用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法，用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒；包括非離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。本發(fā)明提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細胞支架，同時保留細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運用提供產(chǎn)品材料。
【專利說明】用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒，具體涉及用于去除不同器官和組織抗原成分的試劑盒。本發(fā)明還設(shè)計使用所述試劑盒獲得多器官和組織支架的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近幾年去細胞組織工程發(fā)展迅速，目前多種組織來源的去細胞支架已成功運用到在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，如皮膚，血管，神經(jīng)，小腸粘膜下層以及肝臟等。除了上述較成熟的去細胞組織外，許多動物的全器官去細胞支架也已成功制備，比如心臟，肝臟，腎臟，肺臟，脊髓等，在組織器官移植需求緊張的現(xiàn)狀下，為異體移植打下了扎實的基礎(chǔ)。但是每種全器官或組織去細胞支架的制備方法復(fù)雜多樣，所用的試劑也較為雜亂，缺乏系統(tǒng)的整理。
[0003]程遠等人公開了一種制備肝臟去細胞的試劑盒及其使用方法，盡管上述試劑盒依次利用溶栓液、灌注液1、I1、II1、IV依次對肝臟進行灌注能夠制得去細胞肝臟支架，但是其試劑盒只能應(yīng)用于制備部分動物的肝臟的去細胞支架，而且步驟比較繁瑣，并且由于方法和試劑的較為單一無法滿足其他器官和組織去細胞的要求，因此應(yīng)用范圍過于狹??；柴家科等人公開了無細胞毒性去細胞真皮基質(zhì)的制備及應(yīng)用，在不利用洗滌劑的前提下提供了效果良好的去細胞方案，然而最終檢測可看出DNA殘留量很大，因此抗原性的增強勢必對其在體實用性產(chǎn)生巨大的影響?，F(xiàn)有的去細胞方法以及去細胞試劑盒僅應(yīng)用于一種器官或組織，面向市場的范圍很狹小，商業(yè)價值較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提出了一種用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法。
[0005]用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒，包括非離子去垢劑1、離子去垢劑
1、離子去垢劑I1、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。
[0006]所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的離子去垢劑I采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的離子去垢劑II采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的等滲溶液的濃度為0.0lM的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌；
所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌；
所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌；
所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；
所述的組織疏松劑為由EDTA(乙二胺乙二酸)和胰酶溶于無菌等滲PBS配制，其中EDTA濃度為3.2%，胰酶濃度為4% ； 用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，
目標(biāo)對象為神經(jīng)組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑中I振蕩處理4?8h，然后置于高滲溶液中震蕩4?8h，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100?300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，振蕩速度的選擇與不同物種來源的組織有關(guān)，以振蕩速度不實質(zhì)性地損傷組織完整性為宜，例如人的脊髓去細胞振蕩速度為100rpm/min，振蕩時可以采取相似的速度。
[0007]目標(biāo)對象功能型復(fù)雜的全器官去細胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25_45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h，然后用PBS粉末配制的低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細胞支架，上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細胞，肝臟以門靜脈灌注，腎臟以腎動脈灌注，優(yōu)選的灌注速度為I?500ml/min，所有步驟均連續(xù)進行，灌注速度的選擇與不同物種來源的器官有關(guān)，以灌注速度不實質(zhì)性地損傷支架為宜，例如人腎臟的去細胞灌流速度為15ml/min，灌注時可以采用相似的速度。上述去垢劑第一次灌注時，會使器官從土黃色變成乳白色，去垢劑第二次灌注時，逐漸會使器官變成透明。
[0008]目標(biāo)對象為功能單一的全器官的去細胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25°C?45°C的等滲無菌PBS緩沖溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次,每次持續(xù)20分鐘,用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min,非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,核酸酶去除劑處理30min?60min,等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細胞支架上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細胞，心臟以冠狀動脈灌注，胰腺以膽管灌注，肺臟以肺動脈灌注。優(yōu)選的灌注速度為I?500ml/min，所有步驟均連續(xù)進行，灌注速度的選擇與具體的動物器官以及種類有關(guān)，以灌注速度不實質(zhì)性地損傷支架為宜，例如豬胰腺的去細胞灌流速度為6ml/min。經(jīng)去垢劑灌注后，器官會變透明。
[0009]目標(biāo)對象為結(jié)締組織，由于自身結(jié)構(gòu)致密的特點，處理時間、去垢劑濃度較上述其他組織有所增加，具體步驟如下:置于-80°C?-20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，該過程可以根據(jù)組織的致密程度適當(dāng)重復(fù)，沖洗完全后在離子去垢劑中振蕩處理4?48h，然后置于低滲溶液中震蕩4?48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4?48h，然后放入低滲溶液中震蕩4?48h，核酸酶去除劑處理60min?120min，無菌等滲PBS沖洗6?24h，即可制備得到上述組織去細胞支架。在無菌條件下取出目標(biāo)組織后，試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100?300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，振蕩速度的選擇與具體的動物有關(guān)，以振蕩速度不實質(zhì)性地損傷組織完整性為宜。例如兔的軟骨制備的振蕩速度為150rpm/min,振蕩時可以采取相似的速度。
[0010]對于需要灌注法去細胞器官，離體前對器官灌注疏栓液；
本發(fā)明提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細胞支架，同時保留細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運用提供產(chǎn)品材料。更為重要的是本發(fā)明可有效便捷的獲取各個靶向器官和組織細胞外優(yōu)質(zhì)基質(zhì)蛋白和各類細胞因子，為相關(guān)疾病治療、美容整形以及健康保健方面等提供原料獲取方法。其中的非離子去垢劑(Triton X-100)能夠破壞脂質(zhì)與脂質(zhì)及脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用，有效地破壞細胞膜；離子去垢劑(SDS，DOC)能夠有效地破壞蛋白與蛋白之間的相互作用。凍融過程可以通過形成細胞內(nèi)冰晶破壞細胞膜從而有效地使細胞溶解，而低滲(高滲)溶液可以使細胞皺縮破壞細胞膜進而溶解細胞，再結(jié)合能夠?qū)Ｒ恍缘厮庥锌乖缘暮怂岬暮怂崦?，最終可以獲得良好的去細胞支架。(上面有提到的幾類去細胞試劑都要講)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明中實施例1豬心臟去細胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖2為本發(fā)明中實施例1豬心臟去細胞支架的HE圖片；
圖3為本發(fā)明中實施例1豬心臟去細胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖4為本發(fā)明中實施例1豬心臟去細胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖5為本發(fā)明中實施例1豬肝臟去細胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖6為本發(fā)明中實施例1豬肝臟去細胞支架的HE圖片；
圖7為本發(fā)明中實施例1豬肝臟去細胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖8為本發(fā)明中實施例1豬肝臟去細胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖9為本發(fā)明中實施例1豬脊髓去細胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖10為本發(fā)明中實施例1豬脊髓去細胞支架的HE圖片；
圖11為本發(fā)明中實施例1豬脊髓去細胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖12為本發(fā)明中實施例1豬脊髓去細胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖13為本發(fā)明中實施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖14為本發(fā)明中實施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架的HE圖片；
圖15為本發(fā)明中實施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖16為本發(fā)明中實施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖。

【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此，本發(fā)明可運用任何不同物種來源的具有細胞成分的組織和器官結(jié)構(gòu)。
[0013]如圖1、圖2、圖3、圖4所示，豬心臟去細胞實施例1.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0014]離體將心臟經(jīng)升主動脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_80°C的低溫冰箱12?4h，12h后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑6h，核酸酶去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，灌注速度為lml/min，所有步驟均連續(xù)進行；制備得到的豬心臟細胞細胞支架，心臟脫細胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0015]豬心臟去細胞實施例2.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為3%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0016]離體將心臟經(jīng)升主動脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_40°C的低溫冰箱30h，30h后在30°C的等滲無菌PBS緩沖溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑40min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑15h，核酸酶去除劑處理45min，等滲溶液沖洗15h，灌注速度為200ml/min，所有步驟均連續(xù)進行；制備得到的豬心臟細胞細胞支架，心臟脫細胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0017]豬心臟去細胞實施例3.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0018]離體將心臟經(jīng)升主動脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_20°C的低溫冰箱48hl2?48h后在45°C的等滲無菌PBS緩沖溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑24h，核酸酶去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，灌注速度為500ml/min，所有步驟均連續(xù)進行；制備得到的豬心臟細胞細胞支架，心臟脫細胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0019]如圖5、圖6、圖7、圖8所示，豬肝臟去細胞實施例1.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0020]置于-80°C的低溫冰箱12，12h后在25的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，非離子去垢劑中灌注處理6h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，核酸去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，即可制備得到上述器官的去細胞支架，灌注速度為lml/min，所有步驟均連續(xù)進行，制備得到的豬肝臟細胞細胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0021]豬肝臟去細胞實施例2.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為5%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0022]置于-40°C的低溫冰箱20h，20h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑30min，非離子去垢劑中灌注處理15h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑140min，核酸去除劑處理45min，等滲溶液沖洗15h，即可制備得到上述器官的去細胞支架，優(yōu)選灌注速度為200/min，所有步驟均連續(xù)進行，制備得到的豬肝臟細胞細胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0023]豬肝臟去細胞實施例3.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0024]置于-20°C的低溫冰箱48h，48h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，非離子去垢劑中灌注處理24h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，核酸去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，即可制備得到上述器官的去細胞支架，灌注速度為500ml/min，所有步驟均連續(xù)進行，制備得到的豬肝臟細胞細胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0025]如圖9、圖10、圖11、圖12所示，豬脊髓去細胞實施例1.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0026]置于-80°C的低溫冰箱lh，Ih后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理4h，然后置于高滲溶液中震蕩4h，核酸去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，制備得到的豬脊髓細胞細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0027]豬脊髓去細胞實施例2.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為6%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0028]置于-40°C的低溫冰箱1.5h，1.5h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次,每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理6h，然后置于高滲溶液中震蕩6h，核酸去除劑處理40min，等滲溶液沖洗15h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為200rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，制備得到的豬脊髓細胞細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0029]豬脊髓去細胞實施例3.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0030]置于_20°C的低溫冰箱2h，2h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理8h，然后置于高滲溶液中震蕩8h，核酸去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，制備得到的豬脊髓細胞細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0031]如圖13、圖14、圖15、圖16所示，牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞實施例1.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0032]置于-80°C的低溫冰箱lh，Ih后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理4h，然后置于低滲溶液中震蕩4h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4h，然后放入低滲溶液中震蕩4h，核酸酶去除劑處理60minmin，無菌溶液沖洗6h，即可制備得到上述組織去細胞支架。振蕩速度為lOOrpm/min，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0033]牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞實施例2.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為3%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0034]置于-60°C的低溫冰箱1.5h，1.5h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理25h，然后置于低滲溶液中震蕩30h，在離子去垢劑II中再振蕩處理20h，然后放入低滲溶液中震蕩20h，核酸酶去除劑處理90min，無菌等滲PBS沖洗15h，即可制備得到上述組織去細胞支架，振蕩速度為200rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
[0035]牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞實施例3.取用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0036]置于_20°C的低溫冰箱2h，2h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理48h，然后置于低滲溶液中震蕩48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理48h，然后放入低滲溶液中震蕩48h，核酸酶去除劑處理120min，無菌等滲PBS沖洗24h，即可制備得到上述組織去細胞支架。振蕩速度為300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進行，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細胞支架，整體顏色較原來組織透明，HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留，掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測中幾乎不含有DNA成分。
【權(quán)利要求】
1.用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒；其特征在于:包括非離子去垢劑、離子去垢劑1、離子去垢劑I1、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑； 所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-ΙΟΟ，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的離子去垢劑I采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的離子去垢劑II采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的等滲溶液的濃度為0.0lM的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌； 所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌； 所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過高溫高壓滅菌； 所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液； 所述的組織疏松劑為由EDTA和胰酶溶于無菌等滲PBS配制，以下為濃度為體積比，其中EDTA濃度為3.2%，胰酶濃度為4%。
2.用于獲取多器官和組織細胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，其特征在于: 目標(biāo)對象為神經(jīng)組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑中I振蕩處理4?8h，然后置于高滲溶液中震蕩4?8h，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細胞支架；所述振蕩速度為100?300rpm/min，各步驟均連續(xù)進行； 目標(biāo)對象功能型復(fù)雜的全器官去細胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25-45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,然后用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min,核酸去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細胞支架，所述灌注速度為I?500ml/min,各步驟均連續(xù)進行，； 目標(biāo)對象為功能單一的全器官的去細胞的流程，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,核酸去除劑處理30min?60min,等滲溶液沖洗2?24h,即可制備得到上述器官的去細胞支架，所述灌注速度為I?500ml/min，各步驟均連續(xù)進行； 目標(biāo)對象為結(jié)締組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在離子去垢劑中振蕩處理4?48h，然后置于低滲溶液中震蕩4?48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4?48h，然后放入低滲溶液中震蕩4?48h，核酸去除劑處理60min?120min，無菌等滲PBS沖洗6?24h，即可制備得到上述組織去細胞支架；所述振蕩速度為100?300rpm/min，各步驟均連續(xù)進行。
【文檔編號】A61L27/36GK104288838SQ201410566192
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】倪金虎, 林賢豐, 張琪, 何佳怡, 陳蘊繽, 陳家鑫 申請人:林賢豐