制備小牛脾提取物的方法及在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備小牛脾提取物的方法及在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。所述小牛脾提取物的制備工藝為包括勻漿液的制備，利用復(fù)合酶的協(xié)同作用對勻漿液酶解、5'-磷酸二酯酶酶解和膜過濾，以及無菌過濾和灌裝。本發(fā)明改進(jìn)了小牛脾提取物的生產(chǎn)工藝，使提取物中多肽提取率提升到原工藝的2-4倍，核糖提取率提升到原工藝的1-3倍。其抗腫瘤活性和提高免疫力活力分別提升了30%和60%，并且該提取物制劑在體內(nèi)外均可以抑制腫瘤的生長并且可以逆轉(zhuǎn)放化療引起的免疫抑制現(xiàn)象，該提取物還可以雙向調(diào)節(jié)人體的免疫力，維持免疫系統(tǒng)的正常工作。因此，小牛脾提取物可用于制備抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物或者與化療藥物聯(lián)用組成組合制劑。
【專利說明】制備小牛脾提取物的方法及在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明公開一種制備小牛脾提取物的方法，同時還公開了小牛脾提取物在在抗腫瘤和 免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用，屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002] 技術(shù)背景： 小牛脾提取物是小牛脾提取物注射液的主要原料。目前，國內(nèi)生產(chǎn)小牛脾提取物的制 備方法是物理提取法。如中國發(fā)明專利（CN201010257796.0)所公開的方法：取乳牛的脾 臟，用0.9%氯化鈉溶液清洗，加入1-5倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1?5次，膠體磨粒度 為2?8μπι ;將勻漿液-KTC?_30°C深凍，達(dá)到完全凍結(jié)后，取出放入20°C?50°C以下 水浴中解凍，完全融化后繼續(xù)-KTC?-30°C條件下深凍，如此反復(fù)進(jìn)行三次；將凍融后的 藥液60°C?KKTC保溫30-40分鐘，速降溫至KTC?20°C ;將上述溶液離心，離心速度為 3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?KTC以下，離心15-30分鐘，收集上清液；分別用100000? 50000道爾頓、10000?9000道爾頓、8000?5000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過 濾分裝，即得提取物。但采用上述方法得到的提取物多肽和核糖含量較低，不能有效利用生 物資源間接增加生產(chǎn)成本。而利用胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶的協(xié)同作用以及使用 5'-磷酸二酯酶可以降低提取物中多肽分子量并顯著增加多肽和核糖成分的含量。
[0003] 5' -磷酸二酯酶它是一類可將核酸定向水解為5' -核苷酸的酶制劑，現(xiàn)多用于從 細(xì)菌中提取核酸類物質(zhì)以及分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，本發(fā)明首次將5' -磷酸二酯酶應(yīng)用于生 物醫(yī)藥領(lǐng)域即從動物組織中同時提取多肽及核糖。
[0004] 目前已經(jīng)有研究表明小牛脾提取物無論是與化藥聯(lián)用或者單獨使用在臨床上都 表現(xiàn)出抗腫瘤活性，但是其單獨給藥的抗腫瘤活性并不高，故小牛脾提取物至今多作為腫 瘤放化療的輔助治療劑。
[0005] 小牛脾提取物對小鼠的不同免疫狀態(tài)的免疫調(diào)節(jié)方面鮮有研究。經(jīng)過本發(fā)明研究 內(nèi)容證實，小牛脾提取物能顯著增加正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO及TNF- α釋放，小鼠脾臟T 細(xì)胞和B細(xì)胞增殖能力比原工藝提供高了 60%。此外，小牛脾提取物在用環(huán)磷酰胺建立的小 鼠免疫抑制模型中的治療效果證明小牛脾提取物能夠使低下的免疫功能恢復(fù)到正常水平， 也能夠改善免疫刺激狀態(tài)，維持機(jī)體的自穩(wěn)，顯示出具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種小牛脾提取物，使提取物中多肽提取率提升到原工藝的2-4倍，核糖 提取率提升到原工藝的1-3倍。其抗腫瘤活性和提高免疫力活力分別提升了 30%和60%，并 且該提取物制劑在體內(nèi)外均可以抑制腫瘤的生長并且可以逆轉(zhuǎn)放化療引起的免疫抑制現(xiàn) 象。
[0007] 本發(fā)明一種小牛脾提取物，是通過以下方法制備的： 1) 取乳牛的脾臟500g，用0. 9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時以去除血水并漂洗； 2) 按照小牛脾重量加入1-1. 2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1?5次，膠體磨粒度為2? 8 μ m ； 3) 按照物料重量的0. 7?2. 0%加入組合蛋白酶，其中胰蛋白酶，菠蘿蛋白和酶胃蛋白 酶的質(zhì)量比為2?2. 5 :1. 5?2. 5 :0. 5?2,攪拌均勻并將勻漿液取出放入50°C以下水浴 中升溫至30°C?40°C保溫30分鐘； 4) 按照物料重量的0. 2?0. 5%加入5' -磷酸二酯酶，攪拌均勻并將勻漿液放入90°C 以下水浴中升溫至60°C?70°C保溫120分鐘； 5) 保溫結(jié)束后迅速降溫至KTC?20°C ; 6) 將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?5°C以下，離心10-20分 鐘，收集上清液； 7) 分別用100000?50000道爾頓/10000?9000道爾頓、8000?5000道爾頓的膜超 濾； 8) 0. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物； 其中所述的組合蛋白酶為胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述復(fù)合酶的質(zhì) 量比為：胰蛋白酶2?2. 5份，菠蘿蛋白酶1. 5?2. 5份，胃蛋白酶0. 5?2份。
[0008] 本發(fā)明所述的小牛脾提取物可在制備調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥物中的用途。
[0009] 本發(fā)明改進(jìn)現(xiàn)有的小牛脾提取物的提取工藝及參數(shù)，利用復(fù)合酶的協(xié)同作用與 5' -磷酸二酯酶聯(lián)合作用不僅大大提高產(chǎn)品中多肽和核糖的提取率還使所得提取物的抗腫 瘤活性和免疫調(diào)節(jié)功能顯著增強(qiáng)；制備的小牛脾提取物中含21-35重量份多肽、1-2重量 份核糖，顯著提升原材料的利用度、增加產(chǎn)品收率、提高產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0010] 發(fā)明的有益效果在于：利用復(fù)合酶的協(xié)同作用和5'-磷酸二酯酶酶解法處理小牛 脾提取物中間品，能夠增加小牛脾提取物中多肽和核糖的收率，其中多肽含量較原工藝提 升了 216. 5-378. 6%，核糖濃度提升了 96. 6-296. 9%，提高原材料的利用率即增加產(chǎn)品收率， 降低生產(chǎn)成品本；提取物的抗腫瘤活性較原工藝提高了 30% ;提高該小牛脾提取物的免疫 調(diào)節(jié)活力，尤其實在提高免疫力方面，采用復(fù)合酶協(xié)同酶解法比物理法得到提取物其提高 免疫力的活力提1?了 60%;提1?藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

【具體實施方式】
[0011] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限定本發(fā)明的范圍。其中對照例1和對照例2再現(xiàn)專利CN201010257796. 0的制備 方法。
[0012] 實施例1 : 取乳牛的脾臟（出生24小時以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1次，膠體磨粒度為 2?8 μ m ;加入組合蛋白酶加入胰蛋白酶3. 57g，菠蘿蛋白酶3. 57g，胃蛋白酶2. 86g份，攪 拌均勻并將勻漿液取出放入50°C以下水浴中升溫至30°C保溫30分鐘；加入Ig的5' -磷酸 二酯酶，攪拌均勻并將勻漿液放入90°C以下水浴中升溫至60°C保溫120分鐘；保溫結(jié)束后 迅速降溫至KTC ;將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?5°C以下，離 心20分鐘，收集上清液；分別用100000?50000道爾頓、10000?9000道爾頓、8000? 5000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0013] 實施例2: 取乳牛的脾臟（出生24小時以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入I. 2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿5次，膠體磨粒度 為?8μηι;加入胰蛋白酶1.75g份，菠蘿蛋白酶1.31 g份，胃蛋白酶0. 44 g份，攪拌均勻 并將勻漿液取出放入50°C以下水浴中升溫至40°C保溫30分鐘；加入2. 5g的5' -磷酸二 酯酶，攪拌均勻并將勻漿液放入90°C以下水浴中升溫至70°C保溫120分鐘；保溫結(jié)束后迅 速降溫至20°C ;將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?5°C以下，離心 10分鐘，收集上清液；分別用100000?50000道爾頓、10000?9000道爾頓、8000?5000 道爾頓的膜超濾；〇. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0014] 實施例3 : 取乳牛的脾臟（出生24小時以內(nèi)）500g，用0.9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1-1.2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿3次，膠體磨粒 度為2?8μπι ;加入胰蛋白酶2g份，菠蘿蛋白酶1.5 g，胃蛋白酶2g份，攪拌均勻并將 勻漿液取出放入50°C以下水浴中升溫至40°C保溫30分鐘；加入I. 9g的5' -磷酸二酯酶， 攪拌均勻并將勻漿液放入90°C以下水浴中升溫至65°C保溫120分鐘；保溫結(jié)束后迅速降溫 至15°C ;將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?5°C以下，離心20分 鐘，收集上清液；分別用100000?50000道爾頓、10000?9000道爾頓、8000?5000道 爾頓的膜超濾；〇. 20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物。
[0015] 對照例1 : 領(lǐng)取乳牛的脾臟（出生24小時以內(nèi)）500g，除去掉結(jié)締組織和脂肪，用0.9%氯化 鈉溶液清洗，加入3倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，一般進(jìn)行3次，膠體磨粒度為4μπι ;將 勻漿液放入冰庫-20°C深凍，達(dá)到完全凍結(jié)后，取出放入30°C以下水浴中解凍，完全融化 后繼續(xù)放入冰庫，如此反復(fù)進(jìn)行三次；將凍融后的藥液70°C保溫35分鐘，速降溫至15°C ; 將上述溶液離心，離心速度為3500轉(zhuǎn)/分，溫度5°C以下，離心20分鐘，收集上清液； 分別用80000道爾頓、10000道爾頓、7000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過濾分 裝，即得注射液。
[0016] 對照例2 : 領(lǐng)取乳牛的脾臟（出生24小時以內(nèi)）500g，除去掉結(jié)締組織和脂肪，用0.9%氯化 鈉溶液清洗，加入4倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，一般進(jìn)行5次，膠體磨粒度為3μπι ;將勻 漿液放入冰庫30°C深凍，達(dá)到完全凍結(jié)后，取出放入40°C以下水浴中解凍，完全融化后繼 續(xù)放入冰庫，如此反復(fù)進(jìn)行三次；將凍融后的藥液80°C保溫40分鐘，速降溫至20°C ;將上 述溶液離心，離心速度為3000轉(zhuǎn)/分，溫度4°C以下，離心30分鐘，收集上清液；分別 用60000道爾頓、9000道爾頓、6000道爾頓的膜超濾；0.20 μ m濾芯無菌過濾分裝，即 得提取物。
[0017] 以上實施例得到的提取物中各成分含量以及核酸純度(核酸純度由0D26(i/0D 28(i表 示）由表1體現(xiàn)。
[0018] 表1不同解法各種提取方法的提取結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種小牛脾提取物，是通過以下方法制備的： 1) 取乳牛的脾臟500g，用0. 9%氯化鈉溶液清洗并浸泡12小時以去除血水并漂洗； 2) 按照小牛脾重量加入1-1. 2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿1?5次，膠體磨粒度為2? 8 u m ； 3) 按照物料重量的0. 7?2. 0%加入組合蛋白酶，其中胰蛋白酶，菠蘿蛋白和酶胃蛋白 酶的質(zhì)量比為2?2. 5 :1. 5?2. 5 :0. 5?2,攪拌均勻并將勻漿液取出放入50°C以下水浴 中升溫至30°C?40°C保溫30分鐘； 4) 按照物料重量的0. 2?0. 5%加入5' -磷酸二酯酶，攪拌均勻并將勻漿液放入90°C 以下水浴中升溫至60°C?70°C保溫120分鐘； 5) 保溫結(jié)束后迅速降溫至10°C?20°C ; 6) 將上述溶液離心，離心速度為3000-4000轉(zhuǎn)/分，溫度0?5°C以下，離心10-20分 鐘，收集上清液； 7) 分別用100000?50000道爾頓/10000?9000道爾頓、8000?5000道爾頓的膜超 濾； 8) 0. 20 y m濾芯無菌過濾分裝，即得提取物； 其中所述的組合蛋白酶為胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述復(fù)合酶的質(zhì) 量比為：胰蛋白酶2?2. 5份，菠蘿蛋白酶1. 5?2. 5份，胃蛋白酶0. 5?2份。
2. 如權(quán)利要求1所述的小牛脾提取物可在制備調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K35/26GK104352521SQ201410615823
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】滕利榮, 賈東旭, 蔡廣勝, 彭小君, 盧文倩, 逯家輝, 孟慶繁, 王迪, 滕樂生, 謝晶, 王貞佐, 劉艷 申請人:吉林大學(xué)