一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法，包括以下步驟：提取豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)RNA，反轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲取豬Ⅱ型圓環(huán)病毒ORF2基因開放閱讀框片段，并鉚定定向插入T4噬菌體；利用免疫篩選的方法獲取具有ORF2基因的T4噬菌體；經(jīng)純化后重新侵染X-Blue ST1(CCTCC M 2014397)宿主細(xì)胞；發(fā)酵培養(yǎng)獲得的X-BlueST1宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)滅活后培養(yǎng)物作為抗原；ELISA標(biāo)定抗原效價(jià)，并用生理鹽水倍比稀釋抗原終濃度為107U/ml；1:2.5的比例加入疫苗佐劑，即為疫苗。本發(fā)明利用噬菌體表達(dá)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原并制備疫苗，避免了弱毒疫苗毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，且采用發(fā)酵培養(yǎng)利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成本遠(yuǎn)低于通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式生產(chǎn)疫苗。CCTCC M 201439720140901
【專利說明】一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制 備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒感染是由圓環(huán)病毒引起的豬的一種急性傳染病。主要特征為消瘦、體 質(zhì)下降、貧血、黃疸、腹瀉、發(fā)育不良、呼吸困難、母豬繁殖障礙的。伴有廣泛的病理化。根據(jù) 其血清型的不同可分為PCVl及PCV2。其中我國報(bào)道較多感染比較嚴(yán)重的為PCV2。目前治 療PCV2的方法多方法復(fù)雜，成本較高，從技術(shù)上取得的效果收益甚微。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原 疫苗的制備方法，用以控制豬圓環(huán)病毒II型病的感染，減少危害。
[0004] 本發(fā)明提供了一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法，為了對披露的 實(shí)施例的一些方面有一個(gè)基本的理解，下面給出了簡單的概括。
[0005] 本發(fā)明的一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法包括以下步驟：
[0006] 提取豬圓環(huán)病毒II型（PCV2)病毒培養(yǎng)液RNA，反轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增 獲取豬II型圓環(huán)病毒ORF2開放閱讀框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后將所述 豬圓環(huán)病毒II型ORF2基因片段鉚定定向插入T4噬菌體；利用所述T4噬菌體侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞，原核表達(dá)OFR2基因重組蛋白，并免疫動物制備多抗，利用 制備的豬圓環(huán)病毒II型多抗對插入ORF2基因片段的所述噬菌體進(jìn)行免疫篩選，獲取陽性 克隆斑，擴(kuò)增并測序鑒定插入序列的正確性；獲取具有正確插入ORF2基因的T4噬菌體；經(jīng) 純化后重新侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞；
[0007] 噬菌體再次侵染X-Blue STl CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞，發(fā)酵培養(yǎng)，OD值為0. 6 時(shí)，加入終濃度為100 y g/ml異丙基-e -D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)2h，誘導(dǎo)表達(dá)后 培養(yǎng)物加入終濃度為1%的甲醛并在4°C，轉(zhuǎn)速為120r/min下震蕩滅活24小時(shí)；處理后的 培養(yǎng)物作為免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫豬，制備豬的抗PCV2病毒的陽性血清；利用 間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA)方法檢測制備的抗PCV2血清的效價(jià)，再根據(jù)所測得的效 價(jià)，把抗體效價(jià)稀釋成為1:300 ;用標(biāo)定好的抗血清檢測培養(yǎng)物抗原效價(jià)，并用生理鹽水倍 比稀釋，稀釋抗原終濃度為l〇7U/ml ;以1:2. 5的比例加入疫苗佐劑，即得到最終所獲得疫 苗。
[0008] 其中，以下菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心：
[0009] 大腸桿菌EscherichiacoliX-BlueSTl;
[0010] 保藏編號：CCTCC M 2014397 ;
[0011] 保藏日期：2014年9月1日；
[0012] 簡稱為X-BlueSTl;
[0013] 保藏于中國，武漢，武漢大學(xué)。
[0014] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0015] 通過制備帶有PCV2病毒的噬菌體展示表達(dá)抗原，并把其制備成疫苗，取得較好的 保護(hù)效果。且可以大量生產(chǎn)只需細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低于現(xiàn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。由于噬菌 體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗是重組單蛋白抗原，并且T4噬菌體感染具有細(xì)胞嗜性，避免 了現(xiàn)行活疫苗返毒及引入外援病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)。該疫苗易于制備且利于大規(guī)模生產(chǎn)及使 用。
[0016] 為了上述以及相關(guān)的目的，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例包括后面將詳細(xì)說明并在權(quán)利要求 中特別指出的特征。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖10RF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；
[0018] 圖20RF2抗原蛋白的抗原表位分析。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下優(yōu)選實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵺`它們。
[0020] 下面對本發(fā)明做詳細(xì)描述。
[0021] 實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒II型ORF2基因的獲取及免疫篩選多抗的制備
[0022] 1豬圓環(huán)病毒II型ORF2基因的獲取。
[0023] GENBANK上查找PCV2的ORF2序列，根據(jù)所獲得的序列查找開放閱讀框，并根據(jù)開 放閱讀框的序列設(shè)計(jì)以下引物：
[0024] 上游引物 5 ' -CGGGTACCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGGC-3 '
[0025] 下游引物 5 ' -GCGGATCCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGG-3 '
[0026] 提取豬圓環(huán)病毒II型病毒培養(yǎng)液的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增 ORF2片段，目的基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，704bp中為目的條帶，連接PMD-18T載體，測序獲 得的基因片段的特征如下：
[0027] ORF的長度為704bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA?；蛐蛄腥缦拢?br>
【權(quán)利要求】
1. 一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 提取豬圓環(huán)病毒II型（PCV2)病毒培養(yǎng)液RNA，反轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增獲 取豬II型圓環(huán)病毒0RF2開放閱讀框基因片段，制成改造后的0RF2基因片段，然后將所述 豬圓環(huán)病毒II型0RF2基因片段鉚定定向插入T4噬菌體；利用所述T4噬菌體侵染X-Blue ST1CCTCC M2014397宿主細(xì)胞，原核表達(dá)0FR2基因重組蛋白，并免疫動物制備多抗，利用制 備的豬圓環(huán)病毒II型多抗對插入0RF2基因片段的所述噬菌體進(jìn)行免疫篩選，獲取陽性克 隆斑，擴(kuò)增并測序鑒定插入序列的正確性；獲取具有正確插入0RF2基因的T4噬菌體；經(jīng)純 化后重新侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞； 噬菌體再次侵染X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞，發(fā)酵培養(yǎng)，OD值為0. 6時(shí)，加 入終濃度為100 U g/ml異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)2h，誘導(dǎo)表達(dá)后培養(yǎng) 物加入終濃度為1%的甲醛并在4°C，轉(zhuǎn)速為120r/min下震蕩滅活24小時(shí)；處理后的培養(yǎng) 物作為免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫豬，制備豬的抗PCV2病毒的陽性血清；利用間接 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA)方法檢測制備的抗PCV2血清的效價(jià)，再根據(jù)所測得的效價(jià)， 把抗體效價(jià)稀釋成為1:300 ;用標(biāo)定好的抗血清檢測培養(yǎng)物抗原效價(jià)，并用生理鹽水倍比 稀釋，稀釋抗原終濃度為l〇7U/ml ;以1:2. 5的比例加入疫苗佐劑，即得到最終所獲得疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒II型ORF2基因片段 鉚定定向插入T4噬菌體方法為：將所述改造后的ORF2基因片段連接插入pMD-18T載體，制 成PMD-18T-ORF2 ;利用EcoR I和hindlll雙酶切，回收酶切片段，并用EcoR I和hindlll 酶切T4噬菌體表達(dá)質(zhì)粒；回收酶切片段，T4連接酶連接基因片段到T4噬菌體的S0C位點(diǎn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒II型多抗的制備方 法為： 用EcoR I和hindlll分別雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-0RF2和表達(dá)載體 pET-28a(+);以 4yl 0RF2 基因片段、lyl pET-28a(+)載體片段、lyl T4DNA 酶、lyl 連 接酶緩沖液、3. 5 y 1 ddH20的體系，4°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到ToplO感受態(tài)細(xì)胞中， 冰浴30min，42°C熱應(yīng)激90s，冰浴2-3min，加 lml LB液體培養(yǎng)基37°C搖40min，均勻涂在含 氨芐西林（100 y g/ml)的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜；挑取陽性菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和雙酶切鑒定，得到pET-28a-0RF2 ; 將所述pET-28a-0RF2轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coli BL21(DE3)中，在含50yg/ml卡那霉素的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，加入含卡那霉素（50 y g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)至菌液A600達(dá)0. 4-0. 6時(shí)，加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG) 誘導(dǎo)表達(dá)，37°C振蕩誘導(dǎo)4h，離心，收集菌體；取lml菌液，4°C，8000g/min離心5min，保 留沉淀物，菌體用PBS反復(fù)沖洗兩次，再進(jìn)行超聲，超聲儀設(shè)置為130W、開5s、停5s，超聲 30min，12000r/min離心15min，收集沉淀；向沉淀物中加入70 y 1 1XTE緩沖液，重懸沉淀， 加入4. 5 y 1二硫蘇糖醇（DIT)，2 y 1 5 X上樣緩沖液，煮沸l(wèi)Omin，4°C，10000g離心10min， 取15 y 1上清進(jìn)行SDS-PAGE分析；條帶正確后，用含有8M尿素的緩沖液重懸沉淀；4°C條件 下溶解lh ;過鎳柱，分離純化表達(dá)的重組蛋白，對純化復(fù)性的原核表達(dá)蛋白進(jìn)行梯度復(fù)性， 并透析濃縮；用純化復(fù)性的原核表達(dá)蛋白免疫豬（每頭20mg)，三免后采血，重組蛋白抗原 包被ELISA檢測抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:16時(shí)，采血，靜置析出，離心后獲得血清作為多 抗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述原核表達(dá)，表達(dá)并純化所述豬圓 環(huán)病毒II型0RF2重組蛋白，用重組蛋白制備多克隆血清，并利用獲取的陽性多克隆血清， 把插入0RF-2基因的T4噬菌體從T4噬菌體文庫中篩選出來，免疫篩選獲取陽性克隆斑，純 化測序鑒定，并把其作為侵染新的X-Blue ST1CCTCC M 2014397宿主細(xì)胞的種毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗佐劑為化妝品級白油。
【文檔編號】A61K39/12GK104474540SQ201410515139
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】李明義, 高江明, 劉陽, 李曉林, 單學(xué)強(qiáng), 張倫, 馮晶晶, 李佳棋, 孫化露, 葛棟, 郭春麗 申請人:山東信得科技股份有限公司