以粘蛋白1和生存素為靶點(diǎn)的腫瘤dna疫苗及病毒載體疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
【專利說明】以粘蛋白1和生存素為靶點(diǎn)的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫 苗
[0001] 本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2009年12月4日，申請(qǐng)?zhí)枮?200910252427. X，名稱為"以粘蛋白1和生存素為靶點(diǎn)的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗"。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA 載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗 和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。

【背景技術(shù)】
[0003] 生存素（Survivin)是抑制凋亡蛋白（IAP)家族成員，具有抗凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂 的雙重功能，廣泛表達(dá)于各種胚胎組織和癌細(xì)胞中，但在正常終末分化細(xì)胞中不表達(dá)。這些 特點(diǎn)使生存素成為腫瘤發(fā)生，發(fā)展和治療等領(lǐng)域中的一個(gè)新靶點(diǎn)。
[0004] 目前的研宄表明生存素在腫瘤基因治療中具有潛在價(jià)值：它的腫瘤特異性表達(dá)， 及其與預(yù)后不良、藥物抗性和病人生存期縮短等呈正相關(guān)。針對(duì)生存素及其突變體等進(jìn)行 的腫瘤免疫治療已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外策略有（參見Li, F.et al.，2006; Li, F.，2003 ;Altieri，D. C.，2008) : (1)利用生存素啟動(dòng)子的腫瘤特異性表達(dá)進(jìn)行的腫瘤 革巴向基因治療；（2)針對(duì)生存素本身的治療策略：a)生存素的反義或全長(zhǎng)的cDNA或反義核 苷酸表達(dá)載體策略，比較適合生存素的功能研宄和前臨床研宄，但用全長(zhǎng)的生存素可能有 潛在的危險(xiǎn)；b)生存素功能陰性突變體（dominant negative mutant，DNM)策略，主要是 SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不適用于直接的癌癥治療；c)生存素核酶方案，即用 生存素 mRNA特異性核酶剪切生存素 mRNA以降低生存素的表達(dá)，此方案也是一種有效的研 宄工具，但不適用于癌癥臨床治療；d)生存素 RNAi技術(shù)，目前的研宄表明：RNAi能有效的 使哺乳動(dòng)物基因表達(dá)沉默，可用于基因功能研宄，但昂貴的費(fèi)用限制其臨床應(yīng)用；e)用小 分子有機(jī)物或小肽抑制生存素的表達(dá)或干擾其功能；f)用生存素特異性表位的免疫治療， 這是一個(gè)很吸引人的領(lǐng)域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。
[0005] 因?yàn)樯嫠鼐哂锌沟蛲龅墓δ?，如果用其全長(zhǎng)來設(shè)計(jì)疫苗可能存在安全隱患，根 據(jù)國(guó)內(nèi)外策略的優(yōu)點(diǎn)和弊端擬采用生存素抗凋亡功能缺失剪切體來設(shè)計(jì)疫苗，在保證其抗 凋亡功能缺失的情況下盡量保存長(zhǎng)度以提高免疫原性。因此本發(fā)明采用生存素的抗凋亡功 能缺失剪切體來設(shè)計(jì)疫苗。生存素在體內(nèi)是以二聚體形式起作用的，它N-端第6、第7和第 10位的三個(gè)氨基酸是形成二聚體的關(guān)鍵氨基酸（參見Shi，Y.et al.，2000);生存素的第5 位至第14位氨基酸是HLA-A2的特異性抗原表位（參見Andersen, Μ. H. et al.，2001)，基于 這兩點(diǎn)本發(fā)明首次設(shè)計(jì)了剪切體S8 (即切去生存素 N-端7個(gè)氨基酸），希望可以破環(huán)它的 二聚體結(jié)構(gòu)，從而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8為靶點(diǎn)來設(shè)計(jì)疫苗可能會(huì)提高疫苗的 安全性。
[0006] 粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成員，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及 其來源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核心和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。其核心肽胞外段含有數(shù)目不等的串 聯(lián)重復(fù)區(qū)（VNTR)。正常組織中MUCl分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對(duì)隔離，糖 基化豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此 暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)，并且表達(dá)增強(qiáng)，可達(dá)正常細(xì)胞的 100倍以上，因此MUCl是較理想的抗腫瘤靶分子。
[0007] MUCl VNTR中的PDTRP序列是B細(xì)胞及T細(xì)胞共同識(shí)別的表位，可與MUCl特異 性抗體及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)相結(jié)合，故稱這個(gè)最具免疫原性的部位為免疫顯性結(jié) 構(gòu)域，因此，目前大部分利用MUCl研宄免疫治療的都是集中在VNTR區(qū)域（參見Singh，R. et al.，2007 ;Persson，J. et al.，2006 ;Xing，P. X. et al.，1992 ;Tang，C. K. et al.，2008 ; Tang，C. K. et al.，2008)。從發(fā)現(xiàn)MUCl到現(xiàn)在已用其進(jìn)行了很多的疫苗研宄工作，并有一些 疫苗已經(jīng)進(jìn)入人類臨床研宄階段，但大多數(shù)都是傳統(tǒng)的多肽類、蛋白類或樹突狀細(xì)胞（DC) 類疫苗，這些疫苗大多都存在免疫原性差或制備困難等問題；進(jìn)入臨床的基因疫苗主要是 重組痘病毒疫苗，雖然沒有檢測(cè)到毒性，但直接用重組痘病毒疫苗初免-加強(qiáng)還是存在較 大的安全隱患，而且產(chǎn)生的臨床效果也不是很理想；DNA載體疫苗由于免疫原性較弱目前 還基本處于臨床前研宄階段。
[0008] 本發(fā)明發(fā)明人的前期研宄表明增加 VNTR的數(shù)目可在一定程度上增強(qiáng)MUCl的免疫 效果（參見Zhang S et al.，2008)，如33個(gè)拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng) 答明顯強(qiáng)于2個(gè)拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明選用含有33 個(gè)的串聯(lián)重復(fù)序列MUCl VNTR作為抗原來設(shè)計(jì)疫苗，并將其與S8融合表達(dá)來構(gòu)建融合表達(dá) 疫苗以增強(qiáng)疫苗免疫的廣譜性和有效性，目前將生存素和MUCl VNTR聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行腫瘤治 療還未見報(bào)導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種DNA片段S8,所述S8片段的序列為SEQ ID NO:8。
[0010] 本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒VR-S8,其中所述重組質(zhì)粒的骨架載體為如圖IA的 VR1012,在所述VR1012的多克隆位點(diǎn)中所述的S8片段。優(yōu)選地，所插入的S8片段位于 VR1012的多克隆位點(diǎn)Sail和BamHI之間。
[0011] 本發(fā)明提供了一種SEQ ID NO:9所示的DNA片段MS，所述序列MS包含一個(gè)含有 33個(gè)拷貝的MUCl VNTR的DNA片段33M和所述的S8片段。
[0012] 本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒VR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為 VR1012,在所述VR1012的多克隆位點(diǎn)中插入了所述的MS片段。優(yōu)選地，所插入的MS片段 位于VR1012的多克隆位點(diǎn)Sail和BamHI之間。
[0013] 本發(fā)明提供了一種重組腺病毒Ad-S8,其特征在于在腺病毒中插入了所述的S8片 段。優(yōu)選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGlox Λ El，3Cre，所插入的S8片段位于所述 重組腺病毒的多克隆位點(diǎn)EcoRI和BglII之間
[0014] 本發(fā)明提供了一種重組腺病毒Ad-MS，其特征在于在腺病毒中插入了所述的MS片 段。優(yōu)選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGlox Λ El，3Cre，所插入的MS片段位于所述 重組腺病毒的多克隆位點(diǎn)BglII處。
[0015] 本發(fā)明提供了一種重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特征在于在所述重組改良 安卡拉痘苗病毒中插入了所述的MS片段。優(yōu)選地，所插入的MS片段位于所述重組改良安 卡拉痘苗病毒的多克隆位點(diǎn)Sail和KpnI之間。
[0016] 本發(fā)明提供了所述的S8片段或所述的MS片段在制備用于進(jìn)行抗腫瘤免疫的蛋白 疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗中的用途。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述疫苗中包含免疫佐劑和/或化療藥物，其中所述 免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2 (IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和非 甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列，其中所述化療藥物選自卡鉑、順鉑、奧沙利鉑和紫杉 醇。
[0018] 本發(fā)明首先以S8為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤基因疫苗的研宄，分別構(gòu)建DNA載體疫苗 (VR-S8)和腺病毒載體疫苗（Ad-S8)，采用DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)免疫（DNA prime-rAd boost)免疫策略，同時(shí)采用表達(dá)白細(xì)胞介素2 (IL2)的質(zhì)粒（VR-IL2)作為免疫佐劑，通過免 疫小鼠檢測(cè)S8基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表明：小鼠可產(chǎn)生針對(duì)S8的特異性 抗體（見圖4)和CTL(見圖5);該疫苗具有一定的抗腫瘤活性，在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組 比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率為68. 54 %，生存期延長(zhǎng) 了 35. 6% (見圖6)。在治療性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模 型中小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到了明顯的抑制（抑制率為23. 42%)，但并沒有明顯延長(zhǎng)模型小鼠的 生存期（見圖7)。
[0019] 本發(fā)明采用生存素和MUCl為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)融合表達(dá)基因疫苗。由于MUCl基因的多態(tài) 性決定了不同個(gè)體間VNTR數(shù)目的不同，最常見的為含有30-90個(gè)連續(xù)重復(fù)序列，根據(jù)自行 構(gòu)建MUCl VNTR基因的特點(diǎn)選擇以33個(gè)重復(fù)區(qū)序列（簡(jiǎn)稱為33M，該序列含有33個(gè)VNTR 的串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列之間有6個(gè)由于構(gòu)建引入的酶切位點(diǎn)的堿基序列，）來構(gòu)建 MUCl DNA載體疫苗（VR-33M)，同時(shí)構(gòu)建33M與S8融合表達(dá)的DNA載體疫苗（VR-MS)。通過 免疫模型小鼠檢測(cè)融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性與二者單獨(dú)表達(dá)的疫苗相 比是否有明顯的提高，結(jié)果表明生存素和MUCl融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果明顯強(qiáng)于二 者單獨(dú)表達(dá)的疫苗的免疫效果，例如：在對(duì)腫瘤的預(yù)防性研宄中，融合表達(dá)疫苗免疫組與生 存素疫苗單獨(dú)免疫組相比抑瘤率提高了 134%，生存期延長(zhǎng)了 166%;與MUCl單獨(dú)免疫組比 較，抑瘤率提高了 25%，生存期延長(zhǎng)了 73% (見圖12)。為了進(jìn)一步加強(qiáng)MS疫苗的免疫效 果又構(gòu)建了其病毒載體疫苗（Ad-MS和MVA-MS)，采用DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)免疫的免 疫策略，同時(shí)采用表達(dá)IL2的質(zhì)粒作為免疫佐劑，通過免疫模型小鼠檢測(cè)融合表達(dá)基因疫 苗的免疫效果和抗腫瘤活性，結(jié)果表明DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)的免疫策略能明顯抑制 模型小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并有效延長(zhǎng)小鼠的生存期；IL2也顯示出了明顯的佐劑增強(qiáng)作用（見 圖 13)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖LDNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。A為VR1012載體圖譜；B為重組質(zhì)粒 VR-S8圖譜；C為重組質(zhì)粒VR-33M圖譜；D為重組質(zhì)粒VR-MS圖譜。
[0021] 圖2.重組腺病毒載體圖譜及制備流程。A為AdMax?腺病毒載體及重組病毒制 備流程；B為穿梭載體pDC316圖譜；C為重組穿梭載體pDC316-S8圖譜；D為重組穿梭載體 PDC316-MS 圖譜。
[0022] 圖3. MVA重組原理及相關(guān)載體圖譜。A為MVA重組示意圖；B為穿梭載體pSCll圖 譜；C為重組穿梭載體pSClI-MS圖譜，MS結(jié)構(gòu)基因表達(dá)框架重組到MVA的TK基因中，基因 表達(dá)的啟動(dòng)子采用P7. 5。
[0023] 圖4.小鼠免疫血清抗S8抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (2)、VR-IL2 (3)、 VR-S8(4)，VR-S8/VR-IL2(5)，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8(6)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以 表達(dá)S8的COS-7細(xì)胞裂解上清作為檢測(cè)小鼠血清的抗原，以S8單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照 (1)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（Western-blot)檢測(cè)的結(jié)果。
[0024] 圖5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢 測(cè)。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用特異性抗原肽（H_2d限制性） 標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞株B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。
[0025] 圖6.不同形式S8基因疫苗對(duì)MSf+B16(購(gòu)自ATCC)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫預(yù)防 作用。C57BL/6 小鼠經(jīng) PBS 對(duì)照組、VR-IL2、VR-S8、VR-S8/VR-IL2 以及 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8 在經(jīng)隔周免疫四次后一周，接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大小（A)至26天，生存情況觀 察至腫瘤接種后50天（B)。
[0026] 圖7.不同形式S8基因疫苗對(duì)MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫治療作用。在 給C57BL/6小鼠皮下接種MS f+B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、卡鉑（Carboplatin)、 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和VR-S8/VR-IL2/Ad-S8/卡鉑疫苗，測(cè)量腫瘤大?。ˋ)至27天，生存 情況觀察至腫瘤接種后50天（B)。
[0027] 圖8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (I)、VR-S8 (2)、 VR-33M (3)、VR-MS (4)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為 抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的結(jié)果。
[0028] 圖9. MS疫苗與單獨(dú)表達(dá)生存素和MUCl的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性CTL殺傷活性 的比較。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素（A)和MUCl (B) 特異性抗原肽（H_2d限制性）標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋 放法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。
[0029] 圖10.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (I)、VR-IL2 (2)、 VR-MS(3)、VR-MS/VR-IL2(4)、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS(5)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以 表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的結(jié)果。
[0030] 圖11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性 檢測(cè)。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素（A)和MUCl (B)特 異性抗原肽（H_2d限制性）標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放 法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。
[0031] 圖12. MS疫苗與單獨(dú)表達(dá)生存素和MUCl的疫苗對(duì)模型小鼠免疫預(yù)防效果比較。 C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對(duì)照組、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在經(jīng)隔周免疫三次后一周，接種 MS/B16腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大小（A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天（B)。
[0032] 圖13.不同形式MS基因疫苗對(duì)MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫治療作用。在 給C57BL/6小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、卡鉑、VR-MS/VR-IL2/ Ad-MS、VR-MS/VR-IL2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-IL2/Ad-MS/ 卡鉑組，測(cè)量腫瘤大小（A)至 27 天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天（B)。

【具體實(shí)施方式】
[0033] - .上述片段33M和S8的制備方法和條件
[0034] L 33M 的制備
[0035] MUC1VNTR為一個(gè)含有60個(gè)堿基的重復(fù)片段，GenBank號(hào)為NM_002456(SEQ ID NO: 1)。根據(jù)一個(gè)VNTR的堿基序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)（SOE PCR)合 成1個(gè)VNTR (Im)重復(fù)區(qū)片段，然后利用限制性內(nèi)切酶Sal I和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端 的特性，依次進(jìn)行連接，構(gòu)建33M基因片段。具體方法如下：
[0036] 1)重疊延伸PCR技術(shù)
[0037] PCR 反應(yīng)條件為：95°C 20s、55°C 20s、72°C 30s，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，利用引物 P1(SEQ ID N0:2)和 P2(SEQ ID N0:3)擴(kuò)增出無 ATG的l拷貝MUClVNTR(簡(jiǎn)寫為m)，以P2和P3(SEQ ID N0:4)為引物擴(kuò)增出含ATG的1拷貝MUC1VNTR(簡(jiǎn)寫為Am)片段。
[0038] 2)pGEM-T-33M的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析
[0039] 將上述PCR產(chǎn)物m和Am分別和pGEM-T-easy (Promega公司）載體進(jìn)行連接，分 別獲得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T-Am兩個(gè)質(zhì)粒，然后利用限制性內(nèi)切 酶Sail和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進(jìn)行連接獲得含有所述33M片段的 PGEM-T-33M質(zhì)粒，經(jīng)Sail和XhoI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果正確。具體過程即先 將pGEM-T-m用Sail和XhoI雙酶切得目的片斷m，然后再將其插入pGEM-T-m的XhoI位點(diǎn)， 即得到pGEM-T-2m。然后再將pGEM-T-2m用Sail和XhoI雙酶切得目的片斷2m，然后再將其 插入pGEM-T-2m的XhoI位點(diǎn)，即得到pGEM-T-4m，同理得pGEM-T-32m，然后再將pGEM-T-Am 用Sail和XhoI雙酶切得目的片斷Am，然后再將其插入pGEM-T-32m的Sail位點(diǎn)，即得到了 質(zhì)粒 pGEM-T-33m。
[0040] 2. S8 的制備
[0041] 生存素，GenBank號(hào)為NM_001168,根據(jù)生存素的序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用 RT-PCR技術(shù)從293細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出了 S8的基因片段，序列為SEQ N0:8所示的堿基 序列。具體方法如下：
[0042] DRT-PCR 技術(shù)
[0043] 采用TRIzol RNA提取試劑盒（Gibco公司）提取293細(xì)胞的總RNA，采用 Super-Script反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Gibco公司）從中獲得293細(xì)胞的cDNA，然后以其為模板， 以P4(SEQ ID N0:5)和P5(SEQ ID N0:6)為引物進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為：95°C30s、55°C30s、 72°C lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)）擴(kuò)增生存素 cDNA。
[0044] 2)pGEM-T-S8的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析
[0045] 將生存素 cDNA的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體進(jìn)行連接得到含有生存素 cDNA的 pGEM-T-Surv質(zhì)粒。經(jīng)序列分析證實(shí)正確后，以pGEM-T-Surv為模板，以P6 (SEQ ID NO: 7) 和P5為引物通過PCR擴(kuò)增S8片段（SEQ ID N0:8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI和Sail 的酶切位點(diǎn)，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位點(diǎn)。將S8PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載體 獲得含有所述S8片段的pGEM-T-S8質(zhì)粒，經(jīng)Sail和BamHI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測(cè)序 結(jié)果正確。
[0046] 二.重組疫苗的獲得方法及相應(yīng)的條件
[0047] I. DNA載體疫苗
[0048] 1)VR-33M 的構(gòu)建
[0049] VR1012載體（VR1012是Vical公司開發(fā)的經(jīng)美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)的可以用于人體基 因疫苗臨床試驗(yàn)的載體，已經(jīng)完成的臨床試驗(yàn)表明其在人體的應(yīng)用是安全的，該載體的構(gòu) 建過程參見文獻(xiàn)（Human Gene Therapy 1996,7:1205-1217))含有CMV啟動(dòng)子，卡那霉素抗 性基因，內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯終止信號(hào)等常規(guī)部件組成，共4913bp，圖譜見圖1A。
[0050] 將上述制得的PGEM-T-33M質(zhì)粒經(jīng)Sall/Xhol雙酶切后用膠回收試劑盒（北京天 根生化科技有限公司）回收33M基因片段，將真核表達(dá)載體VR1012載體經(jīng)Sail單酶切后 用膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收載體片段，利用經(jīng)Sail和XhoI酶切 后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將所回收的目的基因片段和載體片段，以T4 DNA連接酶，在 16°C下連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplOQnvitrogen公司），涂布卡 那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng) 16h，l，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取質(zhì) 粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見圖 IC。
[0051] 2)VR-S8 的構(gòu)建
[0052] 將PGEM-T-S8和真核表達(dá)載體VR1012載體分別經(jīng)Sall/BamHI雙酶切，用膠回收 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的基因片段S8和VR1012載體片段，用T 4DNA 連接酶，16°C連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司），涂 布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下 培養(yǎng)16h，1，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提 取質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜 見圖1B。
[0053] 3) VR-MS 的構(gòu)建
[0054] 將pGEM-T-33M經(jīng)Sall/Xhol雙酶切后回收目的基因片段33M，將VR-S8載體經(jīng) Sail單酶切后回收載體片段，利用經(jīng)Sail和XhoI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將回 收目的基因片段和載體片段用T 4DNA連接酶，16°C連接3h。獲得VR-33M-S8,簡(jiǎn)稱VR-MS質(zhì) 粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-MS，圖譜見圖 ID。
[0055] MS序列為如SEQ ID NO:9所示的堿基序列。
[0056] 2.重組腺病毒疫苗（Ad-S8、Ad-MS)的獲得
[0057] 腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié) 構(gòu)，直徑約80-110nm。腺病毒基因組的兩端各有一段IOObp的反向末端重復(fù)序列（ITR)，是 復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3'側(cè)有一段長(zhǎng)約300bp的包裝信號(hào)（Φ )介導(dǎo)腺病毒基因 組包裝入病毒衣殼。對(duì)腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)（Φ)的約0.5kb的序 列是順式作用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助 病毒（或細(xì)胞）反式補(bǔ)足。
[0058] 本實(shí)驗(yàn)中米用的腺病毒系統(tǒng)是AdMax? Adenovirus載體系統(tǒng)（Microbix公司）， 該系統(tǒng)是位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組， 重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重 組酶只能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重 組，因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點(diǎn)特異性重組又稱保守重組，該重組過 程不需RecA酶參與。目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、 FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、靶位點(diǎn)及重組 機(jī)制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點(diǎn)，也有相似的結(jié)構(gòu)。AdMaxTM Adenovirus 載體應(yīng)用的是Cre/loxP系統(tǒng)，Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個(gè)氨基酸的單聚體蛋白，分子量為 38kDa，它是位點(diǎn)特異性重組發(fā)生所需的特異性重組酶，其識(shí)別位點(diǎn)被稱為IoxP (locus of crossing-over Pl)，為一段34bp的DNA序列，由兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的不 對(duì)稱間隔序列（又稱為核心序列）組成Y -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。 IoxP位點(diǎn)堿基重排后形成十字形的結(jié)構(gòu)，核心序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的 底物，也是DNA識(shí)別與重組的位點(diǎn)，對(duì)稱的13bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶結(jié)合的序列。
[0059] AdMaxTM Adenovirus載體系統(tǒng)是由穿梭載體和骨架載體（pBHGlox Δ El, 3Cre)構(gòu) 成，各含有一個(gè)同向排列的LoxP位點(diǎn)，其中骨架載體還含有由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的Cre基因。 將穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株293,骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達(dá)，介導(dǎo) 兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因以及Cre基因， 同時(shí)完成目的基因的插入。由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少 形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(hào)（Φ)，而穿梭載體則含有Φ，因此只有在兩 個(gè)載體之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒；另 夕卜，骨架載體缺失El基因，因此需要轉(zhuǎn)染組成型表達(dá)El蛋白的293細(xì)胞。將骨架載體和穿 梭載體（本研宄選用的穿梭載體為PDC316,圖譜見圖2B)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用293細(xì)胞 中的El蛋白，10左右天就可以產(chǎn)生出含有外源基因的重組腺病毒噬斑（見圖2A)，挑取噬 斑，進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為：95°C 30s、53°C 30s、72°C lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)）鑒定，選取正確 的克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。
[0060] 1)穿梭重組質(zhì)粒pDC316-S8和pDC316-MS的獲得
[0061] 將pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI雙酶切后回收得到S8目的片段，將pDC316用EcoRI/ Bgin雙酶切后回收作為載體，利用BamHI和Bgin具有相同粘性末端的性質(zhì)，將回收目的 基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 ToplO (Invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽(yáng)性菌 落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，1，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（北京 天根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，用EcoRI/Bgin進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即 得到了重組質(zhì)粒pDC316-S8(圖譜見圖2C)質(zhì)粒。將VR-MS用Bgin單酶切后回收得到MS 目的片段，將PDC316用Bgin單酶切后回收作為載體，將回收目的基因片段和載體片段進(jìn) 行連接，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果正確，即獲得PDC316-MS(圖譜見圖2D)質(zhì)粒。
[0062] 2) Ad-S8和Ad-MS重組病毒的獲得
[0063] 將 pBHGlox Δ El, 3Cre 和 pDC316-S8 或 pDC316-MS 共轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，經(jīng)過篩選、 擴(kuò)增、純化后，獲得分別含有S8和MS片段的重組腺病毒Ad-S8或Ad-MS。
[0064] 3.重組MVA疫苗（MVA-MS)的獲得
[0065] 改良安卡拉痘苗（MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量 大等優(yōu)點(diǎn)使其得以廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療中。MVA含有胸苷激酶基因（TK)(參見圖3A); pSCll(參見圖3B)是它的穿梭質(zhì)粒，具有多克隆酶切位點(diǎn)可以插入外源基因、具有胸苷激 酶的左臂和右臂（TKUTKR)可以與MVA進(jìn)行同源重組，同時(shí)含有IacZ基因，可以用于重組 MVA(rMVA)的藍(lán)斑篩選。所述MVA系統(tǒng)（含穿梭質(zhì)粒pSC 11)購(gòu)自ATCC。
[0066] 1)穿梭重組質(zhì)粒pSClI-MS的獲得
[0067] 將VR-MS和pSCll經(jīng)Sall/Kpnl雙酶切后回收，將回收目的基因片段MS和 pSCll載體片段用T4DNA連接酶，16 °C連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 ToplO (invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽(yáng)性菌 落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，12000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（北京天 根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，用Sall/Kpnl進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到 了重組質(zhì)粒PSCll-MS (見圖3C)。
[0068] 2) MVA-MS重組病毒的獲得
[0069] 首先以滴度 0· 05pfu/cell 的 MVA 感染 tk-tsl3 細(xì)胞（購(gòu)自 ATCC，ATCC 號(hào)為CRL-1632?，是不含有TK基因的BHK-21的突變株）。感染2小時(shí)后，利用 Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法將 pSClI-MS 轉(zhuǎn)染到感染了 MVA 的 tk-tsl3 細(xì)胞中。 MVA在tk-tsl3細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程中，由于pSCll-MS具有與MVA的TK基因同源的TKL和 TKR，所以有一定比例的MVA病毒與pSCl I-MS發(fā)生重組，結(jié)果MS和LacZ閱讀框架被重組到 MVA病毒基因組中。形成如圖3C所示的MVA-MS重組病毒。
[0070] 以上被感染細(xì)胞培養(yǎng)三天后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，超聲波處理，2000rpm離心 IOmin除去細(xì)胞殘?jiān)Ａ羯锨?。取一定量上清，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成 10_2、10_ 3、10_4、10_5、10_6，感染〖1^813細(xì)胞211。將等體積的在45°〇下預(yù)溫的2%低熔點(diǎn)瓊 脂糖和2 XDMEM-10/BrdU (BrdU，5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可摻入到野生 型MVA中，產(chǎn)生致死性突變，從而可以使野生型MVA逐漸減少）培養(yǎng)基混勻，每孔加入3ml 培養(yǎng)基，在室溫下凝固，在37°C下于含5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。鋪上層選擇性培養(yǎng)基， 成分比下層瓊脂多了 1/120體積的4% X-gal。培養(yǎng)過夜，挑選藍(lán)色單斑，反復(fù)凍融三次裂 解釋放病毒，進(jìn)行下一輪的篩選，步驟相同，如此進(jìn)行6輪以上篩選，最后直至得到只含重 組病毒MVA-MS的克隆株。
[0071] 三.疫苗免疫效果
[0072] I. S8疫苗免疫效果
[0073] I. 1S8疫苗的免疫原性
[0074] 本部分實(shí)驗(yàn)從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面探討生存素 DNA疫苗和重組腺病毒 疫苗，以及其與IL-2質(zhì)粒共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)將C57/BL/6小鼠按表1進(jìn)行分 組，1組在第〇、2、4、6周注射PBS ;2-4組在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐劑；5 組在第〇、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐劑，在第6周注射重組腺病毒疫苗?？疾?生存素 DNA單獨(dú)免疫的免疫效果、IL-2質(zhì)粒的佐劑效果，以及重組腺病毒的免疫增強(qiáng)作用。
[0075] 表I S8疫苗免疫原性
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 一種SEQ ID N0:9所示的DNA片段MS在制備用于進(jìn)行抗腫瘤免疫的蛋白疫苗、DNA 疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗中的用途，其中所述片段MS包含一個(gè)含有33個(gè)拷貝 的MUC1 VNTR的DNA片段33M和一種序列為SEQ ID N0:8的DNA片段S8片段。
2. 權(quán)利要求1中所述的用途，其中所述疫苗中還包含免疫佐劑；優(yōu)選地，所述免疫佐劑 選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和非甲基化的 CpG基序免疫刺激DNA序列。
3. 權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述疫苗中還包含化療藥物；優(yōu)選地，所述化療藥 物選自卡鉑、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇。
4. 一種重組質(zhì)粒VR-MS在制備用于進(jìn)行抗腫瘤免疫的DNA疫苗中的用途，其中所述重 組質(zhì)粒VR-MS的特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為載體VR1012,在所述VR1012的多克隆 位點(diǎn)中插入一個(gè)SEQ ID NO:9所示的MS片段；優(yōu)選地，所插入的MS片段位于所述VR1012 的多克隆位點(diǎn)Sail和BamHI之間。
5. 權(quán)利要求4中所述的用途，其中所述疫苗中還包含一種重組腺病毒Ad-MS或者 一種重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，并且以VR-MS進(jìn)行初免，以Ad-MS或MVA-MS進(jìn) 燈加強(qiáng)免疫，其中所述重組腺病毒Ad_MS的特征在于在腺病毒中插入SEQ ID N0:9所不 的MS片段；優(yōu)選地，所述重組腺病毒Ad-MS的特征在于所述重組腺病毒的骨架載體為 pBHGlox A El，3Cre，所插入的MS片段位于所述重組腺病毒的多克隆位點(diǎn)Bglll處，并且其 中所述重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS的特征在于在改良安卡拉痘苗病毒中插入SEQ ID NO:9所示的MS片段；優(yōu)選地，所述的重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS的特征在于所插入 的MS片段位于所述重組改良安卡拉痘苗病毒的多克隆位點(diǎn)Sail和Kpnl之間。
6. 權(quán)利要求4或5中所述的用途，其中所述疫苗中還包含免疫佐劑，并且其中所述免疫 佐劑與所述VR-MS -同給予。
7. 權(quán)利要求6中所述的用途，其中所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因 子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
8. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述疫苗中還包含化療藥物。
9. 權(quán)利要求8所述的用途，其中所述化療藥物選自卡鉑、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述腫瘤為表達(dá)生存素和MUC1的腫瘤。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK104491852SQ201410788971
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月4日
【發(fā)明者】孔維, 張海紅, 于湘暉, 于永慧 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春百克生物科技股份公司