和PTH，但減少了雌二醇。這與降低的骨密度和骨質(zhì)疏松性表型有關(guān)。在胃中，PTH1R的表達(dá)被上調(diào)，而ERα降低。在鈣敏受體(CaSR)中沒有檢測到變化。與對(duì)照相比，長期的拉伏替丁處理提高了循環(huán)的胃泌素，但減少了PTH以及雌二醇。這與降低的骨密度和骨質(zhì)疏松癥性表型有關(guān)。在胃中，PTH1R、ERα和CaSR的表達(dá)被上調(diào)，與鈣代謝表型的活化一致。8周＝8周的拉伏替丁處理，16周＝16周的拉伏替丁處理，骨d＝骨密度測定，Osteo＝骨質(zhì)疏松性表型。圖24為顯示在乳鼠屬模型中胃泌素介導(dǎo)的骨表型改變的總結(jié)圖。與對(duì)照(未受處理，正常飲食的動(dòng)物)相比，短期處理的動(dòng)物顯示出提高的循環(huán)胃泌素和PTH，但是降低的雌二醇。這與降低的骨密度和骨質(zhì)疏松性表型(包括具有低扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度的弱骨(weakbone))有關(guān)。在長期處理的動(dòng)物中，注意到提高的循環(huán)胃泌素，但是PTH和雌二醇都降低了。這與降低的骨密度以及以弱但硬的骨骼為特征的骨質(zhì)疏松性表型有關(guān)。pMOI＝極慣性矩(ploarmomentofinertia)，PTH＝甲狀旁腺激素。圖25是顯示在乳鼠屬模型中卵巢切除術(shù)對(duì)短期和長期高胃泌素血癥介導(dǎo)的循環(huán)PTH水平的影響的圖。卵巢切除術(shù)增加了PTH水平～100％。短期高胃泌素血癥同樣地提高了PTH水平。這在OVX/8周處理的動(dòng)物中增加了(高出對(duì)照300％)。長期胃泌素處理顯著地降低了～60％的水平。卵巢切除術(shù)逆轉(zhuǎn)了這種情況，使PTH水平正?；?。這些結(jié)果證實(shí)了卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的PTH釋放的活化(與雌激素?fù)p失一致)并且在活體內(nèi)模型中這通過短期高胃泌素血癥被放大。長期高胃泌素血癥出現(xiàn)減少了PTH釋放，在切除卵巢的動(dòng)物中也看到了這種效果。機(jī)制可反映在暴露于長期胃泌素刺激的PTH腺中的CCK2受體或其信號(hào)應(yīng)答的下調(diào)。這種效果抵消了雌激素的損失，表明胃泌素在PTH腺功能中可能起到作用。平均值±SEM，與對(duì)照動(dòng)物相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，#p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖26是顯示正常的和高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型的胃中神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄的表達(dá)的一系列的圖(26A-26D)。比較來自正常(n＝11)、切除卵巢(OVX，n＝8)的乳鼠屬(頂部)以及OVX和短期(n＝4)和長期(n＝4)高胃泌素性動(dòng)物(底部)胃粘膜的PCR結(jié)果。卵巢切除術(shù)顯著地增加了胃粘膜CgA(4倍)和HDC(～6倍)的表達(dá)(26A)。短期和長期高胃泌素血癥對(duì)OVX介導(dǎo)的CgA合成都沒有額外的影響(2.8-4.2倍相比于4.3倍)(26B)。短期高胃泌素血癥提高了胃泌素的表達(dá)(～40倍–26C)和HDC(～40倍-26D)。長期高胃泌素血癥提高了胃泌素和HDC，但對(duì)于ECL細(xì)胞源的HDC表達(dá)的效果最明顯(～45倍-26D)。這些結(jié)果證實(shí)了雌性激素調(diào)節(jié)HDC的ECL細(xì)胞轉(zhuǎn)錄(從而組胺合成)，并且胃泌素的合成被雌性激素相似的調(diào)節(jié)。循環(huán)的胃泌素進(jìn)一步上調(diào)表達(dá)。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。與OVX相比，#p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖27是顯示在正常飲食的乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型的胃中鈣軸相關(guān)受體PTH1R、ERα和CaSR的表達(dá)的圖。比較來自正常的和切除卵巢的(OVX)乳鼠屬的胃粘膜的PCR結(jié)果。卵巢切除術(shù)增加了雄性激素受體(～6-倍)以及兩種雌性激素受體(ESR1和ESR2，都是～4倍)的胃粘膜表達(dá)。CaSR和PTH1R也通過雌性激素的損失增加了(分別為5和4倍)。這些結(jié)果證實(shí)了雌性激素的損失與鈣敏和甲狀旁腺：卵巢軸相關(guān)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)相關(guān)。循環(huán)胃泌素進(jìn)一步上調(diào)表達(dá)。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。CON＝假手術(shù)對(duì)照動(dòng)物(n＝11)，OVX＝卵巢切除術(shù)(n＝8)。AR＝雄性激素受體，ESR＝雌激素受體，CaSR＝鈣敏受體，PTH1R＝甲狀旁腺1型受體。圖28是顯示在高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型的胃中的鈣軸相關(guān)受體PTH1R、AR、ERα和CaSR的表達(dá)的系列圖(28A-E)。來自O(shè)VX和短期(n＝4)以及長期(n＝4)高胃泌素性O(shè)VX動(dòng)物的胃粘膜的PCR結(jié)果。在雄性激素受體中卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的升高在短期和長期高胃泌素性動(dòng)物中被正?；诙唐趧?dòng)物中效果更明顯(28A)。對(duì)兩種雌性激素受體注意到相似的結(jié)果(28B，C)。CaSR(28D)和PTH1R(28E)被高胃泌素血癥顯著的降低了。這些結(jié)果確定鈣：骨軸相關(guān)受體的表達(dá)被短期和長期高胃泌素血癥正?；?，所述表達(dá)通過卵巢切除術(shù)在胃粘膜中上調(diào)。這反映了在高胃泌素環(huán)境中調(diào)節(jié)或重新調(diào)整鈣敏的生理學(xué)嘗試的。平均值±SEM，與切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05；與短期高胃泌素性動(dòng)物相比，#p<0.05。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。AR＝雄性激素受體，ESR＝雌激素受體，CaSR＝鈣敏受體，PTH1R＝甲狀旁腺1型受體。圖29是顯示骨小梁和皮層骨的微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(microCT)的一系列的截圖(29A-H)。與對(duì)照骨相比(29A)，切除卵巢的動(dòng)物的骨小梁骨顯示出顯著的損失。短期(29C)和長期(29D)高胃泌素血癥都在這方面降低了，在長期高胃泌素性動(dòng)物中該效果更明顯。在皮層骨中，卵巢切除術(shù)分別與來自正常的、切除卵巢的(OVX)和用拉伏替丁處理8周和16周的OVX動(dòng)物的骨小梁和皮層骨的圖像相關(guān)。骨質(zhì)流失，特別是在股骨的骨小梁區(qū)域隨著OVX被注意到。在一些方面，這可被胃泌素升高來增加。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖30是顯示在正常和高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型中骨小梁和皮層骨的MicroCT測量的一系列的圖表(30A-D)。與正常的動(dòng)物相比，骨小梁密度被卵巢切除術(shù)顯著的降低了(～50％)(30A)。這被長期高胃泌素血癥放大了(85％)。骨小梁體積也被卵巢切除術(shù)顯著地降低了(～50％)(30B)。這被長期高胃泌素血癥放大了(～70％)。皮層骨密度沒有被卵巢切除術(shù)降低，但在長期高胃泌素性動(dòng)物中明顯地降低了(～5％，30C)。皮層體積被卵巢切除術(shù)顯著地降低了(～30％)(30D)。這被短期高胃泌素血癥放大了(～30％)。這些結(jié)果證明在卵巢切除術(shù)模型中胃泌素放大了骨質(zhì)流失，并導(dǎo)致與骨質(zhì)疏松性表型一致的microCT特征。長期高胃泌素血癥的影響主要反映在骨小梁改變中。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖31是顯示正常和高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型中皮層骨的骨內(nèi)和骨膜尺寸的MicroCT測量的一系列的圖表(31A-D)。相比于正常動(dòng)物，卵巢切除術(shù)顯著降低了骨內(nèi)半徑(～20％)(31A)。這被短期高胃泌素血癥顯著地放大了(30％)。骨內(nèi)周長被卵巢切除術(shù)顯著地降低了(～18％)(31B)。這被短期高胃泌素血癥顯著地放大了(～27％)。同樣地，在切除卵巢的動(dòng)物中骨膜半徑減小了(～20％，31C)，效果被短期高胃泌素血癥顯著地放大了(～30％)。骨膜周長也被卵巢切除術(shù)降低了(～20％)，效果被短期高胃泌素血癥放大了(～30％)(31D)。這些結(jié)果證明胃泌素放大了皮層骨的尺寸，效果主要被短期高胃泌素血癥突出了。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖32是顯示來自切除卵巢的乳鼠屬中的甲苯胺藍(lán)、TRAP染色股骨的一對(duì)顯微照片，確定骨礦化和再吸收腔模式以及破骨細(xì)胞的數(shù)量和位置。紅色細(xì)胞表示TRAP染色，破骨細(xì)胞為紅色染色的多核細(xì)胞(黃色箭頭)。左板(100x放大)，右板(400x放大)。RC＝吸收腔。圖33是顯示來自正常和高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型的股骨的Instron4點(diǎn)彎曲結(jié)果的一系列的圖表(33A-D)。剛度被卵巢切除術(shù)增加了(～15％)，效果被長期高胃泌素血癥顯著地放大了(33A)。短期高胃泌素血癥與到正常水平的剛度的降低有關(guān)。使骨折斷的最大載荷在切除卵巢的動(dòng)物中顯著地降低了(～20％～33B)。高胃泌素血癥沒有改變這一點(diǎn)，但與短期動(dòng)物相比，長期高胃泌素性動(dòng)物需要更高的載荷來使骨折斷。相似地，骨折載荷在切除卵巢的動(dòng)物中被降低了(～25％)，并且沒有被胃泌素改變(33C)。然而，長期高胃泌素性動(dòng)物需要比短期高胃泌素性動(dòng)物更高的載荷來使骨折。使骨折斷需要的總功在切除卵巢的動(dòng)物被增加了(～20％)(33D)。而長期高胃泌素血癥沒有改變功，短期高胃泌素性動(dòng)物的骨需要少-50％的功來骨折。這些結(jié)果證明卵巢切除術(shù)之后的骨的強(qiáng)度被短期胃泌素(導(dǎo)致弱骨)和長期胃泌素(硬骨)差異地影響了。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖34是顯示正常和高胃泌素性乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型中骨的總強(qiáng)度的一系列的圖表(34A-E)。極慣性矩(pMOI)在切除卵巢的動(dòng)物中被顯著地降低了(25％，34A)。扭轉(zhuǎn)載荷失效(failure)的這一測定被短期高胃泌素血癥特別地?cái)U(kuò)大了(～50％)。pMOI與剛度(R2＝0.23–34B)、最大載荷(R2＝0.33–34C)和骨折載荷(R2＝0.3–34D)顯著相關(guān)。總功與pMOI不相關(guān)(34E)。這些結(jié)果證實(shí)了卵巢切除術(shù)之后骨的扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度降低了，并且短期胃泌素特別地放大了這一參數(shù)。剛度和最大/骨折載荷的總相關(guān)性是乳鼠屬卵巢切除術(shù)效果的反映。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。圖35是顯示源于正常飲食乳鼠屬卵巢切除術(shù)模型中的皮層源骨骨髓的骨重建相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的一系列的圖(35A-I)。比較來自正常的與切除卵巢的(OVX)乳鼠屬模型的骨髓細(xì)胞的PCR結(jié)果。卵巢切除術(shù)顯著地降低了ALOX5(35A-炎癥：～20％)和RUNX2(29B-成骨細(xì)胞的分化：～100％-35B)的表達(dá)，但沒有降低TCF4(35C–參與TGFβ介導(dǎo)的骨形成)、IGF-1(35D–骨形成)、PTGS2(35E–炎癥)或RANKL(35F–骨質(zhì)流失)的表達(dá)。在CXCL12(35G-成骨細(xì)胞活化：～20％)、PPARg(35H-脂肪細(xì)胞分化：～60％)和HIF-1a(35I-組織缺氧介導(dǎo)的骨損害：～250％)中注意到增加。這些結(jié)果證實(shí)了雌性激素的損失與骨髓源轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)有關(guān)，所述轉(zhuǎn)錄本涉及重建和骨質(zhì)流失。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。CON＝假手術(shù)對(duì)照動(dòng)物(n＝11)，OVX＝卵巢切除術(shù)(n＝8)。圖36是顯示在切除卵巢的乳鼠屬模型中胃泌素介導(dǎo)的骨表型改變的圖表。與單獨(dú)的卵巢切除術(shù)(正常飲食的動(dòng)物，降低的雌性激素，升高的PTH和骨質(zhì)疏松癥特征例如硬、弱骨)相比，短期高胃泌素性動(dòng)物顯示出與低扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度的較弱的骨頭有關(guān)的降低的皮質(zhì)層特征。該表型比在單獨(dú)的卵巢切除術(shù)中更明顯。在長期高胃泌素性動(dòng)物(顯示出正常的PTH)中，注意到導(dǎo)致顯著的硬骨的骨小梁損傷。該表型比在單獨(dú)的卵巢切除術(shù)中更明顯。pMOI＝極慣性矩，PTH＝甲狀旁腺激素。圖37是顯示在切除卵巢的小鼠模型中的循環(huán)激素水平上胃泌素敲除(knockout)、組氨酸脫羧酶敲除(knockout)或雙敲除(doubleknockout)的效果的一系列圖。雌性激素水平在所有的動(dòng)物中被卵巢切除術(shù)顯著地降低了～50％。胃泌素水平?jīng)]有被卵巢切除術(shù)影響，但與胃泌素KO或雙KO的動(dòng)物相比，HDCKO的動(dòng)物表達(dá)升高了～3倍。PTH在胃泌素KO的動(dòng)物中被顯著地降低了(～80％)。相比之下，卵巢切除術(shù)之后，在HDC和雙KO的動(dòng)物中水平被顯著地增加了(～100％)。這些結(jié)果證明雌性激素?fù)p失沒有活化胃泌素KO的動(dòng)物中的PTH釋放。這表明胃泌素改變了甲狀旁腺中的雌性激素的功能。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。G＝胃泌素KO，GH＝胃泌素/HDC雙KO，H＝HDCKO，KO＝敲除，N＝?jīng)]有卵巢切除術(shù)，O＝卵巢切除術(shù)。圖38是顯示在切除卵巢的小鼠敲除模型的胃中的神經(jīng)內(nèi)分泌和鈣敏受體的表達(dá)的一系列的圖。在底部，胃泌素KO和卵巢切除術(shù)的組合顯著地增加了CCK2(ECL細(xì)胞的胃泌素響應(yīng)性：～3倍)和HDC(ECL組胺合成：～20倍)。相比之下，在切除卵巢的HDCKO的小鼠的底部沒有看到變化。在竇部，CaSR在切除卵巢的胃泌素KO小鼠中被顯著地降低了(～60％)，而CaSR(～60％)以及胃泌素自身的表達(dá)(～70％)在切除卵巢的HDCKO的小鼠中都降低了。一方面，這反映了在胃泌素敲除的動(dòng)物中卵巢切除術(shù)和雌性激素的損失顯著地活化了ECL細(xì)胞以及降低了G細(xì)胞的鈣敏應(yīng)答。在HDCKO的動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)對(duì)竇部的影響是有限的。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。G＝胃泌素KO，H＝HDCKO，KO＝敲除，N＝?jīng)]有卵巢切除術(shù)，O＝卵巢切除術(shù)。圖39是顯示在切除卵巢的小鼠模型中的皮層和骨小梁測量的MicroCT測量的一系列圖(39A-F)。在胃泌素KO的動(dòng)物中，骨內(nèi)半徑(39A)和周長(39B)在卵巢切除術(shù)后被顯著地增加了(～30％)。這反映了雌性激素?fù)p失和胃泌素缺乏的組合增加了皮層骨的厚度。在這些環(huán)境中，胃泌素的損失沒有負(fù)面影響骨頭。在HDCKO的動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)顯著地降低了皮層骨的體積(～25％-39C)，但導(dǎo)致了具有較高扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度的骨骼(39D)。這確定了組胺的損失加重了雌性激素對(duì)骨骼的影響。雙KO也與骨小梁(～50％-39E)和皮層骨體積(～15％-39F)的減小有關(guān)，但這沒有轉(zhuǎn)變?yōu)轱@著的骨弱。這確定了雖然在骨表型中有一些變化，但是胃泌素和組胺的損失的結(jié)合沒有顯著地改變骨的生物學(xué)。G＝胃泌素敲除，GH＝胃泌素/HDC雙敲除，H＝HDC敲除，N＝?jīng)]有卵巢切除術(shù)，O＝卵巢切除術(shù)。圖40是顯示在敲除小鼠卵巢切除術(shù)的模型中的皮層源骨髓中的骨重建相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的一系列圖表(40A-D)。比較來自非切除卵巢的與切除卵巢的小鼠的骨髓細(xì)胞的PCR結(jié)果。僅在胃泌素KO的動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)顯著地增加了ALOX5(40A-炎癥：～100％)、CXCL12(40B-成骨細(xì)胞活化：～70％)、HIF-1a(40C-組織缺氧介導(dǎo)的骨損害：～5倍)和IGF-1(40D–骨形成：～100％)的表達(dá)。這些結(jié)果表明雌性激素和胃泌素的損失的結(jié)合與涉及重建的骨髓源的轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)有關(guān)。對(duì)沒有切除卵巢的動(dòng)物的值進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。平均值±SEM，與沒有切除卵巢的動(dòng)物相比，*p<0.05。G＝胃泌素敲除，GH＝胃泌素/HDC雙敲除，H＝HDC敲除，N＝?jīng)]有卵巢切除術(shù)，O＝卵巢切除術(shù)。圖41是顯示在切除卵巢的小鼠敲除模型中骨表型改變的概述圖表。盡管“前骨質(zhì)減少的”激素環(huán)境(雌性激素的損失，升高的PTH)，卵巢切除術(shù)之后的胃泌素敲除的動(dòng)物顯示出了骨內(nèi)特征和相對(duì)正常的骨表型的增加。HDCKO的小鼠，顯示出皮層體積減小，但骨頭變強(qiáng)了。雙KO在骨小梁和皮層特征中也顯示出一些變化——這些沒有導(dǎo)致改變骨的強(qiáng)度。盡管失去了卵巢功能以及PTH升高了，組合的損失(胃泌素和組胺二者)沒有導(dǎo)致骨表型異常。胃泌素降低似乎是對(duì)骨表型的保護(hù)。GAS＝胃泌素，pMOI＝極慣性矩，PTH＝甲狀旁腺激素。圖42是顯示在對(duì)照、切除卵巢和用胃泌素拮抗劑處理的卵巢切除術(shù)CD-1的小鼠中骨小梁的MicroCT測量的一系列圖。BV/TV比例、連接密度(Conn-Dens)、骨小梁的數(shù)量(TB.N)、骨表面和密度，都被卵巢切除術(shù)顯著地降低了。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁間距(Tb.Sp)也都增加了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了除骨小梁的厚度和間距之外的大部分的這些效果。這些結(jié)果證明選擇性抑制胃泌素受體減輕了卵巢切除術(shù)模型中的骨質(zhì)流失，并導(dǎo)致與正常表型一致的microCT特征。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖43是顯示在對(duì)照、切除卵巢和用胃泌素拮抗劑處理的卵巢切除術(shù)CD-1的小鼠中皮層骨的MicroCT測定的一系列的圖。皮層密度和骨表面(BS)都被卵巢切除術(shù)顯著地降低了。皮層厚度(Ct.TH)被增加了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了對(duì)密度的影響，但沒有改變厚度。這些結(jié)果證明選擇性抑制胃泌素受體逆轉(zhuǎn)了卵巢切除術(shù)模型中的皮層密度。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖44是顯示在對(duì)照、未受處理的和胃泌素拮抗劑處理的小鼠中的骨的綜合強(qiáng)度的一系列的圖。卵巢切除術(shù)顯著地降低了骨強(qiáng)度(包括剛度、屈服剛度、最大(max)載荷和折斷的骨折載荷)，以及增加了需要折斷骨頭的總功。采用胃泌素拮抗劑的處理逆轉(zhuǎn)了這些影響，除了載荷。這些結(jié)果確定了卵巢切除術(shù)之后，骨的強(qiáng)度被降低了，靶向胃泌素受體減輕了雌性激素?fù)p失介導(dǎo)的影響。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖45是顯示來自對(duì)照和用胃泌素拮抗劑(OVX+GA)或載體(OVX)處理的切除卵巢的CD-1小鼠的甲苯胺藍(lán)和TRAP染色的股骨的一系列的顯微照片。骨礦化(BM：降低)、再吸收腔(RC：增加)和破骨細(xì)胞(染色的多核細(xì)胞(兩個(gè)箭頭)：增加)的模式被OVX影響了。這些效果被藥物處理逆轉(zhuǎn)了。一方面，這意味著靶向CCK2受體使骨形態(tài)正?；?，與低的雌性激素水平無關(guān)。圖46是顯示胃泌素拮抗劑處理對(duì)切除卵巢小鼠的模型中的循環(huán)激素水平的影響的一系列的圖。雌性激素被卵巢切除術(shù)顯著地降低了，而PTH和胃泌素都被卵巢切除術(shù)升高了。胃泌素拮抗劑處理對(duì)PTH沒有影響，但使胃泌素水平正常化了。卵巢切除術(shù)增加了所有的三種骨標(biāo)記，PINP、CTX1和骨鈣素。胃泌素拮抗劑抑制了這些影響中的每一個(gè)。我們解釋這些結(jié)果以表明被卵巢切除術(shù)引起的骨活性標(biāo)記被靶向胃泌素受體正常化了。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖47是顯示對(duì)照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗劑處理的卵巢切除術(shù)CD的大鼠的骨小梁中的MicroCT測量的一系列的圖。BV/TV比、骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨表面和密度都被卵巢切除術(shù)顯著地降低了。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)和骨小梁間距(Tb.Sp)都增加了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了大多數(shù)的這些影響，除了SMI以外。這些結(jié)果證明選擇性的抑制胃泌素受體改善了卵巢切除術(shù)模型中的骨質(zhì)流失，并在CD大鼠中導(dǎo)致了與正常表型一致的microCT特征。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。與CON相比，平均值±SEM.*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖48是顯示在對(duì)照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗劑處理卵巢切除術(shù)CD的大鼠中皮層骨的MicroCT測量的一系列的圖。皮層密度和骨表面(BS)以及極慣性矩(pMOI)都被卵巢切除術(shù)顯著地降低了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了對(duì)密度的影響，并與BV/TV比的增加以及皮層厚(Ct.TH)度都有關(guān)。這些結(jié)果證明了選擇性地抑制胃泌素受體逆轉(zhuǎn)了卵巢切除術(shù)模型中的皮層密度損失。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖49是顯示對(duì)照、未受處理的以及胃泌素拮抗劑處理的大鼠中的骨的總強(qiáng)度的一系列圖。卵巢切除術(shù)顯著地降低了包括剛度、屈服剛度以及折斷骨折載荷的骨強(qiáng)度。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些影響。這些結(jié)果證實(shí)了隨著卵巢切除術(shù)，骨強(qiáng)度降低了，并且靶向胃泌素受體改善了這些雌性激素介導(dǎo)的效果。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8周＝短期高胃泌素血癥，16周＝長期高胃泌素血癥。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖50是顯示來自對(duì)照和用胃泌素拮抗劑(OVX+GA)或載體(OVX)處理的切除卵巢CD的大鼠的甲苯胺藍(lán)和TRAP染色的股骨的一系列的圖。骨礦化(不同程度地降低)、吸收腔(RC)(增加了)以及破骨細(xì)胞(染色的多核細(xì)胞(兩個(gè)箭頭)：增加了)的模式被OVX影響了。這些影響被藥物處理逆轉(zhuǎn)了。一方面，這反映了靶向CCK2受體使與低的雌性激素水平無關(guān)的骨形態(tài)正?；?。圖51是顯示胃泌素拮抗劑處理對(duì)切除卵巢的大鼠模型中的循環(huán)激素水平的影響的一系列的顯微照片。雌性激素被卵巢切除術(shù)顯著地降低了，而胃泌素被卵巢切除術(shù)升高了。胃泌素拮抗劑處理沒有顯著的影響。卵巢切除術(shù)增加了PINP和骨鈣素。胃泌素拮抗劑抑制了這些影響。一方面，這些結(jié)果證明了由卵巢切除術(shù)引起的骨活性標(biāo)記被靶向胃泌素受體正?；恕ON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖52是顯示在對(duì)照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗劑處理的卵巢切除術(shù)的乳鼠屬中的MicroCT測量的一系列的圖表。BV/TV比、骨小梁數(shù)量(TB.N)、密度和骨表面都被卵巢切除術(shù)顯著地降低了，而結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)和骨小梁間距(Tb.Sp)增加了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些影響，并與骨小梁厚度的增加有關(guān)(Tb.Th)。這些結(jié)果證明了在乳鼠屬中，選擇性地抑制胃泌素受體改善了卵巢切除術(shù)模型中的骨質(zhì)流失，并導(dǎo)致與正常的表型一致的microCT特征。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖53是顯示對(duì)照、切除卵巢的和用胃泌素拮抗劑處理的卵巢切除術(shù)乳鼠屬中的皮層骨的MicroCT測量的一系列的圖表。測定的類型沒有一個(gè)被卵巢切除術(shù)顯著地影響或者被胃泌素拮抗劑處理改變。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。圖54是顯示對(duì)照、未受處理的和胃泌素拮抗劑處理的乳鼠屬中的骨的總強(qiáng)度的一系列的圖。卵巢切除術(shù)顯著地降低了包括剛度、屈服剛度以及折斷的最大和骨折載荷的骨強(qiáng)度。并且使總功增加了。用胃泌素拮抗劑的處理逆轉(zhuǎn)了這些影響。這些結(jié)果證實(shí)了骨強(qiáng)度隨著卵巢切除術(shù)降低了，并且靶向胃泌素受體改善了這些雌性激素介導(dǎo)的影響。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，8wk＝短期高胃泌素血癥，16wk＝長期高胃泌素血癥。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖55是顯示來自對(duì)照和用胃泌素拮抗劑(OVX+GA)或載體(OVX)處理的切除卵巢的乳鼠屬的甲苯胺藍(lán)和TRAP染色的股骨的一系列的顯微照片。骨礦化(BM：降低了)、吸收腔(RC：增加了)和破骨細(xì)胞(染色的多核細(xì)胞(兩個(gè)箭頭)：增加了)的模式被OVX影響了。這些影響被藥物處理逆轉(zhuǎn)了。我們對(duì)其進(jìn)行解釋以表明靶向CCK2受體使與低的雌性激素水平和組成性胃泌素受體活化無關(guān)的骨形態(tài)正?；?。圖56是顯示胃泌素拮抗劑處理對(duì)切除卵巢的乳鼠屬模型中的循環(huán)激素的影響的一系列的圖。雌性激素被卵巢切除術(shù)顯著地降低了，而PTH和胃泌素被卵巢切除術(shù)升高了。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了對(duì)PTH和胃泌素的影響。卵巢切除術(shù)顯著地增加了PINP、CTX-1和骨鈣素。胃泌素拮抗劑抑制了這些影響。我們解釋這些結(jié)果以表明被卵巢切除術(shù)引起的骨活性標(biāo)記被胃泌素受體正?；?。CON＝對(duì)照動(dòng)物，OVX＝切除卵巢的動(dòng)物，OVX+GA＝胃泌素拮抗劑處理的切除卵巢的動(dòng)物。平均值±SEM。與CON相比，*p<0.05；與單獨(dú)的OVX相比，**p<0.05。圖57顯示了一個(gè)基于本發(fā)明證明結(jié)果的調(diào)節(jié)骨重建的綜合模型。本發(fā)明顯示了卵巢功能(和雌性激素分泌)以及甲狀旁腺PTH分泌物的影響被竇胃泌素分泌G細(xì)胞調(diào)整。由于胃中的主要鈣敏細(xì)胞以及PTH和雌性激素信號(hào)在胃內(nèi)的聯(lián)系，通過其對(duì)骨重建(破骨細(xì)胞活化)的負(fù)影響，胃泌素是骨表型的主要的調(diào)節(jié)子。這些作用可被降鈣素和甲狀腺改變，并被來自ECL細(xì)胞的組胺的釋放放大。較深的灰色線＝刺激，較淺的灰色線＝抑制作用。圖58是顯示胃泌素/CCK2受體靶標(biāo)在人體內(nèi)分配的圖。所述受體在甲狀腺(包括甲狀旁腺)中、胃內(nèi)以及在骨中被表達(dá)。在甲狀腺中，CCK2在甲狀旁腺中的降鈣素分泌C細(xì)胞以及PTH分泌細(xì)胞上被表達(dá)。在腸中，CCK2在組胺分泌的ECL細(xì)胞中被表達(dá)，而在骨中，受體表達(dá)可存在于包括成骨細(xì)胞和骨原細(xì)胞的多種細(xì)胞中。用特異拮抗劑靶向胃泌素/CCK2受體將直接地(骨)或間接地通過胃和狀腺/甲狀旁腺軸抑制骨疾病，例如骨質(zhì)疏松癥。PTH＝甲狀旁腺。具體實(shí)施方式根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于治療、穩(wěn)定和/或預(yù)防骨疾病或病情發(fā)展的新方法。這種新方法得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持：激素胃泌素直接或間接地調(diào)節(jié)骨形成，因此促進(jìn)了骨質(zhì)流失，同時(shí)伴隨著與骨質(zhì)疏松性改變一致的隨之而來的骨病理生理(見圖57)。根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用靶向CCK2S受體的胃泌素拮抗劑阻止這些胃泌素的影響在顯示出特征為骨質(zhì)疏松癥的骨疾病或病情的動(dòng)物模型中具有有益的效果。因此，本申請(qǐng)涉及胃泌素靶向藥劑(例如胃泌素拮抗劑，或拮抗胃泌素活性的藥劑)治療骨疾病或病情的用途(見圖58)。A.定義如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“病情”一般是指健康狀況中的疾病、事件或變化。如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“骨疾病或病情”是指與骨異常有關(guān)的疾病或病情，所述骨異?？赏ㄟ^增加骨量和/或骨生長來治療。例如，骨疾病或病情可包括：原發(fā)性骨質(zhì)疏松，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，成骨不全，骨營養(yǎng)不良，骨質(zhì)減少，佩吉特氏病(Paget'sdisease)，由于骨轉(zhuǎn)移、放射療法或化學(xué)療法產(chǎn)生的溶骨性病變(osteolyticlesions)，牙周疾病，牙槽骨質(zhì)流失，由于不能移動(dòng)或性激素的缺乏引起的骨質(zhì)流失，由于轉(zhuǎn)移性癌癥引起的骨質(zhì)流失，由炎性疾病引起的骨和軟骨的骨質(zhì)流失，骨關(guān)節(jié)炎，截骨術(shù)骨質(zhì)流失，兒童特發(fā)性骨質(zhì)流失，脊柱彎曲以及骨折。骨疾病或病情可以為與高胃泌素血癥相關(guān)的骨疾病或病情。骨疾病或病情還可在如下段描述的特定環(huán)境下的主體中被顯示出。如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“主體”是指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。例如，這些主體可以包括以下主體：i)老年人(男性或女性)；ii)患有卵巢功能降低或失去卵巢功能的女性；iii)患有天生(腫瘤的或與胃粘膜萎縮有關(guān)的)高胃泌素血癥的個(gè)體，或iv)作為抑酸藥物(藥劑類型包括所有的質(zhì)子泵抑制劑或所有短期或長期作用組胺的兩種受體拮抗劑)使用結(jié)果的高胃泌素血癥個(gè)體，或v)胃切除手術(shù)的個(gè)體。在所有的這些情況下，這些主體中的骨疾病或病情可通過使用一類胃泌素靶向藥劑被改善。例如，這類胃泌素靶向藥劑為靶向CCK2受體的胃泌素拮抗劑。如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“胃泌素靶向藥劑”的意思是胃泌素拮抗劑，例如胃泌素靶向或胃泌素受體靶向藥劑，以及胃泌素或胃泌素受體拮抗劑，例如靶向CCK2受體的藥劑。如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“治療上有效量”的意思是將獲得骨疾病或病情的治療目的、改善效果或預(yù)防，或?qū)⒏纳萍膊』虿∏閲?yán)重度和發(fā)病率的如在本申請(qǐng)中描述的胃泌素靶向藥劑的量。骨疾病或病情嚴(yán)重程度中的改善包括疾病或病情的逆轉(zhuǎn)，以及緩解疾病或病情的進(jìn)展。如在本發(fā)明中使用的術(shù)語動(dòng)詞形式的“治療”或名詞形式的“治療”的意思是減輕，包括停滯，或推遲或減弱疾病或病情，或與本發(fā)明中描述的疾病或病情相關(guān)的一種或多種癥狀的進(jìn)展、發(fā)展、啟動(dòng)或嚴(yán)重程度，或改善出現(xiàn)的不可控制的或不需要的癥狀，預(yù)防額外的癥狀，或改善或預(yù)防潛在的癥狀代謝原因。因此，所述術(shù)語表示對(duì)具有疾病或癥狀，或具有潛在發(fā)展為這種疾病或癥狀的主體賦予了有益的結(jié)果。當(dāng)主體經(jīng)歷了疾病、病情或患病的部分或全面的緩解，或其一種或多種跡象或癥狀的減輕，即獲得了應(yīng)答，例如但不限于骨質(zhì)流失的逆轉(zhuǎn)或預(yù)防，骨量丟失的逆轉(zhuǎn)或預(yù)防，骨折或其風(fēng)險(xiǎn)的逆轉(zhuǎn)或預(yù)防，骨密度的增加或預(yù)防，骨重建的增加，骨吸收和/或骨增生的降低。在本發(fā)明中使用與列舉的數(shù)值有關(guān)的術(shù)語“約”將被理解為包括列舉的數(shù)值和加或減所述列舉值的百分之十之內(nèi)的數(shù)值。在本發(fā)明中使用術(shù)語“在......之間”將被理解為當(dāng)提及一個(gè)數(shù)值范圍時(shí)，包括范圍的每一個(gè)端點(diǎn)的數(shù)值。例如在長度為10個(gè)堿基對(duì)和20個(gè)堿基對(duì)之間的核酸序列包括長度為10個(gè)堿基對(duì)的核酸序列和長度為20個(gè)堿基對(duì)的核酸序列。B.G細(xì)胞和胃泌素在鈣敏和骨疾病中的作用特征為骨質(zhì)流失和高的骨折風(fēng)險(xiǎn)的骨質(zhì)疏松癥為最常見的疾病之一，特別是在老年人當(dāng)中，據(jù)估計(jì)其影響了全世界大約1億人。雖然卵巢衰竭和骨脫礦質(zhì)在這種疾病中是被公認(rèn)的關(guān)鍵要素，但是確切的病因仍然沒有完全解決。關(guān)于圖1，顯示了已知的骨重建的激素和礦物質(zhì)調(diào)節(jié)子。在正常的情況下，作為生理或機(jī)械應(yīng)答，發(fā)生了骨重建，以維持強(qiáng)度和礦物的動(dòng)態(tài)平衡(特別是鈣)。這些涉及由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性影響的形成和吸收的內(nèi)部相關(guān)的現(xiàn)象。通常，這涉及包括破骨細(xì)胞前體活化、活化吸收、吸收的逆轉(zhuǎn)以及新骨的形成四個(gè)步驟。前兩步需要花費(fèi)2-4周，最后一步需要花費(fèi)4-6月來完成。在圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)早期的女性中骨重建增加，然后隨著變老減緩，但比絕經(jīng)前的女性以更快的速率持續(xù)。骨重建還被認(rèn)為在老年男性中被增加了。關(guān)于圖2，皮層骨是致密的和堅(jiān)實(shí)的，并且環(huán)繞著骨髓空間。其具有外部的骨膜表面和內(nèi)部的骨內(nèi)膜表面。其通常比骨小梁具有更少的代謝活性。骨膜表面活性對(duì)外加生長和骨折修復(fù)是重要的。骨內(nèi)膜表面具有比骨膜表面更高的重建活性，可能是更大的生物力學(xué)應(yīng)變或更大的暴露于來自相鄰的骨髓室的信號(hào)的結(jié)果。增加的皮層重建引起皮層多孔性(corticalporosity)增加和皮層骨量降低。骨吸收通常在骨內(nèi)膜表面上超過骨形成，而骨形成通常在骨膜表面上超過骨吸收。骨小梁由散布在骨髓室中的骨小梁板和桿的蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)組成。其比皮層骨的代謝更活躍。這種骨類型的逆轉(zhuǎn)似乎對(duì)礦物質(zhì)代謝和維持機(jī)械強(qiáng)度最重要。骨重建的生物學(xué)是復(fù)雜的，并涉及一系列的激活因子，例如PTH、雌激素、生長因子和炎性細(xì)胞因子以及飲食攝入量，例如鈣和維生素D。這導(dǎo)致現(xiàn)在可供管理之用的廣譜治療的發(fā)展。這些包括對(duì)他汀類藥物、成纖維細(xì)胞生長因子-1、或甲狀旁腺激素(PTH)自身使用的激素替代治療。PTH被認(rèn)為是骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，因?yàn)槠渫ㄟ^吸收過程增強(qiáng)了Ca2+從骨儲(chǔ)存中的釋放。然而，PTH的效果是間接的，因?yàn)槠乒羌?xì)胞沒有PTH受體。PTH反而結(jié)合成骨細(xì)胞，并導(dǎo)致RANKL的表達(dá)。RANKL通過受體RANK激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞來融合，形成負(fù)責(zé)骨吸收的新的破骨細(xì)胞。支持骨質(zhì)疏松癥中的PTH的作用的證據(jù)來自報(bào)道了PTH值在上了年紀(jì)的人中比在年輕的成人中高的多項(xiàng)研究。提出了有助于較高的PTH值的若干因素，包括降低的腎臟功能、或許是由于吃的動(dòng)機(jī)減少造成的鈣(Ca2+)的有效腸道吸收的減少、PTH的抗血鈣作用、維生素D不足的更高的患病率以及，更特別地是，在老年人中增加的胃pH值中。后者反映了壁細(xì)胞的量(黏膜萎縮)伴隨著胃pH的升高以及竇部神經(jīng)內(nèi)分泌G細(xì)胞的胃泌素分泌物的增加而損失。在胃粘膜的完整性和功能中，年齡相關(guān)的變化被認(rèn)為是上了年紀(jì)的人的腸胃病中的主要問題，并被認(rèn)為是造成藥物敏感性增加、出血以及未能充分吸收鈣和鐵的原因。Ca2+/PTH/維生素D軸被認(rèn)為是通過使甲狀旁腺、腎、骨和胃腸道的功能協(xié)調(diào)以增加血清中的Ca2+而沒有伴隨著血清磷水平的增加來維持系統(tǒng)的Ca2+體內(nèi)平衡。這個(gè)軸主要是旨在通過使Ca2+從骨骼流通、由腎儲(chǔ)存Ca2+以及增加胃腸道的Ca2+吸收來防止低血鈣癥。在對(duì)血清Ca2+濃度降低應(yīng)答時(shí)，甲狀腺中的鈣敏受體(CaSR)增加PTH分泌，而腎中的CasR降低腎臟的Ca2+排泄。然而，鈣敏并不受限于甲狀旁腺，CaSR存在于多種其他細(xì)胞類型中，包括竇部產(chǎn)生胃泌素的G細(xì)胞。該神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，假定其胃的位置被唯一地定位以感受和應(yīng)答飲食中的Ca2+攝入。CaSR檢測細(xì)胞外的Ca2+濃度的變化，并啟動(dòng)適應(yīng)性激素和離子轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)答來維持合成的鈣的動(dòng)態(tài)平衡。甲狀旁腺、甲狀腺C細(xì)胞和腎目前被認(rèn)為是代表CaSR表達(dá)的生理相關(guān)的位點(diǎn)?？傊偷?<1mM)循環(huán)細(xì)胞外的Ca2+是甲狀旁腺細(xì)胞中的PTH分泌的主要刺激物。在較高的濃度下，Ca2+通過CaSR磷酸化和后續(xù)的失活抑制PTH的合成和分泌。在綿羊的濾泡旁細(xì)胞中以及在甲狀腺髓樣癌(MTC)細(xì)胞系TT中也鑒定出了CaSR。后者以降鈣素分泌應(yīng)答Ca2+。雖然CaSR已經(jīng)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中被鑒定出，但Ca2+敏感性的生理作用是不清楚的，因?yàn)槠湓谶@些細(xì)胞中以非常低的水平被表達(dá)。與骨細(xì)胞相比，在胃中鑒定出了生理相關(guān)的CaSR。最近，已經(jīng)克隆并測序了來自人竇部G細(xì)胞的CaSR，其以>2mM的Ca2+濃度行使功能。下面的小節(jié)(1-8)提供了在實(shí)施例中證明本發(fā)明研究的簡單概述和討論。提供這些小節(jié)是為了進(jìn)一步說明實(shí)施例，但并不旨在限制包含其中的結(jié)果和結(jié)論。1.分離G細(xì)胞的研究在此證明的是G細(xì)胞作為Ca2+傳感器的生理作用(見實(shí)施例1，圖3)?？傊?，在用餐期間攝取的鈣(1-10mM)刺激胃泌素，釋放。機(jī)械地，細(xì)胞外的Ca2+被胃的CaSR接受，其通過鈣誘導(dǎo)的通路激活胃泌素釋放。本發(fā)明證明的結(jié)果進(jìn)一步確定G細(xì)胞在腸/甲狀旁腺的鈣動(dòng)態(tài)平衡中作為關(guān)鍵的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。進(jìn)行研究以確認(rèn)G細(xì)胞上的PTH受體的存在以及隨著cAMP的活化，PTH介導(dǎo)的胃泌素釋放(見圖4)。這些研究得到了其他研究的支持。例如在麻醉的豬中，PTH的注入(40單位/20min)增加了竇部和混合靜脈血中的胃泌素水平，而沒有誘導(dǎo)系統(tǒng)性的高鈣血癥。而且，在年幼的麻醉的豬中，天然的牛PTH和合成的人1-34PTH(0.02-4U/min)快速(在10-30分鐘內(nèi))并且明顯地(大約10倍)增加了胃泌素的釋放。在分離的胃泌素細(xì)胞中也進(jìn)行了研究，顯示17β-雌二醇(ESRα拮抗劑)抑制胃泌素的釋放(見圖6)。雌性激素的非基因組靶向效果在其他細(xì)胞類型(例如乳腺組織)中已經(jīng)被很好地定義了。這些效果(ERα介導(dǎo)的MAPK信號(hào)發(fā)出)在G細(xì)胞中也是可證明的，其中雌性激素是胃泌素分泌的有效抑制劑。該信息表明改變與更年期狀態(tài)一致的雌性激素環(huán)境將極大地改變/刺激G細(xì)胞的功能(發(fā)信號(hào)和分泌)。這與之前的在老年大鼠中存在包括增加的G細(xì)胞功能和高的PTH的環(huán)境的的報(bào)道一致。該組合被公認(rèn)為與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展有關(guān)。額外的體外研究已經(jīng)確定胃泌素分泌可通過腸產(chǎn)生的組胺和血清素來調(diào)節(jié)。提出的組胺在骨骼系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中的作用與模棱兩可的信息有關(guān)。在肥大細(xì)胞增生癥和過敏疾病中，過量的組胺釋放可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。相比之下，在成骨細(xì)胞中，組胺可直接通過破骨細(xì)胞前體和破骨細(xì)胞以及間接通過增加RANKL(破骨細(xì)胞激活受體)的表達(dá)增加骨吸收。此外，在體內(nèi)研究中，H1和H2受體拮抗劑可對(duì)骨組織發(fā)揮保護(hù)效果，雖然這不能一貫地在所有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭兄貜?fù)出來。然而，組胺在離體以及體外中都能調(diào)節(jié)胃泌素的釋放。血清素在骨代謝中的作用還不完全清楚。注射血清素通過血清素介導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖(這些細(xì)胞表達(dá)5-HT2受體)增加大鼠中的骨礦密度。在動(dòng)物模型中，血清素似乎以Lrp5依賴的方式限制了骨的形成。Lrp5通過抑制限速血清素合成酶(Tph1)限制了血清素的產(chǎn)生。然而，在臨床研究中，LRP5突變與循環(huán)血清素中沒有變化有關(guān)，并且患者顯示出高骨量。血清素再攝取抑制劑(SSRI)與成骨細(xì)胞增殖有關(guān)，但在中年女性中，SSRI的使用與骨質(zhì)流失率的增加無關(guān)。此外，類癌綜合征中的高循環(huán)血清素與臨床上顯著降低的骨密度、骨結(jié)構(gòu)變差，或降低的骨形成標(biāo)記無關(guān)。血清素的任何影響可選擇性地通過G細(xì)胞，胃泌素釋放由5-HT3受體刺激。因此，胺可通過G細(xì)胞上的活性調(diào)節(jié)骨形成。當(dāng)共同評(píng)估后，本發(fā)明提出的數(shù)據(jù)和觀察結(jié)果(例如魯米諾鈣敏受體的存在、甲狀旁腺和甲狀腺功能調(diào)節(jié)的以及維生素D的受體的選擇性表達(dá)、以及胺類受體表達(dá)(被組胺和血清素正調(diào)節(jié)))，確定了G細(xì)胞在腸/甲狀旁腺鈣動(dòng)態(tài)平衡軸中作為關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。2.胃泌素靶向研究(在體外)本發(fā)明證實(shí)的研究探索了哪種細(xì)胞可能是潛在的胃泌素受體。此外，這些研究檢驗(yàn)了胃泌素細(xì)胞是否能通過胃泌素的釋放調(diào)節(jié)鈣動(dòng)態(tài)平衡軸(見實(shí)施例2)。在PTH主細(xì)胞中是否存在CCK2受體還不清楚，但已經(jīng)在大量的生理研究中被揭示了。在分離的牛甲狀旁腺細(xì)胞中，高濃度的胃泌素(>1μM)增加了cAMP的積累(在～50％的實(shí)驗(yàn)中為40-60％)，PTH釋放的先決條件。鳥類模型也支持了該觀察結(jié)果。在雞中高胃泌素血癥(使用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，奧美拉唑(400μM/kg/天)五周)的誘發(fā)導(dǎo)致PTH腺的尺寸以及PTH轉(zhuǎn)錄的增加。這些影響通過胃泌素的注射(連續(xù)的，5nmol/kg/小時(shí)，3周)來概括。在此描述的研究證明了胃泌素/CCK2受體在分離的人PTH主細(xì)胞(來自人的外科手術(shù)樣本)上的表達(dá)，以及胃泌素對(duì)人PTH的合成和釋放具有刺激效應(yīng)(見圖8)。因此，本發(fā)明證明了甲狀旁腺細(xì)胞為胃泌素的靶標(biāo)。因?yàn)镻TH刺激胃泌素釋放(見圖4)，因此激活甲狀旁腺(PTH)分泌表明了前饋刺激環(huán)(G細(xì)胞到PTH)。在本發(fā)明的研究中，在這些細(xì)胞中也鑒定出了刺激組胺H1受體的表達(dá)。在G細(xì)胞上也鑒定出了刺激組胺H1受體的表達(dá)。組胺是一種在正常的增生性PTH腺中的cAMP產(chǎn)生和PTH分泌的已知激活劑。C細(xì)胞和C細(xì)胞源腫瘤(骨髓甲狀腺癌)表達(dá)胃泌素/CCK2受體。此外，在人甲狀腺薄片(humanthyroidslice)中，胃泌素誘導(dǎo)cAMP產(chǎn)生以及降鈣素釋放。3.骨中功能胃泌素靶標(biāo)的鑒定為了評(píng)價(jià)胃泌素對(duì)骨自身的直接影響，評(píng)價(jià)了骨細(xì)胞上的胃泌素受體的存在以及胃泌素釋放對(duì)骨源細(xì)胞是否具有影響(見實(shí)施例3)。在三種不同的模型中檢驗(yàn)了胃泌素的影響，1)小鼠的顱骨成骨細(xì)胞，2)人胎成骨細(xì)胞系，hFOB1.19，3)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)。顱骨成骨細(xì)胞是已知的研究成骨細(xì)胞功能的模型，包括增殖、礦化和細(xì)胞信號(hào)發(fā)放。hFOB為轉(zhuǎn)染SV40大T抗原人細(xì)胞系，其被用作研究正常人的成骨細(xì)胞差異、成骨細(xì)胞生理機(jī)能，以及激素、生長因子，和其他細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞功能和差異的影響的模型。BMMSC為可分化為組織再生所需要的各種細(xì)胞類型(包括成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞)的多潛能骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并在年齡相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著病理作用。本發(fā)明證明的結(jié)果顯示骨內(nèi)的多種細(xì)胞類型可被胃泌素激活/調(diào)節(jié)。由于含有胃泌素的循環(huán)血液通過骨髓滲透，因此循環(huán)胃泌素水平上的改變與表達(dá)CCK2受體的任何骨源細(xì)胞都是生物學(xué)相關(guān)的。由于胃泌素是已知的增殖性調(diào)節(jié)子，所以還研究了在三種不同的細(xì)胞模型中胃泌素對(duì)增殖(BrdU攝入)的影響。其中證明的結(jié)果顯示，除了其他的以外，胃泌素刺激成骨細(xì)胞和BMMSC的增殖，所述增殖不能被選擇性胃泌素拮抗劑(GA)逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明胃泌素引起伴隨著礦化損失的成骨細(xì)胞的去分化。GA拮抗劑沒有減少增殖，但是維持了骨表型。通過本發(fā)明證明的結(jié)果顯示胃泌素在兩個(gè)水平上直接影響骨細(xì)胞的功能：成骨細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，并可能通過軟骨細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)在生長板處具有影響。4.胃泌素研究：質(zhì)子泵抑制劑對(duì)G細(xì)胞功能的影響胃泌素分泌是由與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的老化的兩個(gè)方面(老化和胃粘膜萎縮膜，與由于泌酸壁細(xì)胞的喪失而延長的高胃pH有關(guān))調(diào)節(jié)的動(dòng)力學(xué)生理應(yīng)答。胃pH的持續(xù)升高導(dǎo)致循環(huán)胃泌素水平的升高，其還與長期的PPI或H2受體拮抗劑的使用有關(guān)。這些藥劑常用來治療消化不良的胃癥狀或胃食管反流，兩者都與老年女性群體特別相關(guān)。酸性的胃環(huán)境(低的胃pH)對(duì)促進(jìn)被GI腸道最佳吸收的離子鈣的產(chǎn)生也是很重要的。在人類中，胃切除術(shù)(缺乏酸)和惡性貧血(喪失在低酸狀態(tài)下循環(huán)的壁細(xì)胞)都很好地記錄為與骨質(zhì)減少和骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。胃切除術(shù)通常涉及顯著減少胃酸的泌酸細(xì)胞的切除術(shù)，惡性貧血與壁細(xì)胞(產(chǎn)酸)的損失、升高的胃的pH(>4)有關(guān)，但在胃的底部(ECL細(xì)胞)和竇部(胃泌素細(xì)胞)仍然具有功能性的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。升高的胃的pH和升高的胃泌素水平液還在老化的胃中以及長期使用PPI中發(fā)生。PPI已經(jīng)暗示增加了骨吸收和骨折的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)G細(xì)胞功能和胃泌素分泌的酸抑制作用(升高的胃pH)被證明于此(見實(shí)施例4)。結(jié)果顯示，除了其他跡象以外，增加胃的pH顯著地影響了G細(xì)胞的功能。特別是，影響了G細(xì)胞Ca2+敏感活性和對(duì)生理調(diào)節(jié)的應(yīng)答。5.酸封堵對(duì)骨動(dòng)力學(xué)的影響：乳鼠屬高胃泌素性模型強(qiáng)效抑酸藥物的問世(例如PPI)已徹底改革了酸相關(guān)疾病的管理。在連續(xù)或長期的基礎(chǔ)上，上百萬的個(gè)體都在使用這些藥物。眾所周知，明顯的胃酸過少(高的胃的pH)，特別是在PPI清除降低并具有較高的幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)感染的患病率的上了年紀(jì)的群體中，導(dǎo)致鈣吸收不良。這得到了大量的研究的支持，所述研究已經(jīng)顯示PPI治療降低了不可溶鈣的吸收和骨密度。因此，髖骨骨折風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加與長期的PPI治療有關(guān)，特別是在高劑量的PPI長期使用者中?？紤]到上述使用PPI的問題，本發(fā)明證明的結(jié)果調(diào)查了在乳鼠屬模型中，抑酸對(duì)胃、循環(huán)激素、甲狀旁腺以及骨生理學(xué)的影響(見實(shí)施例5)。結(jié)果證實(shí)，除其他跡象之外，由抑酸藥物引起的高胃泌素血癥與骨變化有關(guān)，所述骨變化與被認(rèn)為與骨質(zhì)疏松癥等同的外觀形態(tài)相似。6.在切除卵巢的乳鼠屬中酸封堵對(duì)骨動(dòng)力學(xué)的影響在乳鼠屬模型上進(jìn)行卵巢切除術(shù)以產(chǎn)生用于骨研究的“絕經(jīng)后”表型。由于在本發(fā)明中已經(jīng)顯示雌性激素?fù)p失調(diào)節(jié)G細(xì)胞，因此，評(píng)價(jià)了雌性激素?fù)p失對(duì)骨表型的特異性作用(見實(shí)施例6)。結(jié)果支持，除了其他跡象以外，循環(huán)胃泌素水平放大了雌性激素?fù)p失介導(dǎo)的骨變化。7.對(duì)胃神經(jīng)內(nèi)分泌功能和骨動(dòng)力學(xué)的影響：基因敲除小鼠模型(有或沒有卵巢切除術(shù))在大鼠中，胃切除術(shù)(除去包括竇部的G細(xì)胞和底部分泌組胺的ECL細(xì)胞的整胃)或PPI(例如奧美拉唑)的使用，導(dǎo)致磷酸鈣的吸收障礙，以及骨礦密度受損和骨質(zhì)減少。進(jìn)一步的觀察是在小鼠中注入胃泌素-17引起低血鈣癥。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，部分的以及全部的胃切除術(shù)和胃迷走神經(jīng)切斷術(shù)(軀干的/選擇性的等等)(其改變神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌)，影響了細(xì)胞外的礦物動(dòng)態(tài)平衡并導(dǎo)致作為晚期后遺癥的骨質(zhì)減少。迷走神經(jīng)切斷術(shù)后和胃切除術(shù)后的骨質(zhì)減少的潛在機(jī)制還不清楚。推測是，它們反映了胃泌素對(duì)PTH/Ca2+軸或?qū)枪δ艿闹苯佑绊?，或通過例如組胺的間接影響。值得注意的是觀察到身體的同側(cè)的迷走神經(jīng)切斷術(shù)對(duì)與肺癌有關(guān)的肥大性肺性骨關(guān)節(jié)病(HPOA)的醫(yī)治有效。相似地，由侵襲性尖部腫瘤性肺病變(潘科斯特綜合征，Pancoastsyndrome)引起的迷走神經(jīng)切斷術(shù)與手臂中的身體同側(cè)的骨變化有關(guān)。組胺是由胃底部的類腸嗜鉻細(xì)胞細(xì)胞(ECL)分泌的，并且是酸分泌的主要調(diào)節(jié)子，因?yàn)槠浞置谥饕谎h(huán)胃泌素驅(qū)動(dòng)。泌酸(胃的底部)粘膜的ECL細(xì)胞為一種“關(guān)閉的”局部化分泌細(xì)胞，即其沒有達(dá)到胃腔，并因此不能對(duì)膳食鈣直接應(yīng)答。ECL細(xì)胞的分泌產(chǎn)物包括組胺、嗜鉻粒蛋白A和胰抑制素(pancreastatin)以及結(jié)合鈣的蛋白質(zhì)，鈣結(jié)合蛋白。ECL細(xì)胞表達(dá)胃泌素和組胺受體，并且主要對(duì)轉(zhuǎn)換胃泌素信號(hào)(通過組胺分泌)起作用來調(diào)節(jié)壁細(xì)胞介導(dǎo)的酸(HCL)分泌。組胺本身已經(jīng)被證明顯示出對(duì)骨細(xì)胞功能的獨(dú)立的影響。然而，關(guān)于組胺是否是保護(hù)的或骨質(zhì)減少的研究是模棱兩可的。已經(jīng)注意到在肥大細(xì)胞增生癥和過敏疾病中過量的組胺釋放與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展有關(guān)。這表明組胺在骨重建中起著負(fù)面作用。通過含有ECL細(xì)胞的胃產(chǎn)酸部分的外科切除術(shù)(泌酸的/底部黏膜)減少了大鼠中骨含量的研究提供了這一意見的進(jìn)一步地支持。這些觀察通過體外研究進(jìn)一步得到了支持。因此，在表達(dá)組胺H1-3受體的成骨細(xì)胞的MC3T3-El(El)細(xì)胞中，組胺增加了RANKL轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)和蛋白產(chǎn)物。這些效果被H1受體拮抗劑抑制。在共培養(yǎng)中，組胺與骨髓細(xì)胞(來源于小鼠顱骨的MC3T3-El(El)細(xì)胞)一起在維生素D3的存在下刺激破骨細(xì)胞形成。這一效果被采用抗ODF/RANKL的中和抗體的預(yù)培養(yǎng)阻斷。使用基因芯片的方法探測骨髓造血前體細(xì)胞的分化成骨再吸收的破骨細(xì)胞，值得注意的是RANKL刺激了包括H1受體的70種靶標(biāo)基因。在切除卵巢的大鼠中，用受體拮抗劑法莫替丁的研究證明通過降低破骨細(xì)胞的活性抑制了脊椎骨量的損失。這些效果是短期的并且經(jīng)過6個(gè)月?lián)p失。這些數(shù)據(jù)的總和表明組胺在調(diào)節(jié)骨吸收中具有活性作用。這一觀察得到了來源于一個(gè)大的寄存器為基礎(chǔ)的情況下的數(shù)據(jù)的支持：對(duì)照研究顯示長期使用組胺H1受體拮抗劑降低了骨折的風(fēng)險(xiǎn)。在ECL細(xì)胞中，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組胺分泌的關(guān)鍵酶為組氨酸脫羧酶(HDC)。HDC為零的小鼠的特征為完全缺乏組胺合成，并且基礎(chǔ)胃酸分泌以及胃泌素抗性降低。這些動(dòng)物顯示出顯著地增加的股骨厚度以及與骨礦物質(zhì)含量升高和骨吸收降低有關(guān)的胸椎的厚度。破骨細(xì)胞在數(shù)量和活性方面都降低了。當(dāng)HDC為零的小鼠被切除卵巢的皮層以及骨小梁骨質(zhì)流失減少50％時(shí)表明組胺缺乏使骨骼免患雌性激素驅(qū)動(dòng)的骨質(zhì)疏松癥。因此，推斷組胺對(duì)雌性激素介導(dǎo)的骨重建起到了增強(qiáng)作用。雖然認(rèn)為ECL細(xì)胞產(chǎn)生替代的促骨胺或多肽貌似合理，但沒有鑒定出這樣的激素。因此，組胺的作用作為胃泌素、ECL細(xì)胞和骨病理生理機(jī)制之間的聯(lián)動(dòng)因素是可能的，因?yàn)檫@種胺的合成和分泌與胃泌素聯(lián)系特別緊密。本發(fā)明的研究用胃泌素和組胺的敲除模型證明了骨代謝調(diào)解(整合性)中的組胺和胃泌素之間的關(guān)系(見實(shí)施例7)。已經(jīng)在疾病(包括胰腺癌、胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和胃潰瘍)的藥理水平上研究了靶向胃泌素/CCK2受體。后者的發(fā)生涉及通過組胺的合成和釋放ECL細(xì)胞的酸刺激的功能以及由胃泌素受體阻斷的組胺分泌的抑制將降低酸分泌的觀點(diǎn)。一種這樣的拮抗劑為YF476，1,4-苯二氮雜-2-酮基的胃泌素/CCK2受體拮抗劑，涉及原型類似物L(fēng)365,260。已經(jīng)在體外和體內(nèi)證明了YF476對(duì)ECL細(xì)胞組胺的合成和釋放的有效性。由于組胺分泌被胃泌素介導(dǎo)的CCK2受體的刺激激活，酸分泌效應(yīng)中獨(dú)立的生理事件將涉及CCK2受體拮抗劑阻斷對(duì)骨的與組胺釋放相關(guān)的影響和胃泌素對(duì)骨自身的任何直接影響的能力。8.原理證明研究：胃泌素拮抗劑對(duì)三種嚙齒動(dòng)物模型中的卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨表型的影響本發(fā)明描述的研究評(píng)價(jià)了胃泌素拮抗劑YF476對(duì)三種嚙齒動(dòng)物模型中的OVX介導(dǎo)的骨密度損失/骨變化的影響，并集中到骨強(qiáng)度的研究、形態(tài)學(xué)和循環(huán)生物標(biāo)志物(見實(shí)施例8)。C.使用胃泌素靶向藥劑治療骨疾病或病情本發(fā)明研究證明了，除其他跡象之外，CCK2受體在骨中的存在和胃泌素靶向藥劑在治療骨疾病中的功效。提供的是使用這種胃泌素靶向藥劑治療和預(yù)防骨疾病或病情的方法和組合物，所述骨疾病或病情包括特征為骨質(zhì)疏松癥的那些。在一些實(shí)施例中，合適的胃泌素靶向藥劑包括，但不限于，胃泌素調(diào)節(jié)子，所述胃泌素調(diào)節(jié)子包括胃泌素釋放肽(GRP)(蛙皮素)，生長抑素和包括奧曲肽(OCTR)和RC-160的生長抑素類似物。在其他實(shí)施例中，合適的胃泌素靶向藥劑包括CCK2受體拮抗劑(包括netazepide(YF476)和其他的1,4-苯二氮平-2-酮基胃泌素/CCK受體促效藥)。在一些實(shí)施例中，胃泌素靶向藥劑選自CCK2受體拮抗劑：Z-360、L-740093、YM022、RP73870、JB93182、AG041R、丙谷胺(及類似物)、JNJ-2607109(及衍生物)、CI-988、PD-135158、L-365260、LY-288513、L-364718、GW-5823、氯戊米特、CR2194(螺谷胺)、PD-149164、PD-135666、CI-1015、RP-69758、TP-680、PD-140548和伊曲谷胺(及衍生物)。胃泌素靶向藥劑可通過皮下給藥的方式向主體給藥。在一些實(shí)施例中，胃泌素靶向藥劑通過淺層肌肉注射進(jìn)行給藥。在其他實(shí)施例中，胃泌素靶向藥劑靜脈注射或口服給藥。實(shí)施例為了更好的說明要保護(hù)的發(fā)明，提供了下面的實(shí)施例，并且下面的實(shí)施例不能被解釋為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。在特定材料被提及的程度上，其僅是說明的目的，而不是旨在限制本發(fā)明。在沒有行使創(chuàng)造性的能力以及沒有脫離本發(fā)明的范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可發(fā)展等同的方式或反應(yīng)物。實(shí)施例1：分離G細(xì)胞的研究關(guān)于圖3，開展了證明G細(xì)胞作為Ca2+-傳感器生理作用的研究。通過涉及PKC通路和通過二氫吡啶敏感的鈣通道的Ca2+流入的機(jī)理，增加外部Ca2+的濃度刺激了胃泌素從分離的G細(xì)胞中釋放。EC50為4.1mM，這主要是通過PKC調(diào)節(jié)的通路發(fā)生。這些結(jié)果與作為飲食(魯米諾)鈣傳感器的G細(xì)胞一致。而且，在G細(xì)胞上鑒定出了PTH受體的存在。關(guān)于圖4，PTH介導(dǎo)的胃泌素釋放隨著cAMP活化被證明了。PTH通過PKA活化和細(xì)胞內(nèi)的cAMP產(chǎn)物顯著地刺激了胃泌素的釋放(EC50＝60nM)，證明G細(xì)胞上的PTH受體是有作用的，并且由該魯米諾鈣敏竇細(xì)胞產(chǎn)生的胃泌素的分泌可由PTH調(diào)節(jié)。在G細(xì)胞中還鑒定出了降鈣素受體。關(guān)于圖5，顯示了與PTH相比，通過cAMP產(chǎn)物的抑制，降鈣素(甲狀腺C細(xì)胞)抑制了胃泌素的釋放。這證明了G細(xì)胞，如其他的PTH/降鈣素靶標(biāo)(例如成骨細(xì)胞)一樣，可被不存在于胃中的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞系統(tǒng)刺激(PTH)或抑制(降鈣素)。這些觀察提供了已知的鈣動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)子(通過敏感血漿Ca2+水平–PTH/甲狀腺細(xì)胞)可直接影響胃部的魯米諾鈣敏細(xì)胞–產(chǎn)生胃泌素的G細(xì)胞–并改變其分泌型。評(píng)價(jià)了卵巢激素(雌激素)對(duì)G細(xì)胞功能的影響。關(guān)于圖6，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(實(shí)時(shí)PCR)鑒定了胃泌素細(xì)胞上存在雌性激素受體(ESRα)轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步證明了在分離的胃泌素細(xì)胞中17–雌二醇(ESRa拮抗劑)抑制胃泌素的釋放(IC50＝4.6x10-12M)、cAMP產(chǎn)生(IC50＝1.1x10-12M)和MAPK活性(圖6)。該信息表明使雌激素環(huán)境改變?yōu)榕c更年期狀態(tài)一致將明顯地改變/刺激G細(xì)胞的功能(信號(hào)發(fā)出和分泌)。這與之前的老年大鼠生存環(huán)境中的報(bào)道一致，包括提高的G細(xì)胞的功能和高的PTH。這個(gè)組合被公認(rèn)為與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展有關(guān)。關(guān)于表1，神經(jīng)內(nèi)分泌EC和ECL細(xì)胞分離制備的轉(zhuǎn)錄本的比較證明了G細(xì)胞是能感受魯米諾鈣的唯一細(xì)胞，因?yàn)閮H神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)CaSR而不表達(dá)鈣結(jié)合蛋白。關(guān)于圖7，這表明G細(xì)胞胃泌素分泌可被由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的PTH、來自甲狀腺C細(xì)胞的降鈣素和來自卵巢細(xì)胞的雌性激素直接調(diào)節(jié)。表1.通過轉(zhuǎn)錄組(U133A微陣列)分析測定，比較鈣代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本和神經(jīng)內(nèi)分泌受體在G細(xì)胞、EC細(xì)胞和ECL細(xì)胞中的存在CaSR：鈣敏受體；ESRα＝雌性激素α；H3＝組胺亞型3，5-HT3：血清素亞型3；PTH：甲狀旁腺結(jié)果確定了G細(xì)胞為腸/甲狀旁腺鈣動(dòng)態(tài)平衡軸中關(guān)鍵的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。實(shí)施例2：胃泌素靶向研究(體外)評(píng)價(jià)了作為潛在胃泌素靶標(biāo)的細(xì)胞類型：評(píng)價(jià)了鈣動(dòng)態(tài)平衡軸的胃泌素細(xì)胞通過胃泌素釋放的調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明了在分離的人PTH主細(xì)胞上胃泌素/CCK2受體的表達(dá)。關(guān)于圖8，進(jìn)一步證明了胃泌素對(duì)人PTH的合成和釋放具有刺激效應(yīng)。這些結(jié)果表明甲狀旁腺細(xì)胞為胃泌素的靶標(biāo)。由于PTH刺激胃泌素釋放(見圖4)，因此激活甲狀旁腺(PTH)分泌顯示前饋刺激回路(G細(xì)胞到PTH)。刺激性組胺H1受體在這些細(xì)胞上的表達(dá)也得到了鑒定。關(guān)于圖9，在分化良好的人MTC細(xì)胞系MTC-SK中，胃泌素刺激了cAMP和降鈣素的釋放，由選擇性的CCK2拮抗劑(YF476)逆轉(zhuǎn)的效果(IC50＝8.6x10-13M)。這些結(jié)果表明甲狀腺C細(xì)胞表現(xiàn)為胃泌素的靶標(biāo)。由于降鈣素抑制了胃泌素的釋放(見圖5)，C細(xì)胞活化將提供反饋抑制回路。為了評(píng)價(jià)甲狀腺/甲狀旁腺系統(tǒng)對(duì)胃泌素的整體響應(yīng)性(刺激或抑制)，評(píng)價(jià)了胃泌素對(duì)甲狀旁腺/MTC-SK共培養(yǎng)系統(tǒng)的影響。評(píng)價(jià)了胃泌素是否為骨吸收的刺激物(通過增加PTH的合成和釋放)或通過降鈣素的釋放為這一過程的抑制物。關(guān)于圖10，CCK2受體的刺激(在甲狀旁腺和甲狀腺C細(xì)胞中都表達(dá))導(dǎo)致在PTH轉(zhuǎn)錄和從培養(yǎng)的PTH細(xì)胞中的分泌方面顯著的升高。相比之下，胃泌素導(dǎo)致降鈣素的合成和釋放的顯著抑制。這些效果被含有選擇性的CCK2拮抗劑(YF476)的預(yù)培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)了。這些結(jié)果表明甲狀腺C細(xì)胞的胃泌素刺激被甲狀旁腺細(xì)胞中釋放的PTH逆轉(zhuǎn)了。這是在該模式共培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，胃泌素的影響主要是PTH介導(dǎo)的影響的證據(jù)。在健康的志愿者中，胃泌素注入的影響是增加了PTH的分泌，而不是降鈣素(顯著降低釋放)。這表明胃泌素對(duì)甲狀腺的任何體內(nèi)的效果主要與甲狀旁腺和PTH釋放有關(guān)。這些結(jié)果支持了由魯米諾敏感細(xì)胞(G細(xì)胞)釋放的腸道(胃的)激素直接調(diào)節(jié)甲狀旁腺，以及非直接調(diào)節(jié)甲狀腺C細(xì)胞降鈣素分泌物。實(shí)施例3：在骨中鑒定功能性胃泌素靶標(biāo)為了評(píng)價(jià)胃泌素對(duì)骨自身的直接影響，評(píng)價(jià)了骨細(xì)胞上的胃泌素受體的存在和胃泌素是否具有對(duì)骨源細(xì)胞的影響。QPCR、蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)技術(shù)被用來鑒定受體在骨中的表達(dá)。此后，檢測了胃泌素在三種不同模型中的影響，1)小鼠顱骨成骨細(xì)胞；2)人胎成骨細(xì)胞細(xì)胞系，hFOB1.19；3)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)。CCK2受體：使用qRT-PCR，在顱骨成骨細(xì)胞、hFOB細(xì)胞系和人BMMSC中鑒定CCK2受體的表達(dá)(圖11A)。用范圍在31.2-34的CQ值，在所有的模型中進(jìn)行了表達(dá)鑒定。免疫組織化學(xué)(IHC)鑒定了小鼠骨中的胃泌素受體–特異免疫染色在生長板中的軟骨細(xì)胞中被進(jìn)行了鑒定。一些表達(dá)在成骨細(xì)胞和襯于骨內(nèi)膜上的細(xì)胞中進(jìn)行了鑒定(圖11B-C)。也在源于10種骨髓的人皮層骨髓樣品(收集于下面的包括肢體缺血的動(dòng)脈粥樣硬化的截肢(沒有骨髓炎的證據(jù)))中進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)PCR和蛋白質(zhì)印跡。PCR鑒定出了與CCK2受體相關(guān)大小的條帶(圖12A)。其被測序(Sanger)并被鑒定顯示出與CCK2R有92％的同源性(圖12B)。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)了在所有的人類樣品中都能表達(dá)CCK2受體蛋白(圖12C)?？偨Y(jié)：胃泌素靶標(biāo)在小鼠的顱骨成骨細(xì)胞、在hFOB和BMMSC細(xì)胞系以及在包括生長板的骨(軟骨細(xì)胞)和在人骨髓(收集于骨內(nèi)膜)中可被鑒定出，表明骨內(nèi)的多種細(xì)胞類型都可被胃泌素激活/調(diào)節(jié)。由于含有胃泌素的循環(huán)血液通過骨髓滲透，因此循環(huán)胃泌素水平的改變與表達(dá)CCK2受體的任何骨源細(xì)胞都有生物學(xué)上的相關(guān)性。在體外胃泌素的影響：胃泌素是一種已知的增殖性調(diào)節(jié)子，所以胃泌素對(duì)增殖的影響(BrdU攝入)最初在三種細(xì)胞模型中進(jìn)行了研究。胃泌素在所有的三種細(xì)胞類型中都刺激了增殖，EC50為1-2x10-11M(圖13A)以及最大的效果為～50％(1nM)。這些對(duì)增殖的刺激性影響沒有被含有選擇性的胃泌素拮抗劑(YF476)的預(yù)培養(yǎng)抑制(圖13B)。這種化合物似乎增強(qiáng)了BMMSC細(xì)胞中的增殖。為了評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞和BMMSC的胃泌素活化的生物學(xué)意義，進(jìn)行了評(píng)價(jià)胃泌素介導(dǎo)的影響是否會(huì)導(dǎo)致骨礦化的研究。測定了熒光Osteomalge結(jié)合到礦化結(jié)節(jié)的羥基磷灰石部分。在所有的三種細(xì)胞類型中，胃泌素抑制了骨的礦化，IC50為3.2x10-11–1.3x10-10M(圖14A)，最大的抑制劑效果為～30-50％(1nM)。這些對(duì)礦化的抑制效果被含有選擇性胃泌素拮抗劑(YF476)的預(yù)培養(yǎng)抑制了(圖14B)。該化合物似乎特異性地增強(qiáng)了小鼠成骨細(xì)胞的顱骨細(xì)胞的礦化。概括：胃泌素刺激了成骨細(xì)胞和BMMSC的增殖，所述增殖被胃泌素拮抗劑逆轉(zhuǎn)。胃泌素介導(dǎo)的增殖與礦化的丟失損失有關(guān)，表明成骨細(xì)胞的表型是能夠逆轉(zhuǎn)的。GA逆轉(zhuǎn)了該胃泌素的抑制效果。這些結(jié)果表明胃泌素引起成骨細(xì)胞的去分化，伴隨著礦化損失。所述拮抗劑沒有降低增殖，但保持了骨骼的表型。這種效果在顱骨的成骨細(xì)胞中最明顯。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)胃泌素活化的生物學(xué)意義，進(jìn)行了評(píng)價(jià)這些胃泌素介導(dǎo)的效果是否增加骨形態(tài)生成蛋白2(BMP2–參與成骨細(xì)胞分化)、RANKL(在成骨細(xì)胞上表達(dá)的破骨細(xì)胞激活受體)以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF–參與骨髓祖細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性激活物的調(diào)節(jié))表達(dá)的研究。在小鼠的顱骨培養(yǎng)中，胃泌素(1nM)完全抑制了MSCF-1基因的表達(dá)，也抑制了RANKL的轉(zhuǎn)錄(0.8倍)以及ALKP(圖15)。在hFOB中，胃泌素還抑制了這些轉(zhuǎn)錄本。含有YF476的預(yù)培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)并使這些效果正?；＿@些基因中的任何一個(gè)都沒有在BMMSC中被鑒定出，但對(duì)ALKP，胃泌素的影響是值得注意的，而BMP2沒有在任何細(xì)胞類型中被鑒定出來。這確定了胃泌素的影響是異化的，用YF476抑制它們導(dǎo)致成骨細(xì)功能的正?；约爱a(chǎn)生合成代謝表型。這些數(shù)據(jù)表明胃泌素不但調(diào)節(jié)增殖和分化，而且還參與調(diào)節(jié)祖細(xì)胞。此外，胃泌素影響B(tài)MMSC的增殖。YF化合物逆轉(zhuǎn)了表型效應(yīng)，而沒有抑制增殖。因此，胃泌素在兩個(gè)水平上直接影響骨細(xì)胞的功能：成骨細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，可能通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的行為在生長板處有效果。實(shí)施例4：胃泌素研究：質(zhì)子泵抑制劑對(duì)G細(xì)胞功能的影響由于PPI與骨吸收和骨折風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)，因此評(píng)價(jià)了酸抑制(升高的胃pH)對(duì)G細(xì)胞功能和胃泌素分泌的作用。G細(xì)胞分離于小鼠(乳鼠屬—多乳屬)竇部黏膜，已對(duì)所述小鼠進(jìn)行了不可逆的H2受體拮抗劑(洛克替丁1mg/L，在飲用水中)的處理，來產(chǎn)生持久的高胃泌素血癥。該動(dòng)物已經(jīng)作為與胃酸分泌長期的藥物抑制(低酸狀態(tài)病理學(xué))有關(guān)的胃酸病理生理學(xué)模型進(jìn)行了廣泛的研究。用不可逆胃酸抑制劑處理30天的乳鼠屬(6-9個(gè)月)顯示出升高的血漿胃泌素水平(104±23pg/ml，對(duì)未處理的動(dòng)物中的28±13pg/ml，p<0.05)。這反映了低pH抑制胃泌素釋放的損失(結(jié)果是升高了胃的pH水平)。因此，該處理導(dǎo)致胃酸缺乏和高胃泌素性的動(dòng)物。與從未處理的動(dòng)物分離的G細(xì)胞相比，從胃酸缺乏(高pH的胃—低酸暴露G細(xì)胞)的動(dòng)物中分離的G細(xì)胞中的胃泌素含量、胃泌素轉(zhuǎn)錄本水平以及基底胃泌素釋放都顯著地(p<0.05)升高了(表2)。表2.在分離的嚙齒動(dòng)物的G細(xì)胞中，正常的胃pH和升高的胃pH(低酸)的差異總結(jié)*p<0.05對(duì)正常的G細(xì)胞。#對(duì)β肌動(dòng)蛋白、GAPDH和HPRT歸一化。GRP＝胃泌素釋放肽，OCTR＝奧曲肽關(guān)于表2，升高的胃pH(低酸狀態(tài))刺激了G細(xì)胞的胃泌素含量(>2倍)、轉(zhuǎn)錄(>4倍)和分泌(>8倍)。這些細(xì)胞刺激腺的生理應(yīng)答(例如GRP和鈣)降低了-EC50增加了。相似地，這些細(xì)胞對(duì)抑制劑(例如奧曲肽，OCTR)更不敏感，IC50增加了～5倍。胃泌素釋放的調(diào)節(jié)子GRP(蛙皮素)和生長抑素(OCTR)分別顯示出增加(GRP:EC50分別為1.1pM對(duì)1nM)和降低的功效(生長抑素類似物，奧曲肽:28pM至140pM)(表2)。此外，在檢測鈣時(shí)，“高胃泌素性”G細(xì)胞為～100％不敏感(在正常飲食細(xì)胞中EC50＝10mM對(duì)4mM)。這些數(shù)據(jù)證明增加體內(nèi)的胃(pH)環(huán)境顯著地影響了G細(xì)胞的功能。增加胃pH(例如，將存在于老年個(gè)體或使用PPI的患者)特異地改變了G細(xì)胞的Ca2敏感性和對(duì)生理調(diào)節(jié)的應(yīng)答。這證明了長期抑制壁細(xì)胞的功能以及降低酸分泌基本上改變了竇部G細(xì)胞對(duì)魯米諾環(huán)境的應(yīng)答。這一觀察是具有臨床意義的，因?yàn)樵诟唪斆字ZpH環(huán)境下，產(chǎn)生了更多的胃泌素。高胃泌素血癥是重要的，因?yàn)槲该谒丶却碳ち薖TH的釋放也對(duì)骨細(xì)胞具有直接的影響(見圖8、10、11)。實(shí)施例5：酸阻斷對(duì)骨動(dòng)力學(xué)的影響：乳鼠屬高胃泌素性模型在乳鼠屬模型中檢驗(yàn)了抑酸對(duì)胃、循環(huán)激素、甲狀旁腺以及對(duì)骨生理的效果。對(duì)于這些動(dòng)物中的骨生物學(xué)知道的非常少。一項(xiàng)研究確定了大多數(shù)(～80％)動(dòng)物的椎間盤退化>9個(gè)月，以及在動(dòng)關(guān)節(jié)(肘、膝)的嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎。在實(shí)驗(yàn)室的嚙齒動(dòng)物中，乳鼠屬，除了單一近交系的小鼠(STR/lN)外，似乎是對(duì)骨關(guān)節(jié)炎最敏感的。4-6個(gè)月大的動(dòng)物(雌性)用洛克替丁處理60或120天。年齡和性別匹配的未經(jīng)處理的動(dòng)物提供對(duì)照組。循環(huán)激素：激素分析(ELISA)證實(shí)胃泌素/PTH和雌二醇改變作為H2受體阻斷的功能。特別是，胃泌素分泌的短期升高(洛克替丁處理8周)與升高的PTH分泌和雌二醇/雌激素抑制有關(guān)(圖16)。長期(16周)、慢性高胃泌素血癥與PTH和雌二醇的抑制有關(guān)。胃：證明了在高胃泌素血癥(圖17B)期間，ECL組胺(組氨酸脫羧酶-HDC)(圖17A)和G細(xì)胞胃泌素(在mRNA水平上)的活化。這與短期高胃泌素血癥期間的PTH1R的活化(在mRNA和蛋白水平上)，和胃的ERα選擇性降低(在mRNA和蛋白水平上)有關(guān)；然后，這在16周增加了，并且與高胃泌素血癥期間CaSR(在mRNA和蛋白水平上)的活化有關(guān)(圖17A-C)。甲狀旁腺：使用免疫組織化學(xué)，證明了在乳鼠屬的甲狀旁腺中的CCK2受體的表達(dá)和甲狀腺(圖18)。這些結(jié)果確定了甲狀旁腺和甲狀腺C細(xì)胞都表達(dá)胃泌素受體。甲狀旁腺中的CCK2受體提供了G細(xì)胞的基礎(chǔ)：PTH軸憑借甲狀旁腺分泌(例如，PTH中)可由胃泌素調(diào)節(jié)。骨形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)：使用MicroCT評(píng)價(jià)來開展高胃泌素性動(dòng)物中嚙齒動(dòng)物股骨的骨形態(tài)學(xué)分析(圖19)。這些證明了較低的骨體積和降低的密度以及抗拉強(qiáng)度。這些數(shù)據(jù)證明了升高的胃泌素水平刺激了骨吸收。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)確定了板狀/桿狀比例的位移，其證明了股骨幾何學(xué)的改變。因此，胃泌素增加了SMI，表明通過重建，骨表型向更像桿狀的形態(tài)改變。后者與較弱的和較硬的骨以及在骨質(zhì)疏松癥的女性中注意的骨脆性有關(guān)。與正常的乳鼠屬相比，慢性高胃泌素性動(dòng)物顯示出具有下面特征的骨關(guān)節(jié)炎表型：骨骺板增厚、骨脆性(由于增加的脂肪細(xì)胞形成導(dǎo)致骨重建異常)和異常的免疫原性特征識(shí)別。骨髓從股骨中被分離出并被用于評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞形成。與從切除卵巢的小鼠中分離的細(xì)胞相比，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞可在異常早期時(shí)間被培養(yǎng)。這是高胃泌素性模型中的這兩個(gè)種群的細(xì)胞活化的證據(jù)。這與引起事件的CCK2受體的活化一致。與切除卵巢的小鼠相比，高胃泌素性乳鼠屬顯示出夸張的形態(tài)骨重建。在高胃泌素性動(dòng)物中，異常骨髓表型的存在進(jìn)一步通過基于qPCR的通路激活鑒定得到了確認(rèn)。這包括ALOX5和PTGS2(炎癥)的下調(diào)、PPARy(脂肪細(xì)胞的活化)的下調(diào)以及TNFSR11(RANKL)(骨細(xì)胞活性)的上調(diào)。PCR結(jié)果特別是骨活性的激活與觀察到的宏觀骨髓改變(骨骺生長、骨脆性)一致。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)骨髓表型以及評(píng)價(jià)骨脂肪組織是否被激活(骨代謝和完整性的測定)，在年齡性別匹配的對(duì)照和短期高胃泌素動(dòng)物中使用了基于鋨染色的程序。值得注意的是在處理的動(dòng)物中攝入量顯著地增加了(圖20)。這與“老年的”骨/骨質(zhì)疏松癥的表型一致。這些結(jié)果證實(shí)了短期高胃泌素血癥與骨改變有關(guān)，所述骨改變與等同于骨質(zhì)疏松癥的形態(tài)學(xué)外觀相似。此后，用骨組織形態(tài)測定術(shù)進(jìn)行了檢測。這些研究確定了在處理8周和16周的乳鼠屬中，隨著吸收腔的增加以及顯著增加(p<0.05)的TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量，降低了骨礦化(15±6p<0.05和16±4.5p<0.05，與對(duì)照9±3相比)。還注意到了骨樣縫和骨軟化的證據(jù)(圖21)。最后，在乳鼠屬中用Instron裝置檢測了骨強(qiáng)度。股骨以四點(diǎn)彎曲載荷損壞。用伺服液壓測試機(jī)以0.05mm/sec的偏轉(zhuǎn)率進(jìn)行測試(Instronmodel8874；Instron公司，Norwood，MA，美國)。最后，在乳鼠屬中用Instron裝置檢測了骨強(qiáng)度。股骨以四點(diǎn)彎曲載荷損壞。用伺服液壓測試機(jī)以0.05mm/sec的偏轉(zhuǎn)率進(jìn)行測試(Instronmodel8874；Instron公司，Norwood，MA，美國)。硬度在158-173N/mm的范圍。使骨頭骨折所需要的最大載荷范圍在32.8-45.7N/mm。這些值彼此強(qiáng)烈的相關(guān)(圖17A，R2＝0.86，p<0.003，線性回歸分析)。骨密度(microCT)和骨折力的比較確定了骨小梁(R2＝0.54，22B)和皮層(R2＝0.71，22C)骨的相關(guān)性。因此，使用Instron裝置測定骨強(qiáng)度提供了與高胃泌素血癥期間異常和脆性的骨表型發(fā)展一致的額外信息。這些醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支持了高胃泌素模型中胃泌素驅(qū)動(dòng)的“骨質(zhì)疏松性”表型生物學(xué)基礎(chǔ)的證據(jù)?？偨Y(jié)(圖23和24)：短期高胃泌素血癥(8周)引起股骨中明顯和可測定的骨質(zhì)疏松性改變。在胃的竇部，短期高胃泌素血癥與活躍的G細(xì)胞(轉(zhuǎn)錄本)、增加PTH1R以及降低的雌性激素響應(yīng)性(ERα/β和AR)有關(guān)，但沒有改變CaSR的表達(dá)。骨分析觀察結(jié)果與出于更年期后狀況的人中的那些類似。延長到16周的高胃泌素血癥(慢性模型)導(dǎo)致股骨中可測定的骨質(zhì)疏松性改變，并與竇的CaSR和ERα以及PTH1R表達(dá)的增加有關(guān)(圖17)。G細(xì)胞上的升高的循環(huán)胃泌素和增加的PTH1R表達(dá)的組合為與骨質(zhì)疏松癥表型相關(guān)的一致性特征。這些結(jié)果表明高胃泌素乳鼠屬為評(píng)價(jià)胃泌素對(duì)骨病理生理學(xué)影響的合適的模型，并證明了高胃泌素血癥對(duì)骨的顯著前骨質(zhì)疏松性影響。實(shí)施例6：在切除卵巢的乳鼠屬中酸阻斷對(duì)骨動(dòng)力學(xué)的影響對(duì)于骨研究，卵巢切除術(shù)是產(chǎn)生“更年期后”表型的標(biāo)準(zhǔn)程序。由于雌性激素顯示出G細(xì)胞調(diào)節(jié)效應(yīng)(見圖6)，因此接下來評(píng)價(jià)了在未處理的動(dòng)物中、在切除卵巢的動(dòng)物中，以及在具有短期(8周)和長期(16周)高胃泌素血癥的切除卵巢的動(dòng)物中，雌性激素?fù)p失對(duì)骨表型的特殊的作用。在乳鼠屬中，用后路手術(shù)進(jìn)行了雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)以及輸卵管結(jié)扎。8周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了研究。循環(huán)激素：8周后，由于卵巢切除術(shù)，雌性激素減少。然而，血清PTH增加了～2倍(圖25)。胃：卵巢切除術(shù)與嗜鉻粒蛋白A(CgA)和HDC轉(zhuǎn)錄的顯著增加有關(guān)，但胃泌素的表達(dá)沒有被改變(圖26)。這證明雌性激素在胃中的一個(gè)影響是下調(diào)ECL細(xì)胞組胺合成。卵巢切除術(shù)增加了雄性激素(6倍)和雌性激素受體(ESRα/β都為：4-7倍)以及CaSR(5倍)和PTH1R(4倍)的胃粘膜轉(zhuǎn)錄(圖27)。因此，雌性激素的除去導(dǎo)致參與傳感和響應(yīng)膳食鈣的胃部細(xì)胞受體(即CaSR和甲狀旁腺軸(PTH1R))可檢測的變化。短期高胃泌素血癥/OVX模型：卵巢切除術(shù)模型中的短期高胃泌素血癥增加了循環(huán)PTH(圖25)。在胃中，胃泌素和HDC轉(zhuǎn)錄本都被抑酸(8周洛克替丁)和OVX的組合升高了(圖26B-D)。隨著OVX發(fā)生的受體(即AR/ESRα/β、CaSR和PTH1R)的增加的表達(dá)(即圖27)在高胃泌素性動(dòng)物中沒有被鑒定出。水平被降低并且不再與對(duì)照不同(圖28)。這表明酸分泌的藥理抑制(伴隨著胃pH和胃泌素的升高)使參與鈣傳感的受體的胃表達(dá)正常化了，即使當(dāng)雌性激素被除去時(shí)。長期高胃泌素血癥/OVX模型：16周高胃泌素血癥與血漿PTH水平的正?；嘘P(guān)(圖30)。在胃中，HDC被升高了(圖26)。在16周處理的動(dòng)物中，AR/ESRα/、CaSR和PTH1R的水平與對(duì)照沒有差異(圖28)。在長期模型中，胃的受體表達(dá)涉及鈣敏，因?yàn)樵诙唐谀Ｐ椭校诖菩约に厝コ陂g，其是正常的。在OVX和高胃泌素性O(shè)VX模型中的骨形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)：MicroCT分析：骨小梁形貌顯示于圖29。骨測量確定了密度和體積隨著卵巢切除術(shù)降低了～50％。這與嚙齒動(dòng)物卵巢切除術(shù)的之前的報(bào)道一致(圖30A，C)。胃泌素介導(dǎo)的降低在長期高胃泌素性動(dòng)物(降低了80-85％)中最顯著(p<0.005)。后面的動(dòng)物也顯示出了皮層密度的降低(～5％，p<0.05)(圖30B)。皮層骨體積在所有的OVX動(dòng)物中降低了(～15％)，但在短期高胃泌素性動(dòng)物中最顯著(p<0.005，～30％)(圖30D)。皮層骨的進(jìn)一步測量確定了在骨內(nèi)膜和骨膜中的顯著降低。OVX降低了半徑(20％)和周長(18％)(圖31A-D)。在短期高胃泌素性動(dòng)物中確定了更為顯著的降低(半徑：25-30％；周長：27％)。，這些都小于在單獨(dú)的OVX期間測定的降低(p<0.02)。長期高胃泌素性動(dòng)物中的測量與單獨(dú)的OVX不同。這些結(jié)果確定了升高的循環(huán)胃泌素水平放大了雌性激素丟失介導(dǎo)的骨變化。短期高胃泌素血癥最顯著的效果是在皮層骨和骨內(nèi)膜/骨膜的水平上，而長期高胃泌素血癥的效果在骨小梁中是占優(yōu)勢的，這確定了后者在骨代謝和強(qiáng)度的調(diào)節(jié)中還具有作用。為了評(píng)價(jià)后者，進(jìn)行了強(qiáng)度測試研究。骨組織形態(tài)測定術(shù)：隨著吸收腔的增加以及TRAP陽性破骨細(xì)胞(26.8±11與對(duì)照9±3相比，p<0.05)的數(shù)量顯著增加(p<0.05)，卵巢切除術(shù)與骨礦化的降低有關(guān)(圖32)。骨機(jī)械強(qiáng)度試驗(yàn)：股骨的四點(diǎn)彎曲分析確定了OVX動(dòng)物中剛度的增加(圖33A)。OVX也降低了最大載荷和骨折載荷(圖33B，C)。這表明雌性激素?fù)p失本身降低了骨的強(qiáng)度(皮層效應(yīng))，同時(shí)增加了其剛度(桿狀/板狀的改變有關(guān)的骨小梁效應(yīng))。短期高胃泌素血癥降低了使骨頭骨折所需的功的量(圖33D)。這些參數(shù)表示與弱的、受損的皮層骨一致的影響(圖30-31)。OVX產(chǎn)生的骨的剛度被短期高胃泌素血癥逆轉(zhuǎn)了，表明這些胃泌素的影響僅限于骨重建的活化和吸收階段。長期高胃泌素血癥逆轉(zhuǎn)了使骨頭骨折所需的載荷和功。然而，骨的剛度在與骨小梁改變一致的這些動(dòng)物中增加了(圖30)。這與包括骨形成的逆轉(zhuǎn)和形成階段的骨重建表型一致，但在骨是硬的因而是脆的中是異常的。機(jī)械強(qiáng)度評(píng)價(jià)：pMOI(極慣性矩)為骨總強(qiáng)度(和剛度)的度量，并與及載荷損壞成比例(扭轉(zhuǎn))。其在畸形愈合中增加了。評(píng)價(jià)了該參數(shù)以提供額外的骨強(qiáng)度測定，因?yàn)槠涮貏e表示了骨弱(boneweakness)的測定。OVX降低了pMOI，其被短期高胃泌素血癥進(jìn)一步顯著地減少了(圖34A)。這確認(rèn)了卵巢切除術(shù)削弱了骨頭，并證明胃泌素的增加惡化了骨頭的弱點(diǎn)。長期高胃泌素血癥與pMOI(與對(duì)照相比)降低有關(guān)，但與單獨(dú)的OVX沒有差異。在短期(異常的活化和重建)和長期(異常的逆轉(zhuǎn)和骨形成)的暴露期間，這與四點(diǎn)彎曲的數(shù)據(jù)一致(見上面)并突出了胃泌素的效果。骨髓的實(shí)時(shí)PCR分析：與骨重建有關(guān)的五個(gè)基因被OVX顯著地改變了(兩個(gè)降低以及三個(gè)升高)。特別是，皮層骨髓源ALOX5(炎癥)和RUNX2(成骨細(xì)胞分化)顯著地降低了(圖35)。CXCL12、PPARγ和HIF-1α的表達(dá)增加了。CXCL12與PTH介導(dǎo)的成骨細(xì)胞活化、脂肪細(xì)胞分化的PPARγ(骨保護(hù)機(jī)制)和組織缺氧介導(dǎo)骨損傷的HIF-1α(負(fù)調(diào)節(jié)RUNX2的表達(dá)，與骨膜的成骨祖細(xì)胞活化有關(guān))有關(guān)。這與成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞活化的抑制一致。短期(8周)和長期(16周)高胃泌素血癥都沒有顯著地改變(放大或抑制)骨重建中OVX介導(dǎo)的基因表達(dá)的改變。然而，PTGS2(或可誘導(dǎo)的COX2)被胃泌素顯著地降低了。這是一種骨損傷的應(yīng)答，并與與保護(hù)有關(guān)的生物學(xué)應(yīng)答一致?？偨Y(jié)(圖36)：乳鼠屬模型中卵巢切除術(shù)有關(guān)的骨(骨小梁和皮層)異常與骨生理學(xué)(成骨細(xì)胞功能的抑制)和源于皮層的骨骨髓細(xì)胞水平的基因表達(dá)的改變有關(guān)。這與胃黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記的增加有關(guān)，所述標(biāo)記包括HDC和鈣敏/PTH1R應(yīng)答。卵巢切除術(shù)后的短期高胃泌素血癥進(jìn)一步以與單獨(dú)卵巢切除術(shù)的骨表型(降低的骨小梁以及皮層密度和體積)和骨髓基因表達(dá)譜(例如HIF-1α的活化)相似的變化削弱了骨頭。增加胃泌素的轉(zhuǎn)錄是胃中最顯著的改變，并使CaSR/PTH1R表達(dá)正?；?。長期高胃泌素血癥導(dǎo)致弱的和非常硬的骨頭。在表型(骨小梁以及皮層密度和體積的降低)和在骨髓基因的表達(dá)(HIF-1α的活化)方面看到與單獨(dú)卵巢切除術(shù)相似的改變。最顯著的胃的改變是伴隨著CaSR/PTH1R表達(dá)正?；腍DC的活化?？傊?，骨質(zhì)流失/異常與細(xì)胞的骨髓活化的變化以及胃黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的改變有關(guān)。實(shí)施例7：對(duì)胃神經(jīng)內(nèi)分泌功能和骨動(dòng)力學(xué)的影響：基因敲除小鼠模型-有或沒有卵巢切除術(shù)使用胃泌素和組胺的敲除模型的研究證明了組胺和胃泌素在骨代謝調(diào)節(jié)(整合性)中的關(guān)系，并提高了胃泌素和組胺在不同物種模型到乳鼠屬中的作用。這些研究評(píng)價(jià)了胃泌素介導(dǎo)的組胺分泌對(duì)骨生物學(xué)的影響(以及我們觀察到的G細(xì)胞被雌性激素調(diào)節(jié))。使用了三種敲除的組合：HDC敲除小鼠以及胃泌素敲除和兩者結(jié)合(HDC/GAS)敲除的動(dòng)物。循環(huán)激素：a)隨著卵巢切除術(shù)，在所有的三種敲除模型中，雌性二醇被降低(80-90％)到了相似的水平(～2pg/ml)(圖37)。b)在胃泌素和雙敲除的小鼠中胃泌素是低的(10-20pg/ml)；在HDC敲除的動(dòng)物中，胃泌素水平比GAS或GAS/HDC敲除的動(dòng)物高出5x。這些水平?jīng)]有被卵巢切除術(shù)影響，并與正常飲食的乳鼠屬相似。PTH水平在所有的三種敲除的模型中相似(圖37)，但是是正常飲食的乳鼠屬的-50％。卵巢切除術(shù)在HDC和HDC/GAS敲除的動(dòng)物中增加了PTH水平，與雌性激素對(duì)甲狀旁腺分泌物的抑制影響的丟失一致。這表明缺乏組胺對(duì)甲狀旁腺?zèng)]有影響。相比之下，PTH在GAS敲除的動(dòng)物中隨著卵巢切除術(shù)降低了。在乳鼠屬中，8周的高胃泌素血癥增加了PTH的釋放，并且在體外實(shí)驗(yàn)中，確認(rèn)了胃泌素介導(dǎo)PTH釋放。這表明生理上的PTH釋放需要胃泌素。雌性激素和胃泌素丟失的組合導(dǎo)致“低的”PTH分泌甲狀旁腺。由于PTH通過RANK成骨細(xì)胞(骨吸收)102與破骨細(xì)胞的活化有關(guān)，因此在這種環(huán)境中，胃泌素的缺乏能夠被解釋為“保護(hù)性的”。胃：在胃泌素KO的動(dòng)物中，OVX顯著地上調(diào)了底部中的CCK2受體(3倍)(圖38)并增加了HDC10倍，表明雌性激素發(fā)揮著對(duì)ECL細(xì)胞的抑制影響。在竇部G細(xì)胞中，OVX下調(diào)了CaSR60％，表明G細(xì)胞的鈣敏感性被雌性激素調(diào)節(jié)。與對(duì)照(沒有卵巢切除術(shù))相比，在HDCKO的動(dòng)物中，OVX下調(diào)了包括CaSR、PTH1R和CCK2大部分的靶標(biāo)基因。胃泌素也被顯著的下調(diào)了。在雙KO的動(dòng)物中，CCK2被卵巢切除術(shù)上調(diào)了。這些數(shù)據(jù)表明雌性激素調(diào)節(jié)了涉及鈣敏以及因此鈣代謝的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，。特別是，胃的ECL和G細(xì)胞是雌性激素應(yīng)答性的，特別是在鈣生理學(xué)方面。骨形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)：骨microCT：在胃泌素KO的小鼠中，卵巢切除術(shù)對(duì)股骨的密度和體積沒有顯著的影響，但增加了骨內(nèi)膜和骨膜的厚度(圖39A)。這直接與在短期和長期高胃泌素血癥中注意到的效果相反(降低了骨小梁以及皮層骨密度和體積，以及骨內(nèi)膜和骨膜的測定–見圖24)。這導(dǎo)致與沒有切除卵巢的骨頭相比，不硬以及削弱的骨頭。這證明胃泌素的缺乏(在低的雌性激素環(huán)境中)具有保護(hù)性，并可反映這些動(dòng)物中的低的循環(huán)PTH水平。HDCKO小鼠：在HDCKO的小鼠中，卵巢切除術(shù)對(duì)股骨密度和體積，或?qū)莾?nèi)膜/骨膜的厚度沒有顯著的影響。然而，所述骨頭與沒有切除卵巢的骨頭相比是硬的，需要較高的載荷來骨折，并顯示出了增加的pMOI(p<0.03)(圖39B)。因此，我們的調(diào)查確認(rèn)了早期的研究99，所述早期的研究為雌性激素和組胺丟失的結(jié)合增加了骨強(qiáng)度。Gas/HDCKO小鼠：在胃泌素/HDC雙KO的小鼠中，卵巢切除術(shù)對(duì)股骨密度沒有顯著的影響，但骨小梁和皮層體積降低了(p<0.03)(圖39C)。沒有看到骨內(nèi)膜/骨膜厚度的改變。這導(dǎo)致與沒有切除卵巢的骨頭相比沒有被削弱的骨頭。骨髓qPCR：在胃泌素KO的動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)與兩個(gè)基因(ALOX5和CXCL12)的上調(diào)有關(guān)。(圖40A-B)。這些通過PTH分別參與白細(xì)胞三烯的合成和炎癥以及成骨細(xì)胞的活化。在乳鼠屬模型中，卵巢切除術(shù)下調(diào)了ALOX5，但上調(diào)了CXCL12，影響沒有被高胃泌素血癥顯著改變。在HDC和HDC/GASKO的動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)沒有顯著的影響，表明組胺在這兩個(gè)基因的調(diào)節(jié)中沒有起到作用。骨髓PCR也確認(rèn)了在胃泌素KO動(dòng)物中，卵巢切除術(shù)與HIF-lα和IGFl的上調(diào)有關(guān)(圖40C-D)。如在前面指出的，這些分別參與了骨祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)和骨量的維持?？偨Y(jié)(圖41)：在小鼠模型中，胃泌素丟失(在低的雌性激素環(huán)境中)改變了骨的生理學(xué)。卵巢切除術(shù)與短期或長期的高胃泌素血癥的比較(在乳鼠屬模型中)，導(dǎo)致顯著更軟的骨頭。因此，胃泌素似乎對(duì)骨髓具有不利的以及“抗保護(hù)的”影響。單獨(dú)的HDCKO(在低的雌性激素環(huán)境下)與顯著較強(qiáng)(更硬)的骨頭有關(guān)，表明組胺，如胃泌素，在骨生理學(xué)上起著調(diào)節(jié)的作用。組胺的去除(通過HDCKO)逆轉(zhuǎn)了這一效果，并且因此與胃泌素和組胺協(xié)力是骨生理學(xué)中的關(guān)節(jié)調(diào)節(jié)子的結(jié)論一致。在低的雌性激素環(huán)境中，胃泌素和HDC丟失(例如，組胺的丟失)的結(jié)合與顯著較弱的骨頭沒有關(guān)系，并且骨動(dòng)力學(xué)與正常的沒有不同。這表明組胺(如胃泌素)可激活“骨質(zhì)疏松”樣的骨表型。因此，組胺的降低(去除)(通過HDCKO)逆轉(zhuǎn)了由于雌性激素減少引起的前骨質(zhì)疏松癥的影響。實(shí)施例8：原理證明的研究：在三種嚙齒動(dòng)物模型中，胃泌素拮抗劑對(duì)卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨表型的影響在三種嚙齒動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)了胃泌素拮抗劑(YF476)對(duì)OVX介導(dǎo)的骨密度丟失/骨變化的影響，集中于骨強(qiáng)度的研究、形態(tài)學(xué)和循環(huán)生物標(biāo)記。檢測了兩種“正常的”O(jiān)VX模型：a)小鼠(株系：CD-1[瑞士株系]–CharlesRiver)和b)大鼠(株系：CDIGS[SpragueDawley株系]–CharlesRiver)，以及乳鼠屬(內(nèi)源性被激活的胃泌素/CCK2受體信號(hào))模型。讓在兩個(gè)月大時(shí)進(jìn)行了手術(shù)(OVX)的動(dòng)物恢復(fù)，然后被暴露于口服的抑酸劑以及胃泌素拮抗劑(GA)，YF476(單獨(dú)注射)。小鼠和大鼠都被暴露于PPI奧美拉唑下，而乳鼠屬被暴露于H2受體拮抗劑洛克替丁(loxitidine)下。GA給藥是以抑酸開始的單一皮下注射。藥代動(dòng)力學(xué)上，其劑量范圍為15-20nmol經(jīng)過8周的時(shí)間。關(guān)于劑量的描述包括在表3中。表3：劑量的理論驗(yàn)證研究物種酸抑制劑GA小鼠–CD-12ml/10g體重，21μg/mg/天)15ug/動(dòng)物大鼠–CD0.8ml/10g體重，8.5μg/mg/天50ug/動(dòng)物乳鼠屬0.85ml/10g體重，82.7-91.2μg/mg/天10ug/動(dòng)物每種動(dòng)物模型都包括三組：a)A組＝安慰劑鹽溶液處理(沒有OVX/對(duì)照)，b)B組＝OVX+抑酸治療(OVX)，以及c)組＝GA處理切除卵巢的動(dòng)物(OVX+GA)。在研究結(jié)束時(shí)(2個(gè)月)，我們評(píng)價(jià)了GA是否逆轉(zhuǎn)OVX介導(dǎo)的骨參數(shù)的改變(microCT，骨強(qiáng)度和形態(tài)計(jì)量學(xué)以及循環(huán)標(biāo)記)。模型1：小鼠OVX：在GA處理開始時(shí)，動(dòng)物為89天(3.0個(gè)月)大，在研究結(jié)束時(shí)，它們?yōu)?46天(4.8個(gè)月)大。檢測的骨小梁骨的數(shù)據(jù)確定了卵巢切除術(shù)顯著降低了BV/TV(0.05±0.02對(duì)0.18±0.04，p<0.05)以及密度(37±5對(duì)173±18，p<0.05)，并增加了SMI(1.8±1.2對(duì)1.1±0.4，p<0.05)和骨小梁間距(0.6±0.18對(duì)0.28±0.05，p<0.05)(表4，圖42)。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨變化，除了骨小梁的厚度和間距，所述骨小梁的厚度和間距保持了增加。這與骨小梁的骨密度的顯著增加有關(guān)(70.7±19，p<0.05與OVX相比)。表4.模型1中的骨小梁結(jié)果&表觀密度(骨小梁)；*p<0.05與對(duì)照相相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)皮層骨參數(shù)分析確定了卵巢切除術(shù)顯著地降低了骨表面積(11.6±0.9對(duì)13.4±1.4，p<0.05)，增加了皮層厚度(0.2±0.01對(duì)0.15±0.01，p<0.05)，并與降低的皮層密度989±26對(duì)1153±39，p<0.05有關(guān)(表5，圖43)。胃泌素-拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了OVX介導(dǎo)的在密度方面的降低(1025±37，p<0.05相比于OVX)。表5.模型1中的皮層骨數(shù)據(jù)&表觀密度(皮層)；*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)使用Instron設(shè)備骨強(qiáng)度的測量確定了胃泌素拮抗劑在逆轉(zhuǎn)OVX介導(dǎo)的骨表型中的功效。卵巢切除術(shù)顯著地降低了(p<0.05)骨強(qiáng)度(剛度[246±29對(duì)294±34]，屈服剛度[221±28對(duì)271±33]，骨折載荷的斷裂量[37±6對(duì)56±7])和需要破壞骨頭增加的總功[28.3±9.7對(duì)20.4±2.3，p<0.05]。胃泌素拮抗劑處理使這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨變化正?；?，除了骨折載荷[43±6]之外，所述骨折載荷雖然增加了，但還是保持低于對(duì)照(表6，圖44)。表6.骨強(qiáng)度數(shù)據(jù)*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未受處理的)形態(tài)計(jì)量學(xué)確定了在OVX小鼠中，隨著吸收腔的增加以及TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量(29±5對(duì)16±3，p<0.05)的增加(p<0.05)降低的骨礦化。胃泌素-拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些現(xiàn)象(圖45)。卵巢切除術(shù)顯著地(p<0.05)降低了循環(huán)雌性激素(1.9±0.9pg/ml對(duì)5.1±1.9)，并與PTH(123±74pg/ml對(duì)51±32)和胃泌素(3200±263pg/ml對(duì)2437±787)的增加有關(guān)。用拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的在胃泌素方面的增加，但沒有逆轉(zhuǎn)PTH(表7，圖46)。循環(huán)骨生物標(biāo)記還被OVX改變了。特別是，PINP增加了(0.19±0.01ng/ml對(duì)0.1y±0.006，p<0.05)，CTx-1也是如此(0.60±0.14ng/ml對(duì)0.29±0.13，p<0.05)，骨鈣素升高了(6.7±2.3ng/ml對(duì)4.1±1.2，p<0.05)。拮抗劑處理減弱了這三種中的每一種的卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的改變。表7.三組中的循環(huán)血液水平*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)總結(jié)(模型1)：在小鼠模型中，單一注射胃泌素拮抗劑與卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨改變(在第8周檢測)的逆轉(zhuǎn)有關(guān)。盡管循環(huán)雌性激素低以及PTH水平高，這些效果發(fā)生了，并且被形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)(礦化、破骨細(xì)胞的數(shù)量)以及與合成代謝作用一致的循環(huán)骨生物標(biāo)記表達(dá)的正?；C明了。模型2：大鼠OV模型：在GA處理開始時(shí)，動(dòng)物為98天(3.2個(gè)月)大，在研究結(jié)束時(shí)，它們?yōu)?63天(5.4個(gè)月)大。檢測骨小梁的數(shù)據(jù)確定了卵巢切除術(shù)顯著地降低了BV/TV(0.15±0.03相對(duì)于0.27±0.07，p<0.05)和密度(159±26相對(duì)于287±71，p<0.05)。骨小梁間距(0.58±0.1相對(duì)于0.44±0.19，p<0.05)以及SMI(1.5±0.2相對(duì)于0.6±0.4，p<0.05)增加了(表8，圖47)。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨變化，除了保持增加的SMI(1.3±0.17)之外。這與骨小梁的密度的增加(204±27，p<0.05相比于OVX)有關(guān)。表8.來自模型2的骨小梁數(shù)據(jù)結(jié)果&表觀密度(骨小梁)；*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)皮層骨參數(shù)分析確定了卵巢切除術(shù)顯著降低了骨表面(42.7±2.5相比于49.9±3，p<0.05)，增加皮層厚度(0.66±0.03相比于0.61±0.07，p<0.05)，并與皮層密度的降低(1067±22相比于1144±17，p<0.05)有關(guān)(表9，圖48)。胃泌素-拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了OVX介導(dǎo)的在密度方面的降低(1098±24，p<0.05相比于OVX)。表9.來自模型2的皮層骨數(shù)據(jù)結(jié)果&表觀密度(皮層)；*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未受處理的)使用Instron設(shè)備測定骨強(qiáng)度確定了胃泌素拮抗劑在逆轉(zhuǎn)OVX介導(dǎo)的骨表型中的功效。卵巢切除術(shù)顯著地降低了(p<0.05)骨強(qiáng)度(剛度[495±43相比于578±48]，屈服剛度[445±39相比于526±66]，骨折載荷的斷裂量[265±29相比于300±17])。胃泌素拮抗劑處理使這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨變化正常化(表10，圖49)。表10.骨強(qiáng)度數(shù)據(jù)*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未受處理的)形態(tài)計(jì)量學(xué)確定了在OVX大鼠中，隨著吸收腔的增加以及TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量(11±3相對(duì)于2±2，p<0.05)的增加(p<0.05)改變了骨的礦化。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些現(xiàn)象(圖50)。卵巢切除術(shù)顯著地(p<0.05)降低了循環(huán)雌性激素(2.1±0.3pg/ml相比于5.3±2.5)，并與在胃泌素(3200±789pg/ml相比于954±406)方面的增加有關(guān)。用拮抗劑處理對(duì)雌性激素或胃泌素沒有顯著的影響(表11，圖51)。循環(huán)骨生物標(biāo)記還被OVX改變了。具體來說，PINP(0.57±0.18ng/ml相比于0.35±0.06，p<0.05)和骨鈣素(1.35±0.9ng/ml相比于0.43±0.07，p<0.05)都被升高了。用拮抗劑處理減弱了這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的變化中的每一種。表11.在三組中的循環(huán)血液標(biāo)記水平*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)總結(jié)(模型2)：在大鼠模型中，單一注射胃泌素拮抗劑與卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨改變的逆轉(zhuǎn)有關(guān)(在第8周檢測)。盡管循環(huán)雌性激素低以及PTH水平高，但是這些效果發(fā)生了，并且被形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)(礦化、破骨細(xì)胞的數(shù)量)以及與合成代謝作用一致的循環(huán)骨生物標(biāo)記表達(dá)的正常化證明了。模型3：乳鼠屬OVX模型：在GA處理開始時(shí)，動(dòng)物為121天(4.0個(gè)月)大，在研究結(jié)束時(shí)，180天(6.0個(gè)月)大。卵巢切除術(shù)顯著地降低了BV/TV比(0.06±0.03相比于0.14±0.05，p<0.05)，骨小梁的數(shù)量(1.4±0.3相比于2.0±0.6，p<0.05)和骨表面(8.5±3.7相比于18.5±2.3，p<0.05)，并增加了SMI(1.1±0.3相比于0.74±0.21，p<0.05)，以及骨小梁間距(0.82±0.15相比于0.57±0.17，p<0.05)(表12，圖52)。這與在骨小梁密度(60.6±37相比于157±51，p<0.05)方面的顯著降低有關(guān)。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨改變，使骨小梁骨密度(187±66)正?；Ｋ幬镞€與骨小梁的數(shù)量(2.4±0.6，p<0.05，相比于對(duì)照)和厚度(0.08±0.01，p<0.05，相比于對(duì)照)的增加有關(guān)。表12.來自模型3的骨小梁的數(shù)據(jù)結(jié)果&表觀密度(骨小梁)；*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)皮層骨參數(shù)的評(píng)價(jià)確定了卵巢切除術(shù)沒有顯著地改變?nèi)魏纹庸菂?shù)(表13，圖53)。胃泌素拮抗劑處理在切除卵巢的動(dòng)物中沒有影響。表13.來自模型3的皮層骨數(shù)據(jù)結(jié)果&表觀密度(皮層)；*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)使用Instron設(shè)備的骨強(qiáng)度的測定確定了胃泌素拮抗劑在逆轉(zhuǎn)OVX介導(dǎo)的骨表型中的功效。卵巢切除術(shù)顯著地降低了(p<0.05)骨強(qiáng)度(剛度[138±7相比于332±65]，屈服剛度[125±6相比于299±59]，斷裂的骨折載荷[8±4相比于56±13])并提高了破壞骨頭需要的總功[51±7.7相比于34±11.6，p<0.05]。胃泌素拮抗劑處理使這些卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨變化正?；?表14，圖54)。表14.骨強(qiáng)度數(shù)據(jù)*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)形態(tài)計(jì)量學(xué)確定了在OVX乳鼠屬中，隨著吸收腔的增加以及TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量(27±11相比于9±3，p<0.05)的增加(p<0.05)降低了骨礦化。胃泌素拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了這些現(xiàn)象(圖55)。卵巢切除術(shù)顯著地(p<0.05)降低了循環(huán)雌性激素(1.9±0.6pg/ml相對(duì)于8.9±2.1)，并與PTH(523±308pg/ml相對(duì)于290±71)和胃泌素(7265±3198pg/ml相對(duì)于3705±2015)方面的增加有關(guān)。用拮抗劑處理逆轉(zhuǎn)了卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的胃泌素(2704±430)和PTH(150±37)的增加(表15，圖56)。循環(huán)骨生物標(biāo)記還被OVX改變了。具體來說，PINP增加了(0.16±0.03ng/ml相對(duì)于0.13±0.01，p<0.05)，CTx-1同樣如此(0.24±0.17ng/ml相對(duì)于0.03±0.03，p<0.05)，而骨鈣素升高了(1.6±1.1ng/ml相對(duì)于0.4±0.16，p<0.05)。用拮抗劑處理減弱了這三種卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的變化中的每一種。表15.在三組中的循環(huán)血液標(biāo)記水平*p<0.05與對(duì)照相比；**p<0.05與單獨(dú)的OVX相比(未處理的)；#p＝0.07與對(duì)照相比總結(jié)(模型3)：在乳鼠屬模型中，單一注射胃泌素拮抗劑與卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨改變的逆轉(zhuǎn)有關(guān)(在第8周檢測)。盡管循環(huán)雌性激素低，但是這些效果還是發(fā)生了，并且被形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)(礦化、破骨細(xì)胞的數(shù)量)以及與合成代謝作用一致的循環(huán)骨生物標(biāo)記表達(dá)的正常化證明了。總結(jié)(模型1、2和3)：在三種模型中，單一注射胃泌素拮抗劑(10-20μMg體重)逆轉(zhuǎn)了卵巢切除術(shù)介導(dǎo)的骨質(zhì)流失和強(qiáng)度，恢復(fù)正?；蜈呄蛴谡；?。盡管低的循環(huán)雌性激素以及高的PTH水平，這還是發(fā)生了，并與前骨(pro-bone)量信號(hào)的變型有關(guān)。在整個(gè)申請(qǐng)中，參考了各種網(wǎng)站數(shù)據(jù)內(nèi)容、出版物、專利申請(qǐng)和專利。(網(wǎng)站是由他們的統(tǒng)一資源定位器，或URL引用，網(wǎng)址在萬維網(wǎng)上)每一個(gè)這些參考的公開通過引用于此其全部內(nèi)容并入到本發(fā)明中。本發(fā)明公開的實(shí)施例不能限制本發(fā)明的范圍，其旨在本對(duì)本發(fā)明的單個(gè)方面的一對(duì)一的說明，任何功能等同的那些都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除了本發(fā)明中描述的那些，根據(jù)前面的描述和教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的模型和方法的各種改變是顯而易見的，并且相似的確定為落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種改變或其他的實(shí)施方式可在沒有脫離本發(fā)明精神真正的范圍內(nèi)被實(shí)踐。當(dāng)前第1頁1 2 3