一種犬干擾素α融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種犬干擾素α融合蛋白及編碼該犬干擾素α融合蛋白的核酸序列及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明犬干擾素α融合蛋白可溶性好，穩(wěn)定性高，不需要酶切即具有活性，具有良好應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種犬干擾素 α融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有抗病毒活性的犬干擾素 α融 合蛋白及其核酸序列及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（interferon，INF)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因其具有干擾病毒的感染和 復(fù)制功能而得名。其中，干擾素 α因其廣譜的生物學(xué)功能而被廣泛應(yīng)用和研究。1986年，美 國(guó)國(guó)家食品和藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)重組α干擾素治療人毛細(xì)胞白血病，此后，重組INFa 又被批準(zhǔn)治療艾滋病患者發(fā)生的Kaposi' s肉瘤、慢性髓樣白血病、濾泡性非霍奇金氏淋巴 瘤、黑色素瘤、丙型肝炎、乙型肝炎等疾病[金伯泉，醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京：人民衛(wèi) 生出版社，2008 :61.]。犬是人類忠實(shí)的朋友。根據(jù)犬的用途，可分為寵物犬和實(shí)用犬，實(shí)用 型的犬有實(shí)驗(yàn)犬、導(dǎo)盲犬、警犬等。無(wú)論哪一種，均是人類生活和工作上的好伙伴。但是隨 著飼養(yǎng)量的增加，犬病，特別是病毒病的發(fā)病率不斷升高，常常導(dǎo)致犬的死亡，給人類造成 精神和經(jīng)濟(jì)上的損失。犬的3大烈性病毒病，包括狂犬病、犬細(xì)小病毒病和犬溫?zé)岵?，致?率均非常高[王紅.犬α干擾素的表達(dá)及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D].北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.]。犬干擾素 α由于其抗病毒活性而在治療犬的病毒病方面有很大 的前景。
[0003] 傳統(tǒng)的生產(chǎn)干擾素 α的方法是用人工方法在動(dòng)物機(jī)體外或體內(nèi)，在干擾素誘 生劑誘導(dǎo)下產(chǎn)生干擾素 α。由于動(dòng)物產(chǎn)生的干擾素 α很微量[王紅，犬α干擾素的表 達(dá)及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.]，傳統(tǒng)方法 產(chǎn)生的干擾素 α無(wú)法滿足需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程表達(dá)干擾素 α成為 可能。從1987年Adolf Himmler第一個(gè)克隆出犬干擾素 α的基因 [Adolf Himmler, Rudolf Hauptmann, etc. Structure and expression in Escherichia coli of Canine Interferon- a gene [J]. Journal of interferon research，1987, 7 :173-183.]后，國(guó)內(nèi) 外陸續(xù)有關(guān)于基因工程克隆表達(dá)犬干擾素 α的研究報(bào)道[Taira, 0, etc. Cloning and expression of Canine interferon-a genes in Escherichia coli[J]· Immunology, 2005,67(10) :1059-1062.項(xiàng)黎麗等，犬α干擾素的克隆、表達(dá)及純化[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2010,1 :35-38. ]〇
[0004] 但干擾素 α在大腸桿菌中多以包涵體形式存在，幾乎無(wú)活性，需要經(jīng)過(guò)變性復(fù)性 的過(guò)程來(lái)獲得具有活性的蛋白質(zhì)[李桂偉.犬α干擾素的基因工程研究進(jìn)展[J].黑龍江 水產(chǎn)，2012,1 :38-39]。復(fù)性過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，需要大量的化學(xué)試劑，提高了成本。并且犬干擾素 α中含有多個(gè)二硫鍵，增加了復(fù)性成功的困難。所以不需要復(fù)性的可溶的蛋白是降低工業(yè) 成本的關(guān)鍵。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中，為提高外源蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的可溶性，通常采用基因工 程技術(shù)將目標(biāo)蛋白與一些分子伴侶蛋白相融合。該方法在提高外源蛋白可溶性的同時(shí)往往 還能提高融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量。但是融合蛋白通常需要表達(dá)后再酶切才能釋放 出有活性的蛋白。而酶切的步驟增加了純化工藝和成本，酶消化過(guò)程則增加了蛋白質(zhì)的不 穩(wěn)定性。因此本發(fā)明提出的基因工程表達(dá)的犬干擾素 α不需要酶切將極大地節(jié)約生產(chǎn)的 成本。另外，現(xiàn)在市場(chǎng)上的干擾素制劑需要每天給藥，2-4周為一個(gè)療程。每天給藥和長(zhǎng)時(shí) 間的周期不僅是病犬的痛苦，也增加了飼養(yǎng)主的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明通過(guò)基因工程將 犬干擾素 α與大腸桿菌蛋白NusA蛋白融合表達(dá)，NusA蛋白分子量大，能夠保護(hù)分子量較 小的犬干擾素 α，形成空間位阻，阻止蛋白酶對(duì)犬干擾素 α的降解，使犬干擾素 α穩(wěn)定性 提高，能長(zhǎng)時(shí)間保留活性，本發(fā)明對(duì)犬干擾素 α穩(wěn)定性的提高有效地改善了上述現(xiàn)狀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中的犬干擾素 α在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中多為包涵體。本發(fā)明克服了現(xiàn) 有技術(shù)制備犬干擾素 α產(chǎn)物為包涵體的缺陷，提出了一種可溶的犬干擾素 α融合蛋白及 其核酸序列。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的犬干擾素 α多為包涵體、表達(dá)量低、融合蛋白雖能解決上 述缺陷但往往需要表達(dá)后再酶切才能釋放出有活性的犬干擾素 α的問(wèn)題，本發(fā)明提出了 一種犬干擾素 α融合蛋白，不但不用酶切就有活性，且穩(wěn)定性提高。
[0007] 本發(fā)明提出一種編碼犬干擾素 α融合蛋白的核酸序列，所述犬干擾素 α融合蛋 白具有如SEQ ID No :1所示的核酸序列。
[0008] 其中，所述之核酸序列包含位于N端的NusA核酸序列和位于C端的犬干擾素 α 核酸序列，所述NusA核酸序列與所述犬干擾素 α核酸序列之間由EcoR I酶切序列連接。
[0009] 其中，所述之犬干擾素 α核酸序列是針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性優(yōu)化 過(guò)的核酸序列。參照大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)氨基酸密碼子的偏愛(ài)性、堿基GC含量、mRNA二級(jí) 結(jié)構(gòu)等綜合因素對(duì)天然犬干擾素 α核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，得到既不改變天然犬干擾素 α的 氨基酸序列，又能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中正常表達(dá)的核酸序列；所述之犬干擾素 α核酸序 列具有如SEQ ID No :3所述的核酸序列。
[0010] 其中，所述犬干擾素 α融合蛋白為可溶蛋白。
[0011] 本發(fā)明還提出了一種犬干擾素 α融合蛋白，其包含一NusA蛋白和一犬干擾素 α， 編碼所述犬干擾素 α融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No :1所示。NusA蛋白為大腸桿菌中 一種重要的蛋白，能減少某些轉(zhuǎn)錄的暫停，提高轉(zhuǎn)錄量。本發(fā)明首次提出將犬干擾素 α與 NusA蛋白融合，從而使其成為可溶性蛋白，而不是包涵體。本發(fā)明所述犬干擾素 α融合蛋 白的核酸序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，能在大腸桿菌系統(tǒng)中正常表達(dá)，從而使表達(dá)得到的犬干擾 素 α融合蛋白為可溶蛋白。
[0012] 本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白包含位于氮端的大腸桿菌NusA蛋白和位于碳端的犬 干擾素 α蛋白，所述NusA蛋白與所述犬干擾素 α蛋白由雙肽Glu-Phe連接。連接NusA 蛋白與犬干擾素 α蛋白的雙肽具有如SEQ ID No :2所示的氨基酸序列，該雙肽不能被特異 性蛋白酶酶切，能穩(wěn)定連接NusA蛋白和犬干擾素 α蛋白。本發(fā)明將犬干擾素 α與大腸桿 菌蛋白NusA蛋白融合，形成可溶的犬干擾素 α融合蛋白，該可溶的犬干擾素 α融合蛋白 不需要酶切，具有抗病毒活性。
[0013] 本發(fā)明中，所述犬干擾素 α融合蛋白具有如SEQ ID No :5所示的氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白為可溶性蛋白。本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白不需要 酶切即有抗病毒活性。其中，所述犬干擾素 α融合蛋白降解緩慢，具有高穩(wěn)定性，具有長(zhǎng)效 抗病毒活性。本發(fā)明提出了一種不需要酶切即有抗病毒活性的可溶性的犬干擾素 α融合 蛋白，所述犬干擾素 α融合蛋白為可溶性表達(dá)，不需要復(fù)性，具有高穩(wěn)定性。
[0015] 本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白具有高穩(wěn)定性。本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白是由犬 干擾素 α與大腸桿菌蛋白NusA蛋白融合組成，所述NusA蛋白與所述犬干擾素 α蛋白由雙 肽Glu-Phe連接。NusA蛋白分子量大，能夠保護(hù)分子量較小的犬干擾素 α，形成空間位阻， 阻止蛋白酶對(duì)犬干擾素 α的降解，使犬干擾素 α穩(wěn)定性增強(qiáng)，活性延長(zhǎng)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí) 施例中，犬干擾素 α融合蛋白在37 C放直12h后蛋白含量保留約90%，放直96h后蛋白含 量仍保留約63%。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，用犬干擾素 α融合蛋白處理細(xì)胞，即在含有 血清、各種蛋白酶和細(xì)胞因子的環(huán)境下，96h時(shí)活性仍然為30%左右。相比較地，現(xiàn)有技術(shù) 中，例如文獻(xiàn)（朱姣等，重組復(fù)合α干擾素及其聚乙二醇化修飾產(chǎn)物理化性質(zhì)研究[J]，藥 物生物技術(shù)，2009,16(1) :28-32)記載，在37°C血清中放置72h，干擾素活性降為0。例如， 另一文獻(xiàn)（姚文兵等，聚乙二醇修飾干擾素 a_2b的穩(wěn)定性研究[J]，中國(guó)生化藥物雜志， 2001,22(6) :289-292)記載，干擾素 α在37°C放置8h，活性只保留原來(lái)的20%，放置25h 后活性基本喪失，而不同PEG修飾的干擾素 α只保留約80%和50%活性。該文獻(xiàn)記載，在 37°C血清中放置lh，干擾素 α活性基本喪失，不同PEG修飾的干擾素 α只保留約30%和 10%活性。本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白同時(shí)具有高度的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性穩(wěn)定性。現(xiàn)有技 術(shù)通常用PEG修飾來(lái)增加穩(wěn)定性，但是PEG修飾和純化工藝復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，增加了成本。本 發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白不需要修飾即具有高度穩(wěn)定性，且穩(wěn)定性比經(jīng)現(xiàn)有技術(shù)PEG修飾 后的更1?。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述犬干擾素 α融合蛋白的制備方法。本發(fā)明所提供的犬干 擾素 α融合蛋白可參考常規(guī)基因工程表達(dá)方法而得。將犬干擾素 α的DNA序列按照大 腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化密碼子。通過(guò)克隆技術(shù)連接到表達(dá)NusA蛋白的載體 pET44a中，形成編碼犬干擾素 α融合蛋白的重組質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21表 達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)而產(chǎn)生犬干擾素 α融合蛋白。當(dāng)誘導(dǎo)溫度較低時(shí)，所表達(dá)的犬干擾 素 α融合蛋白為可溶性表達(dá)。經(jīng)過(guò)鎳離子親和層析純化，透析除鹽，最終得到犬干擾素 α 融合蛋白。
[0017] 本發(fā)明制備方法中，該表達(dá)載體為pET44a原核表達(dá)載體，表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌 BL21 (DE3)表達(dá)系統(tǒng)，純化方法為鎳離子柱親和層析，除鹽方法為透析除鹽。
[0018] 本發(fā)明制備方法中，誘導(dǎo)表達(dá)的適宜溫度范圍為18°C -37°C。優(yōu)選地，誘導(dǎo)溫度為 25。。。
[0019] 本發(fā)明中，編碼犬干擾素 α融合蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：首先參照大腸 桿菌BL21 (DE3)對(duì)氨基酸密碼子的偏愛(ài)性、GC含量、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等綜合因素對(duì)天然犬干 擾素 α的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，得到既不改變天然犬干擾素 α的氨基酸序列、又能在大腸桿 菌BL21(DE3)中高效表達(dá)的犬干擾素 α成熟肽基因，其序列如下，如SEQ ID No :3所示：
[0020] TGCCATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGCAATTGGCGTGTGCTGACGCTGCTGGGCCAGATGCGTCGT CTGAGCGCGAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCGTTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGCCAGCGTCTGCA AGAGGCGCAAGCGCTGAGCGTGGTGCATGTGATGACCCAGAAAGTGTTTCATCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCG CACCGTGGAATATGACCCTGCTGGAAGAGCTGTGTAGCGGCCTGAGCGAACAGCTGGATGATCTGGATGCGTGCCCG CTGCAGGAGGCAGGTCTGGCGGAAACCCCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAACGCATTAG CCTGTACCTGCAAGATCGTAATCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATGGTGCGTGCGGAAATTGGCCGTAGCTTTTTCA GCCTGACCATTCTGCAGGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA(SEQ ID No:3)
[0021] 為將犬干擾素 α成熟肽基因 （SEQ ID No :3)構(gòu)建到表達(dá)NusA蛋白的pET44a表 達(dá)載體中，在SEQ ID No :3序列的5'端添加 CCGGAATTC(其中CCG為保護(hù)堿基，GAATTC為 EcoRI酶切位點(diǎn)），3'端添加 CTCGAGCGG (其中CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，CGG為保護(hù)堿基）， 得到CaIFNa序列（SEQ ID No :4)，委托生物公司合成。其次，將人工合成的CaIFNa序列 (SEQ ID No:4)和表達(dá)載體pET44a均用EcoRI/XhoI雙酶切，將酶切后的CaIFNa連接到載 體pET44a上，形成重組質(zhì)粒pET44_CaIFNa。將重組質(zhì)粒 pET44_CaIFNa轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5 a，篩選單克隆鑒定。經(jīng)證實(shí)該重組質(zhì)粒含有表達(dá)犬干擾素 a融合蛋白（SEQ ID No: 5)的基因序列 NusA-CaIFNa (SEQ ID No :1)。
[0022] 其中，發(fā)酵犬干擾素 a融合蛋白的方法具體如下：首先將含有NusA-CaIFNa基 因序列（SEQ ID N〇:5)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，得到表達(dá)犬干擾素 a融 合蛋白的基因工程菌pET44-CaIFN a /BL21 (DE3)。將上述基因工程菌pET44-CaIFN a / BL21(DE3)接種于LB培養(yǎng)基中，37°C 210rpm過(guò)夜培養(yǎng)活化。將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于新鮮的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)(?6(|(|為06-0. 8時(shí)加入IPTG，使其終濃度為lmmol/L。25°C，210rpm誘 導(dǎo) 12h。
[0023] 其中，純化犬干擾素 a融合蛋白的方法具體如下：將發(fā)酵犬干擾素 a融合蛋白 的菌液離心，收集菌體。用IDAO重懸，超聲破碎菌體。離心收集上清。取鎳離子親和層析 柱，將超聲上清緩慢加入到層析柱中，再分別用2個(gè)柱體積的IDAO, IDA80, IDA100, IDA150， IDA200, IDA300, IDA1000溶液洗脫。收集含目的蛋白的梯度，用PBS透析除去咪唑。得到 純化后的犬干擾素 a融合蛋白。
[0024] 其中各溶液的配方如下：
[0025] IDAO :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl。
[0026] IDA80 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，80mM 咪唑。
[0027] IDAlOO :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，IOOmM 咪唑。
[0028] IDA150 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，150mM 咪唑。
[0029] IDA200 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，200mM 咪唑。
[0030] IDA300 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，300mM 咪唑。
[0031] IDA1000 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，IM 咪唑。
[0032] PBS :NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 5g，KH2PO4 0· 27g，蒸餾水定容至 1L。
[0033] 本發(fā)明還提供了犬干擾素 α融合蛋白的應(yīng)用，進(jìn)一步提出了所述犬干擾素 α融 合蛋白在制備犬抗病毒藥物中的應(yīng)用。其中，所述犬干擾素 a融合蛋白降解緩慢，具有高 穩(wěn)定性，具有長(zhǎng)效活性。所述犬干擾素 a融合蛋白為可溶性表達(dá)，不需要復(fù)性。所述犬干 擾素 a融合蛋白不需要酶切即具有活性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明犬干擾素 a融合蛋白具有抗 病毒活性，能保護(hù)犬腎細(xì)胞（MDCK)不受水泡性口炎病毒（VSV)的感染，本發(fā)明犬干擾素 a 融合蛋白可應(yīng)用于制成犬抗病毒藥物。
[0034] 本發(fā)明還提出了利用所述犬干擾素 a融合蛋白抑制犬病毒活性的方法。其中，所 述犬干擾素 a融合蛋白為無(wú)需酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。其中，所述犬干擾素 a融合蛋白為可溶性表達(dá)，不需要復(fù)性。其中，所述犬干擾素 a融合蛋白降解緩慢，具有高 穩(wěn)定性，具有長(zhǎng)效活性。
[0035] 本發(fā)明有益效果包括：本發(fā)明提出了一種編碼犬干擾素 α融合蛋白的核酸序列， 該核酸序列是針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性優(yōu)化所得，能在大腸桿菌中正常表達(dá)。 本發(fā)明還提出了一種犬干擾素 α融合蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)中重組犬干擾素 α多為包涵體，需 要復(fù)性才有活性，融合蛋白雖能解決上述問(wèn)題但往往需要酶切才能釋放出有活性的犬干擾 素 α。而本發(fā)明所述之犬干擾素 α融合蛋白為可溶性表達(dá)，不需要復(fù)性，克服了包涵體的 缺陷。且本發(fā)明所述犬干擾素 α融合蛋白不需要酶切即具有活性，省去了酶切過(guò)程所需要 的時(shí)間和試劑，節(jié)約了成本。同時(shí)本發(fā)明所述之犬干擾素 α融合蛋白穩(wěn)定性高，作為犬抗 病毒藥物中能減少用藥次數(shù)，降低用藥成本，因此具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為犬干擾素 α融合蛋白重組質(zhì)粒的鑒定圖；1、2 :DNA marker ;3 :重組質(zhì)粒； 4 :EcoRI和XhoI雙酶切；5 :PCR鑒定。
[0037] 圖2為不同溫度誘導(dǎo)犬干擾素 α融合蛋白的可溶性鑒定；I :Protein marker ; 2-3 :18°C誘導(dǎo)的超聲上清和沉淀；4-5 :25°C誘導(dǎo)的超聲上清和沉淀；6-7 :37°C誘導(dǎo)的超聲 上清和沉淀。
[0038] 圖3為犬干擾素 α融合蛋白純化前后的鑒定圖；I :Protein marker ;2 :超聲上 清；3 :超聲沉淀；4 :過(guò)親和柱后；5 :純化后。
[0039] 圖4為犬干擾素 α融合蛋白在37°C的體外穩(wěn)定性情況。
[0040] 圖5為犬干擾素 α融合蛋白處理犬腎細(xì)胞不同時(shí)間后的活性。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容 不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變 化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、 條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)， 本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。
[0042] 實(shí)施例1編碼犬干擾素 α融合蛋白的核酸序列的構(gòu)建
[0043] 第一步：犬干擾素 α基因的優(yōu)化
[0044] 參照大腸桿菌BL21 (DE3)對(duì)氨基酸密碼子的偏愛(ài)性、GC含量、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等綜 合因素對(duì)天然犬干擾素 α的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，得到既不改變天然犬干擾素 α的氨基酸 序列，又能在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)的犬干擾素 α成熟肽基因，其序列如以下SEQ ID No :3 所示：
[0045] TGCCATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGCAATTGGCGTGTGCTGACGCTGCTGGGCCAGATGCGTCGT CTGAGCGCGAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCGTTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGCCAGCGTCTGCA AGAGGCGCAAGCGCTGAGCGTGGTGCATGTGATGACCCAGAAAGTGTTTCATCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCG CACCGTGGAATATGACCCTGCTGGAAGAGCTGTGTAGCGGCCTGAGCGAACAGCTGGATGATCTGGATGCGTGCCCG CTGCAGGAGGCAGGTCTGGCGGAAACCCCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAACGCATTAG CCTGTACCTGCAAGATCGTAATCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATGGTGCGTGCGGAAATTGGCCGTAGCTTTTTCA GCCTGACCATTCTGCAGGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA(SEQ ID No:3)
[0046] 為將犬干擾素 α成熟肽基因 （SEQ ID No :3)構(gòu)建到表達(dá)NusA蛋白的pET44a表 達(dá)載體中，在SEQ ID No :3序列的5'端添加 CCGGAATTC(其中CCG為保護(hù)堿基，GAATTC為 EcoRI酶切位點(diǎn)），3'端添加 CTCGAGCGG (其中CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)，CGG為保護(hù)堿基）， 得到CaIFNa序列（SEQ ID No :4)，委托生物公司合成。
[0047] 第二步：構(gòu)建含犬干擾素 a融合蛋白基因 （SEQ ID No :1)的重組質(zhì)粒
[0048] 人工合成的CaIFNa序列（SEQIDNo:4)和表達(dá)載體pET44a均用EcoRI/XhoI雙 酶切，將酶切后的CaIFN α連接到載體pET44a上，形成重組質(zhì)粒pET44_CaIFN α。將重組質(zhì) 粒pET44_CaIFNa轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，篩選含有重組質(zhì)粒的菌，做PCR鑒定，并提取質(zhì)粒 做酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送至生物公司測(cè)序，證實(shí)該重組質(zhì)粒含有表達(dá)犬干擾素 α融合蛋白 (SEQ ID No :5)的基因序列 NusA-CaIFNa (SEQ ID No :1)。
[0049] 優(yōu)化重組質(zhì)粒的鑒定圖如圖1所示，其中，1、2 :DNA marker ;3 :重組質(zhì)粒；4 : EcoRI和XhoI雙酶切；5 :PCR鑒定。
[0050] 實(shí)施例2犬干擾素 α融合蛋白的可溶性鑒定
[0051] 第一步：構(gòu)建表達(dá)犬干擾素 α融合蛋白的可溶性鑒定的基因工程菌
[0052] 將上述所得的含有NusA-CaIFNa基因序列（SEQ ID No :5)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 入大腸桿菌BL21(DE3)，得到表達(dá)犬干擾素 α融合蛋白的基因工程菌pET44_CaIFNa/ BL21(DE3) 〇
[0053] 第二步：不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)
[0054] 將上述的基因工程菌pET44-CaIFNa /BL21 (DE3)接種于LB培養(yǎng)基中，37°C 210rpm 過(guò)夜培養(yǎng)活化。將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)0D_為06-0. 8時(shí)加 入IPTG，使其終濃度為lmmol/L。不同誘導(dǎo)溫度210rpm誘導(dǎo)12h。將上述所得菌液離心，收 集菌體。用IDAO重懸，超聲破碎菌體。12000rpm離心5min，將上清和沉淀分離，分別進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。
[0055] 不同誘導(dǎo)溫度下犬干擾素 α融合蛋白的可溶性鑒定結(jié)果如圖2,其中，I :marker ; 2-3 :18°C誘導(dǎo)的超聲上清和沉淀；4-5 :25°C誘導(dǎo)的超聲上清和沉淀；6-7 :37°C誘導(dǎo)的超聲 上清和沉淀。結(jié)果表明，在18°C和25°C下，犬干擾素 α融合蛋白存在于超聲上清中，即為 可溶性表達(dá)。
[0056] 其中，IDAO 的配方為：20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5Μ NaCl。
[0057] 實(shí)施例3制備犬干擾素 α融合蛋白
[0058] 第一步：發(fā)酵犬干擾素 α融合蛋白
[0059] 將保存的基因工程菌pET44-CaIFNa /BL21 (DE3)接種于LB培養(yǎng)基中，37°C 210rpm 過(guò)夜培養(yǎng)活化。將活化后的菌種轉(zhuǎn)接與新鮮的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)0D_為06-0. 8時(shí)加 入IPTG，使其終濃度為lmmol/L。25°C 210rpm誘導(dǎo)12h。
[0060] 第二步：純化犬干擾素 α融合蛋白
[0061] 將上述所得菌液離心，收集菌體。用IDAO重懸，超聲破碎菌體。離心收集上清。 取鎳離子親和層析柱，將超聲上清緩慢加入到層析柱中，在分別用2個(gè)柱體積的IDA0， IDA80, IDA100, IDA150, IDA200, IDA300, IDA1000 溶液洗脫。收集各梯度的洗脫液，用 12% SDS-PAGE分析各洗脫液成分。收集含目的蛋白的洗脫峰，用pH7. 4的PBS透析除去咪唑。 得到純化后的犬干擾素 α融合蛋白。
[0062] 犬干擾素 α融合蛋白純化前后的鑒定圖如圖3所示，其中，I :Protein marker ;2 : 超聲上清；3 :超聲沉淀；4 :過(guò)未和柱后；5 :純化后犬干擾素 α融合蛋白。
[0063] 其中各溶液的配方如下：
[0064] IDA80 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5Μ NaCl，80mM 咪唑。
[0065] IDAlOO :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，IOOmM 咪唑。
[0066] IDA150 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5Μ NaCl，150mM 咪唑。
[0067] IDA200 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，200mM 咪唑。
[0068] IDA300 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，300mM 咪唑。
[0069] IDA1000 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，IM 咪唑。
[0070] PBS :NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 5g，KH2PO4 0· 27g，蒸餾水定容至 1L。
[0071] 實(shí)施例4犬干擾素 α融合蛋白的抗病毒活性檢測(cè)
[0072] 本實(shí)施例采用實(shí)施例3制備得到的犬干擾素 α融合蛋白。
[0073] 采用微量細(xì)胞病變抑制法：將犬腎細(xì)胞MDCK接種于96孔板中，每孔1000個(gè)細(xì)胞， 待細(xì)胞貼壁之后加入4倍比稀釋的犬干擾素 α融合蛋白，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)。在CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。棄去上清，加入100TCID50的水泡型口炎皰疹病毒VSV。同時(shí)設(shè)立 陰性對(duì)照組（只加犬干擾素 α融合蛋白，不加病毒）、陽(yáng)性對(duì)照（只加病毒，不加犬干擾素 α融合蛋白）、空白組（不加犬干擾素 α融合蛋白，不加病毒）。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小 時(shí)。觀察細(xì)胞病變情況。能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受病毒感染的干擾素最高稀釋倍數(shù)，即為干擾 素的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)病變，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用VSV確能感染MDCK， 即該測(cè)試系統(tǒng)有效。陰性對(duì)照組的細(xì)胞狀態(tài)同空白組的相同，說(shuō)明本發(fā)明犬干擾素 α融合 蛋白對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒副作用。濃度較高的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞未出現(xiàn)病變，說(shuō)明本發(fā)明犬干擾素 a 融合蛋白能保護(hù)MDCK不受VSV的感染。用Reed-Muench法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組，即本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白的效價(jià)為（2. 25±0.87)X1012U/mol，表明本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白具有抗 病毒活性。
[0074] 實(shí)施例5犬干擾素 α融合蛋白的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0075] 本實(shí)施例采用實(shí)施例3制備得到的犬干擾素 α融合蛋白。
[0076] 犬干擾素 α融合蛋白溶在PBS中，0. 22um過(guò)濾除菌。置于37°C孵育，每隔一定時(shí) 間取樣，凍于_20°C保存。最后將所有的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色液染色后用軟 件分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，犬干擾素 α融合蛋白在37°C放置12h后蛋白含量保留約 90%，放置96h后蛋白含量仍保留約63%，表明本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白降解緩慢，穩(wěn)定 性好。
[0077] 實(shí)施例6犬干擾素 α融合蛋白的活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0078] 本實(shí)施例采用實(shí)施例3制備得到的犬干擾素 α融合蛋白。
[0079] 將犬腎細(xì)胞MDCK接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁之后加入4倍比稀釋的犬干擾 素 α融合蛋白，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)間。棄去上清，加入 100TCID50的水泡型口炎皰疹病毒VSV。在CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。觀察細(xì)胞病變情況。 能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受病毒感染的干擾素最高稀釋倍數(shù)，即為干擾素的效價(jià)。用Reed-Muench 法計(jì)算各個(gè)時(shí)間段犬干擾素 α融合蛋白的抗病毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，犬干擾素 a 融合蛋白處理細(xì)胞96h后仍保留30%左右的抗病毒活性，表明本發(fā)明犬干擾素 α融合蛋白 有長(zhǎng)效的活性。
【權(quán)利要求】
1. 編碼犬干擾素a融合蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有如SEQ ID No : 1所示之序列。
2. 如權(quán)利要求1所述之核酸序列，其特征在于，所述之核酸序列包含位于N端的NusA 核酸序列和位于C端的犬干擾素a核酸序列，所述NusA核酸序列與所述犬干擾素a核酸 序列之間由EcoR I酶切序列連接。
3. 如權(quán)利要求1所述之核酸序列，其特征在于，所述之犬干擾素a核酸序列是針對(duì)大 腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性優(yōu)化過(guò)的核酸序列；所述之犬干擾素a核酸序列具有如SEQ ID No : 3所示之序列。
4. 一種犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白包含一 NusA蛋 白和一犬干擾素a ;編碼所述犬干擾素a融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No :1所示。
5. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白 包含位于氮端的大腸桿菌NusA蛋白和位于碳端的犬干擾素a蛋白，所述NusA蛋白與所述 犬干擾素a蛋白之間由雙肽Glu-Phe連接。
6. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白 具有如SEQ ID No : 5所示之序列。
7. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白 為可溶性蛋白。
8. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白 不需要酶切即具有抗病毒活性。
9. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白 具有1?穩(wěn)定性。
10. 如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白在制備犬抗病毒藥物中的應(yīng)用。
11. 一種利用犬干擾素a融合蛋白抑制犬病毒活性的方法，其中，所述犬干擾素a融 合蛋白為如權(quán)利要求3所述的無(wú)需酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。
12. -種犬干擾素a融合蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟包括，將犬干擾素a 的DNA序列按照大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化密碼子，通過(guò)克隆技術(shù)連接到表 達(dá)NusA蛋白的載體pET44a中，形成編碼犬干擾素a融合蛋白的重組質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化進(jìn)大腸桿菌BL21表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)而產(chǎn)生犬干擾素a融合蛋白；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為 18°C-25°C時(shí)，所表達(dá)的犬干擾素a融合蛋白為可溶性表達(dá)；經(jīng)過(guò)鎳離子親和層析純化，透 析除鹽，得到如權(quán)利要求3所述的犬干擾素a融合蛋白。
13. 如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述犬干擾素a融合蛋白為不需要 酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。
【文檔編號(hào)】A61K38/21GK104388452SQ201410568273
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】楊芳, 黃靜, 潘盈盈, 譚士明, 嚴(yán)文娟, 陳亞州, 吳自榮 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)