一種中東呼吸綜合征冠狀病毒中和抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中東呼吸綜合征冠狀病毒中和抗體及其制備方法，屬于細胞免疫【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用桿狀病毒表達系統(tǒng)體外表達、純化獲得了MERS-CoV病毒S蛋白受體結(jié)合區(qū)域RDB蛋白，并用該高純度MERS RBD蛋白免疫Bab/c小鼠，通過ELISA和假病毒中和實驗等方法篩選到高效的抗病毒的中和抗體，為臨床檢測甚至預防和治療MERS-CoV病毒感染提供了可能。
【專利說明】-種中東呼吸綜合征冠狀病毒中和抗體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中東呼吸綜合征冠狀病毒中和抗體及其制備方法，屬于細胞免疫

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East Respiratory Syn化ome Cononaviruse，MERS-CoV)與SARS-CoV同屬冠狀病毒科，beta冠狀病毒屬。為正鏈、單鏈 RNA病毒。它表面刺突蛋白一S蛋白在病毒感染人和動物時起著關(guān)鍵作用。曾有科學家推 測此病毒可能有來源于騙幅。序列分析發(fā)現(xiàn)，MERS-CoV病毒與騙幅和豬冠狀病毒序列同源 性非常高，與騙幅冠狀病毒HKU4和HK呪可高達60%。目前仍然沒有確定MERS-CoV病毒的 來源和天然宿主，無法采取有效的措施來預防和阻止此病毒傳播。
[000引 由于臨床病癥中MERS-CoV和SARS-CoV之間的相似性，提出它們可能會使用相同 的細胞受體一血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)。然而，進一步研究發(fā)現(xiàn)；二膚基膚酶-4值PP4,也 被稱為CD26)是MERS-CoV的受體，在人支氣管和腎上皮細胞表達。病毒感染人時，病毒S 蛋白受體結(jié)合區(qū)化ec巧tor Binding Domain, RBD)會與該種蛋白結(jié)合，病毒W(wǎng)它們?yōu)?登陸 點"，附著到呼吸道細胞上，隨之進一步侵人體內(nèi)。CD26蛋白的氨基酸序列是高度保守的，還 存在于騙幅和其他許多動物體內(nèi)，因此，MERS-CoV病毒可能利用該種蛋白質(zhì)在多個物種之 間持續(xù)傳播，有較大的潛在威脅。目前，感染MERS-CoV病毒后尚無有效治療藥物，主要是對 癥治療，也沒有預防性疫苗。單克隆抗體是針對特異抗原產(chǎn)生的特異抗體，它具有高度專一 性，能精確地瞄準、捕獲目標祀點，特異性地與祀目標發(fā)生反應(yīng)，從而直接清除病毒的目的。
[0004] MERS-CoV病毒表面有一個膜蛋白稱之為S蛋白，在病毒的復制和生命周期中發(fā)揮 著重要作用。S蛋白上有部分區(qū)域，稱之為受體結(jié)合區(qū)化ec巧tor Binding Domain, RBD) 可W與細胞表面的CD26蛋白結(jié)合，介導病毒感染細胞。因而，尋找和制備有效的抗體阻止 MERS RBD蛋白結(jié)合CD26蛋白，進而抑制病毒侵染細胞，成為檢測、預防和治療MERS-CoV病 毒感染的方法之一。通過制備抗MERS R抓蛋白單克隆抗體，篩選可與之特異性結(jié)合的中和 抗體，在分子水平上分析抗體與之結(jié)合的關(guān)鍵位點，進一步對其人源化，已成為制備預防或 治療性抗體的有效手段。目前還沒有關(guān)于抗MERS-CoV病毒中和抗體的報道。
[0005] 由于目前缺乏抗MERS-CoV病毒中和抗體，而且制備大量抗體及應(yīng)用于臨床需要 較長時間，不能快速有效在臨床上進行檢測。
[0006] 本發(fā)明描述了篩選具有中和活性的MERS-CoV鼠源單克隆抗體的技術(shù)，用于 MERS-CoV的檢測甚至預防和治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)中和抗體，包含氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序 列如SEQ IDN0. 2所示的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述MERS-CoV抗體是鼠源單克隆抗體2E6,其重鏈、 輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ IDM0. 3、SEQ ID NO. 4所示。
[0009] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種制備MERS-CoV鼠源單克隆中和抗體 的方法，首先是制備MERS-CoV病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白（MERS RBD)，然后W該蛋白為抗原篩選 到抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法主要包括W下步驟：
[001。 （1) W pFas巧acl為表達載體，構(gòu)建含有編碼MERS RBD的基因的重組質(zhì)粒 pFas巧ac-MERS RBD轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)染sf9細胞，培養(yǎng)獲得高滴度病毒；然后感染H巧細胞，從細胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮 得到目的蛋白MERS-RBD。
[001引 似WMERS-RBD蛋白作為抗原免疫Ba化/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾 細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按5 ;1比進行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基和有限稀釋法獲得雜交 瘤細胞；并進一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細胞株，注 入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法還包括將所得鼠源抗體通過流式細胞儀檢 測抑制R抓結(jié)合CD26的效果，并用病毒（假病毒和活病毒）中和試驗確認得到有中和病毒 活性的抗體2E6。所述假病毒是將質(zhì)粒pCAGGS-MERS S與HIV P化4-3. luc. RE共轉(zhuǎn)染293T 細胞培養(yǎng)獲得，活病毒實驗在高級別生物安全實驗室進行。
[0014] 本發(fā)明成功篩選到了抗MERS-CoV病毒中和抗體，此抗體是能夠有效抑制 MERS-CoV病毒侵入的中和抗體，對MERS-CoV表面蛋白具有高親和力，因此該抗體不僅可W 應(yīng)用于臨床檢測，而且對其人源化后為制備預防或治療性抗體提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和可能性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1 ;MERS RBD蛋白純化分子篩和SDS-PAGE圖；分子篩圖中線為280nm吸收值； SDS-PAGE圖中1號泳道為低分子量蛋白Marker,其余泳道分別對應(yīng)分子篩圖中MERS RBD 二聚體和單體。
[0016] 圖2 ;單克隆細胞株上清對MERS RBD蛋白結(jié)合CD26抑制作用流式圖。
[0017] 圖3 ;抗體2E6中和假病毒曲線；橫坐標是抗體濃度，縱坐標是中和率。
[0018] 圖4 ;抗體2E6中和活病毒曲線，橫坐標是抗體濃度，縱坐標是中和率。
[001引圖5 ;抗體2E6結(jié)合MERS RBD蛋白表面等離子共振動力學曲線；橫坐標是結(jié)合解 離時間，單位是砂；縱坐標是芯片表面的結(jié)合響應(yīng)強度，單位是RU(即Response unit)。

【具體實施方式】
[0020] 實施例1質(zhì)粒構(gòu)建
[0021] 我們將編碼MERS RBD蛋白的DNA片段（SEQ IDN0. 5)用EcoR I和化0 I酶切 位點連入pFas巧acl載體中，并在蛋白的編碼片段前加入信號膚甜67有助于蛋白分泌表 達，在蛋白的編碼片段后插入6組氨酸標簽化exa-His-tag)的編碼序列及翻譯終止密碼 子，該樣會得到一個C-端帶有組氨酸標簽的重組蛋白，利于后續(xù)的蛋白分離純化，命名為 pFas巧ac-MERS RBD。將 MERS RBD 基因（氨基酸M1-S17，E367-Y606，NCBI 登錄號 JX869059) 插入pCAGGS載體EcoR I和化o I酶切位點之間，在化o I和Bgl II酶切位點間加入鼠 化基因片段（SEQ ID NO. 6)，利于后續(xù)蛋白純化及細胞染色，命名為pCAGGS-MERS RBD mFc。 將CD26 (二膚基膚酶-4)基因序列（SEQ ID NO. 7)插入祀GFPCl載體化o I和Sma I酶切 位點之間，命名為祀GFPC1-CD26。將ACE2(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2)基因序列（SEQ ID N0.8) 插入祀GFPNl載體化o I和Sma I酶切位點之間，命名為祀GFPN1-ACE2。將MERS S基因 (SEQ ID NO. 9)插入到pCAGGS載體EcoR I和Sma I酶切位點之間，在基因后面加入Flag 標簽（SEQ ID NO. 10)，命名為pCAGGS-MERS S。重組質(zhì)粒通過PCR、酶切鑒定和測序證實插 入的外源片段完全正確。
[002引實施例2MERS RBD蛋白表達與純化
[0023] 首先，將重組質(zhì)粒pFas巧ac-MERS RBD轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞，37°C過夜培養(yǎng)， 通過藍白斑篩選和PCR鑒定出陽性克隆，并提取重組BacmicK桿狀病毒質(zhì)粒），即已含有 MERSRBD基因序列的質(zhì)粒。將重組bacmid轉(zhuǎn)染S巧細胞，轉(zhuǎn)染3d后收取培養(yǎng)上清，得到P1 代桿狀病毒。連續(xù)擴增3代病毒即可得到大量高滴度病毒。然后感染Hi5細胞，4她離也 收取細胞上清，將細胞培養(yǎng)上清液與Ni-NTAResin佑E)于4°C結(jié)合過夜。W緩沖液A(20mM Tris，150mM化Cl，p服.0)洗涂樹脂，W去除非特異結(jié)合的蛋白。最后將目的蛋白W緩沖 液 B(20mM Tris, 150mM 化C1，P服.0,300mM imidazole)從樹脂上洗脫下來，并 W 10K 截留 (10K cutoff)的濃縮管將洗脫液濃縮至5ml。將濃縮后的蛋白溶液進一步W分子排阻層析 純化，使用 AKTA-purifier 佑巧和 Superdex200Hiload 16/60 柱子（GE)，使用緩沖液 A (20mM Tris，150mMNaCl，p服.0)，同時監(jiān)測280皿的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通過SDS-PAGE 鑒定蛋白純度。典型的目的蛋白的分子篩圖譜和SDS-PAGE分析圖如圖1所示。
[0024] 實施例3鼠源單克隆抗體制備和純化
[002引 MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Ba化/c小鼠3只，取lOOg蛋白溶解于50 y 1無菌的 PBS溶液中，與50 y 1弗式完全佐劑均勻混合，皮下多點注射。2周后加強免疫一次，3天后取 尾靜脈血，檢測血清抗體效價，取效價最高的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按5 ;1比進 行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，用有限稀釋法獲得雜交瘤細胞。取純化的MERS-RBD 蛋白為包被抗原，經(jīng)化ISA檢測，獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細胞株。按照 雜交瘤細胞（1-5) Xl06/小鼠的量注入小鼠腹腔制備腹水單抗，10天后收取腹水，離也去除 沉淀。0.22M濾膜過濾腹水，通過Protein G親和層析柱（G巧純化抗體。
[0026] 實施例4篩選中和抗體
[0027] (1化LISA篩選分泌抗MERS-RBD抗體的單克隆細胞株
[0028] 將4 y g MERS-RBD蛋白溶于1ml pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液中包被酶標板，400ng/ 孔，4°C過夜。用含3%牛血清白蛋白BSA的PBS溶液于37°C封閉1小時。用PBST溶液（含 0. 05% (體積百分含量）Tween 20的PB巧洗涂3次，分別加入梯度稀釋的雜交瘤細胞培 養(yǎng)上清，lOOy 1/孔，37C賠育1小時，設(shè)小鼠也臟血清為陽性對照，牛血清白蛋白為陰性對 照。用PBST洗涂3次后，加入HRP標記的抗鼠的二抗（1 ;2000稀釋，Santa化UZ，Inc.)， lOOy 1/孔，37°C賠育40分鐘。用PBST洗涂3次后，加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺，Sigma.)進 行顯色，37C賠育15-30分鐘，然后加入0. 1M H2SO4終止反應(yīng)。最后，用酶標儀檢測0D450nm 處的光吸收值。結(jié)果表明；篩選的1000個克隆中，有67個Elisa反應(yīng)陽性，滴度達到10 4W 上。
[0029] (2)抗體抑制MERS RBD與受體CD26結(jié)合
[0030] 首先，利用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒祀GFPC1-CD26 和祀GFPN1-ACE2 至 BHK21細胞，24小時后在英光顯微鏡下觀察到CD26-GFP和ACE2-GFP融合蛋白主要分布在 細胞膜上。收取細胞，并計數(shù)，PBS洗涂兩次后重息至lX10 7cell/ml，分裝細胞至EP管中， 100 y 1/管。將 pCAGGS-MERS RBD m化利用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染真核細胞 293T，72 小時后收取上清通過ProteinA親和層析純化得到ME畑R抓-化融合蛋白，將MERS R抓-Fc 融合蛋白與單克隆細胞株培養(yǎng)上清混合，室溫共賠育30分鐘后加入到表達CD26-GFP或 ACE2-GFP融合蛋白的BHK21細胞中，室溫再賠育30分鐘。PBS洗涂細胞2次，加入TRITC 標記的抗鼠的二抗（1 ;200稀釋），室溫賠育30分鐘。PBS洗涂細胞2次，然后用500 y 1 重息細胞，通過流式細胞儀檢測抗體對RBD結(jié)合CD26的抑制作用。其中，陽性對照為MERS R抓-化融合蛋白與培養(yǎng)基DMEM混合染色表達CD26-GFP的BHK21細胞，陰性對照為MERS R抓-化融合蛋白與培養(yǎng)基混合染色表達ACE2-GFP的BHK21細胞。結(jié)果表明；MERS R抓-Fc 染表達ACE-GFP融合蛋白的細胞后沒有紅光偏移，即MERS R抓-Fc不能結(jié)合ACE2-GFP ; MERS R抓-Fc染表達CD26-GFP融合蛋白的細胞后紅光有偏移，即MERS R抓-Fc可W結(jié)合 CD26-GFP?？贵w與MERS R抓-化混合后，若抗體和R抓有結(jié)合則可抑制R抓與CD26的結(jié)合， 那么紅光則無偏移；反之，若抗體不能與RBD結(jié)合則紅光有偏移。
[0031] 將Elisa反應(yīng)陽性的細胞上請按上述方法進行實驗后，我們發(fā)現(xiàn)，單克隆細胞株 2E6上清中分泌表達的抗體與MERS R抓-化混合后，紅光偏移量較少，即此抗體可有效抑制 MERSRBD蛋白與CD26結(jié)合（圖2)，抑制率達到94 %。
[003引 圖2中，N-BHK21為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BHK21細胞，是實驗雙陰性對照；ACE2-GFP為 BHK21細胞轉(zhuǎn)染祀GFPN1-ACE2質(zhì)粒后可W表達ACE2-GFP融合蛋白，是實驗單陽性對照； ACE2-GFP+MERS R抓-Fc是MERS R抓-Fc蛋白染表達ACE2-GFP融合蛋白的BHK21細胞，是 實驗陰性對照；CD26-GFP+MERS R抓-Fc是MERS R抓-Fc蛋白染表達CD26-GFP融合蛋白的 BHK21細胞，為實驗陽性對照；CD26-GFP+MERS R抓-FC+2E6為抗體2E6與MERS R抓-Fc蛋白 混合后染表達CD26-GFP融合蛋白的BHK21細胞。
[0033] 實施例5假病毒中和實驗
[0034] (1)假病毒包裝
[00巧]利用 Lipofectamine2000 將質(zhì)粒 pCAGGS-MERS S 與 HIV P化4-3. luc. RE(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染293T細胞。轉(zhuǎn)染6小時后，PBS洗涂細胞2次，換為無血清DMEM。 48小時后收取細胞上清，離也去掉細胞碎片，分裝凍存-8(TC。
[0036] (2)TCID50 測定
[0037] 將收取的病毒液10倍倍比稀釋，依次為l(Ti，1(T2......1(TW，加入到96孔板中， 此時化h7細胞匯合度為80% -100%。感染4小時后，棄掉病毒液，PBS洗涂細胞2次，換 為含10 %血清的完全培養(yǎng)基DMEM。48小時后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗涂細胞2次，加入細胞 裂解液，利用GloMax 96Microplate LuminometeHPromega)檢測英光素梅活性值。通過 Reed-Muench 法計算 TCID50。
[00測 做中和實驗
[0039] 將純化的抗體2倍倍比稀釋，與100TCID50假病毒混合，抗體終濃度依次為2 y g/ ml、1 y g/ml……7. 5ng/ml，37 °C共賠育30分鐘，將混合液加入到已鋪滿化h7細胞的 96-well中。37°C賠育4小時后，棄掉病毒液，PBS洗涂細胞2次，換為含10%血清的完全 培養(yǎng)基DMEM。48小時后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗涂細胞2次，加入細胞裂解液，檢測英光素梅 活性值。
[0040] 結(jié)果表明；抗體2E6有中和假病毒活性，即可W抑制MERS病毒S蛋白與細胞表面 受體CD26的結(jié)合，NDs。為310ng/ml (圖3)。
[0041] 實施例6活病毒中和實驗
[0042] 將純化的抗體2倍倍比稀釋，與100TCID50假病毒混合，抗體終濃度依次為50 y g/ ml、25 y g/ml……20ng/ml，37 °C共賠育30分鐘，將混合液加入到已鋪滿化h7細胞的 96-well中。37C賠育1小時后，棄掉病毒液，PBS洗涂細胞2次后加入培養(yǎng)基。每隔12小 時觀察病變。
[0043] 結(jié)果表明；抗體2E6有中和活性，即可W抑制MERS病毒入侵宿主細胞，NDg。為 638ng/ml (圖 4)。
[0044] 實施例7表面等離子共振技術(shù)檢測MERS RBD與抗體2E6親和力
[0045] 表面等離子共振分析是用Biacore3000炬iacore Inc.)進行的。具體步驟如下： [004引首先，將抗體2E6溶于lOmM NaAc (抑5. 0)固定在CM5芯片佑E)上，然后將濃度 梯度為3. 125nM-100nM的MERS RBD蛋白分別注入芯片，分析在恒溫25C進行，使用的緩 沖液是肥陽S-Tween 緩沖液（lOmM 肥陽S [抑 7. 4], 150mM 化C1,，0. 005% Tween-20)，流 速為30yl/min。芯片表面的再生使用的是lOOmM H3PO4,結(jié)合曲線如圖4所示。圖中5 條曲線的抗體濃度由上到下分別為100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125nM，不同濃度的曲線組成 圖示的動力學曲線。結(jié)合動力學常數(shù)的計算是利用BIAevaluation software version 3.2炬iacore, Inc.)軟件進行的。結(jié)果表明，抗體2E6和MERS RBD蛋白的親和力常數(shù)為 9nM。
[0047] 實施例8抗體2E6 F油序列測定 [004引 （1)抗體亞型鑒定
[0049] 將純化的2E6抗體進行SDS-PAGE，分別在約45kD和30kD處有重鏈和輕鏈兩條 帶，切割用dd&O浸泡洗涂3次。經(jīng)過脫水和酶解后進行鑒定，儀器為MLDI-T0F/T0F質(zhì) 譜儀。數(shù)據(jù)采集后，將一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS 3. 6 (Applied Biosystems)和 Mascot2. UMatrix Science)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析和蛋白鑒定。在NCBI中進行搜索與比 對，鑒定出抗體2E6亞型為IgGl ( K )。
[0050] 似抗體基因克隆
[0051] 收取單克隆細胞株細胞lXl〇e，Trizol法提取mRNA。首先設(shè)計基因特異性的引物 進行逆轉(zhuǎn)錄（RT-PCR)獲得cDNA，然后利用PCR擴增獲得2E6 F油（抗原結(jié)合片段）序列。 測序獲得主要序列后，通過NCBI比對獲得2E6 F油全序列。2E6 F油Vh-Ch1的氨基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，2E6F油V廣CJ勺氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[005引 2E6 F油Vh-Ch1擴增所用引物及反應(yīng)條件如下：
[0053] OligodC-fixl:
[0054] ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTAGCAGCAGTTCGATAAGCGGCCGCCATGGAGGGHN [00 巧]AP1:ACAGCAGGTCAGTCAAGCAGTA
[0056] AP2:AGCAGTAGCAGCAGTTCGATAA ;
[0057] IgHG1-R1 ： GTACATATGCAAGGCTTACAACCAC
[0058] IgHGl-R2 ：AATTTTCTTGTCCACCTTG
[0059] IgHGl-R3 ：GGATCCAGAGTTCCAGGTCA
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
2. -種中東呼吸綜合征冠狀病毒抗體，其特征在于，其重鏈、輕鏈的氨基酸序列分別如 SEQIDM0.3、SEQIDN0.4K*。
3. -種制備權(quán)利要求1或2所述抗體的方法，其特征在于，首先制備MERS-CoV病毒受 體結(jié)合區(qū)蛋白，然后以該蛋白為抗原篩選到抗MERS-CoV病毒的鼠源單克隆中和抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟： (1) 以pFastBacl為表達載體，構(gòu)建含有編碼MERS RBD的基因的重組質(zhì)粒 pFastBac-MERS RBD，轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細胞、篩選鑒定陽性克隆，提取重組桿狀病毒質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)染sf9細胞，培養(yǎng)獲得高滴度病毒；然后感染Hi5細胞，從細胞培養(yǎng)上清液中純化濃縮 得到目的蛋白MERS-RBD ; (2) 以MERS-RBD蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗體效價最高的小鼠的脾細胞 與骨髓瘤細胞SP2/0按5 :1比進行融合，通過HAT篩選培養(yǎng)基和有限稀釋法獲得雜交瘤細 胞；并進一步用ELISA檢測篩選獲得高效分泌MERS-RBD蛋白抗體的單克隆細胞株，注入小 鼠腹腔制備腹水單抗，純化獲得鼠源抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將所得鼠源抗體通過流 式細胞儀檢測抑制RBD結(jié)合CD26的效果，并用病毒中和試驗確認得到有中和病毒活性的抗 體 2E6。
6. -種含有權(quán)利要求1或2所述抗體的藥物組合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，含有藥物學上可接受的載體。
8. 權(quán)利要求1或2所述抗體在制備用于檢測、預防或治療中東呼吸綜合征的藥物中的 應(yīng)用。
9. 編碼權(quán)利要求1或2所述抗體的基因。
10. 攜帶權(quán)利要求9所述基因的轉(zhuǎn)化體。
【文檔編號】A61P31/14GK104447986SQ201410812405
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】嚴景華, 高福, 李燕, 宛玉花 申請人:中國科學院微生物研究所