纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料的應(yīng)用。具體涉及纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料抑制破骨細(xì)胞生成的應(yīng)用和纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料作為骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料在體液環(huán)境下所釋放的鈣離子及硅酸能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并誘導(dǎo)其分泌大量骨保護(hù)素，從而起到抑制破骨細(xì)胞活化及破骨功能的作用。而在植入后期，骨保護(hù)素分泌恢復(fù)正常水平，此時(shí)破骨細(xì)胞的活化有利于骨改建過程的正常進(jìn)行。
【專利說明】纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程支架材料領(lǐng)域，涉及一種利用仿生礦化的原理實(shí)現(xiàn)兩種礦物質(zhì)---二氧化硅和羥基磷灰石在膠原纖維內(nèi)有序沉積的方法，構(gòu)建了具有良好機(jī)械性能和成骨特性的新型纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料。

【背景技術(shù)】
[0002]I型膠原蛋白是脊椎動(dòng)物骨、牙等硬組織中的主要有機(jī)基質(zhì)，具有來源廣泛、合成簡單、生物相容性良好、韌性較強(qiáng)等特點(diǎn)，是組織工程領(lǐng)域常用的支架材料，但是易于降解的特點(diǎn)及較差的機(jī)械性能限制了其更廣泛的應(yīng)用。如何用仿生合成的方法，實(shí)現(xiàn)I型膠原纖維內(nèi)的快速有效礦化，恢復(fù)自然礦化單位中膠原分子與礦物質(zhì)從微觀水平到介觀水平再到宏觀水平分級有序的結(jié)合形式，從而達(dá)到優(yōu)良的機(jī)械性能，是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，針對該問題的探索也必將為新一代的骨、牙等硬組織修復(fù)材料的研發(fā)提供全新的思路。
[0003]國內(nèi)外大量研究表明，以聚合物穩(wěn)定磷酸鈣無定形液相前體為基礎(chǔ)，初步實(shí)現(xiàn)纖維內(nèi)礦化恢復(fù)自然礦化膠原的仿生結(jié)構(gòu)，并具有良好機(jī)械強(qiáng)度，而受到廣泛關(guān)注。但是目前的仿生鈣化方法仍存在周期較長、鈣化深度受限、鈣化不均勻及膠原部分降解等問題，從而制約了該方法的廣泛應(yīng)用。
[0004]在自然界的生物礦物中，除含鈣礦物(碳酸鈣、磷酸鈣等)以外，非晶二氧化硅是另一種主要形式。由于二氧化硅具有合成迅速的特點(diǎn)，發(fā)明人在前期工作中借鑒生物硅化的原理，以合成迅速的二氧化硅替代傳統(tǒng)的羥基磷灰石，實(shí)現(xiàn)膠原纖維的快速硅化，從而克服了纖維內(nèi)鈣化技術(shù)在應(yīng)用過程中的瓶頸問題。通過該項(xiàng)技術(shù)所形成的硅化膠原支架表面含有大量的活性硅醇基團(tuán)，從而有利于支架材料的各種功能化修飾，并且能夠隨著活性硅的水解而進(jìn)行緩釋，所釋放出的活性硅能夠顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的成骨分化及血管內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)的成血管分化，顯示了其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。但在發(fā)明人進(jìn)一步推進(jìn)該材料的轉(zhuǎn)化應(yīng)用過程中，發(fā)現(xiàn)由于纖維內(nèi)二氧化硅的無定形狀態(tài)導(dǎo)致材料的機(jī)械性能尚無法與自然骨組織相匹敵，并且存在體內(nèi)降解速度與新生組織長入不匹配，材料骨整合速度較慢等問題亟待解決。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于提供纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料抑制破骨細(xì)胞生成的應(yīng)用。
[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的另一目的是提供纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料作為骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0008](I)骨修復(fù)材料的早期骨整合對于缺損修復(fù)效果至關(guān)重要，因此如何在植入早期誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活化同時(shí)抑制破骨細(xì)胞功能是實(shí)現(xiàn)早期骨整合的關(guān)鍵。纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料在體液環(huán)境下所釋放的鈣離子及硅酸能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并誘導(dǎo)其分泌大量骨保護(hù)素，從而起到抑制破骨細(xì)胞活化及破骨功能的作用。而在植入后期，骨保護(hù)素分泌恢復(fù)正常水平，此時(shí)破骨細(xì)胞的活化有利于骨改建過程的正常進(jìn)行。
[0009](2)本發(fā)明所形成的纖維內(nèi)鈣/硅雜化仿生膠原支架相比于其他骨修復(fù)材料具有明顯的優(yōu)越性，體現(xiàn)在:
[0010]I)纖維內(nèi)的礦化模式更高程度的模擬了自然骨組織的礦化形式，顯著增強(qiáng)了膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度，并能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供更好的內(nèi)環(huán)境；
[0011]2)材料中羥基磷灰石/ 二氧化硅多組分有序結(jié)合的特點(diǎn)綜合了膠原纖維的生物相容性、羥基磷灰石的骨傳導(dǎo)性及活性硅促進(jìn)成骨、成血管特性；
[0012]3)材料鈣/硅比例的可控化為定向調(diào)節(jié)材料的理化性能、機(jī)械強(qiáng)度及生物學(xué)特性提供了可能，有利于形成適于不同類型骨缺損修復(fù)的系列材料；
[0013]4) 二氧化硅表面的活性硅醇基團(tuán)及納米羥基磷灰石的強(qiáng)吸附性，使得材料的可修飾性強(qiáng)，且不同的修飾位點(diǎn)及修飾機(jī)理有利于對材料實(shí)現(xiàn)多重功能化改性。
[0014](3)與傳統(tǒng)礦化中膠原與礦物質(zhì)的無序混合不同，本發(fā)明中采用仿生礦化的方法，通過仿生礦化類似物(聚丙烯氯化銨、聚天冬氨酸、聚丙烯酸)的使用，實(shí)現(xiàn)了膠原纖維內(nèi)部的有序礦化，模擬了自然骨組織膠原纖維與礦物質(zhì)有序排列的纖維內(nèi)礦化形式，而這種纖維內(nèi)礦化形式是構(gòu)成自然骨組織7級分級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，不僅決定了骨組織在納米尺度上的力學(xué)性能，更對其整體機(jī)械和生物學(xué)特性起著決定性作用。
[0015](4)由于氯化膽堿具有良好的生物安全性，因此本發(fā)明中采用氯化膽堿來穩(wěn)定硅酸前體溶液，從而為硅酸前體對膠原纖維內(nèi)部間隙的滲透提供足夠的時(shí)間。在本發(fā)明中采用聚陽離子聚丙烯氯化銨對膠原支架進(jìn)行前期處理，與膠原纖維表面的陰性電荷位點(diǎn)結(jié)合，從而形成富含多聚陽離子的膠原纖維內(nèi)環(huán)境，以促進(jìn)后期帶負(fù)電荷的硅酸前體對膠原纖維的粘附、滲透。此外帶正電荷的聚丙烯氯化銨有可能與膠原纖維表面的陰性電荷位點(diǎn)結(jié)合并發(fā)生相分離，模擬了硅藻蛋白兼性分子的特點(diǎn)，為滲透入膠原纖維內(nèi)部的液相硅酸前體向固相高聚合度的二氧化硅轉(zhuǎn)化提供催化位點(diǎn)，而形成二氧化硅在膠原內(nèi)部的有序沉積，反映出膠原自然礦化狀態(tài)時(shí)的周期性橫紋結(jié)構(gòu)。這種纖維內(nèi)部的二氧化硅可以進(jìn)一步為聚陰離子穩(wěn)定的磷酸鈣前體在膠原纖維內(nèi)部的定向聚集、成核及晶體轉(zhuǎn)化與生長提供位點(diǎn)，從而大大縮短纖維內(nèi)礦化所需的時(shí)間，解決了現(xiàn)有仿生鈣化技術(shù)中礦化周期長(14天-3月)、礦化不均勻、膠原部分降解等問題。
[0016](5)本發(fā)明通過先硅化后鈣化的方式，在膠原纖維內(nèi)部同時(shí)引入了二氧化硅和羥基磷灰石兩種礦物質(zhì)，在顯著提高膠原支架機(jī)械性能的同時(shí)，極大的促進(jìn)了材料的促成骨特性。該材料應(yīng)用于骨組織工程時(shí)，表現(xiàn)出力學(xué)性能優(yōu)、生物相容性高、促成骨活性強(qiáng)等優(yōu)勢。此外，這種鈣/硅雜化材料表面存在大量帶有負(fù)電荷的硅醇基團(tuán)及活性羥基，可有效結(jié)合細(xì)胞募集因子SDF-1 (等電點(diǎn)=9.9，中性環(huán)境下帶有強(qiáng)正電荷)，從而使支架具有自體細(xì)胞募集功能；同時(shí)納米羥基磷灰石的強(qiáng)吸附特性便與其與成骨誘導(dǎo)因子特異結(jié)合(如BMP-7)，達(dá)到促進(jìn)成骨功能。細(xì)胞因子將隨材料在體內(nèi)降解而緩慢、有序釋放，使得無需添加額外的緩釋系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)了雜化骨自體細(xì)胞募集性/成骨誘導(dǎo)性的雙重功能化修飾，從而達(dá)到誘導(dǎo)自體骨組織原位再生的功能，克服了常規(guī)骨組織工程中種子細(xì)胞獲取困難、來源有限、費(fèi)用昂貴、成骨活性不足等嚴(yán)重缺陷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1中左圖為為實(shí)施例1的未礦化膠原支架；右圖為實(shí)施例1的仿生雜化膠原支架；
[0018]圖2為實(shí)施例1的仿生雜化處理膠原支架的Micro CT重建圖像；
[0019]圖3為實(shí)施例1的纖維內(nèi)雜化膠原支架的熱重分析，其中實(shí)線表示質(zhì)量保留率；虛線表示微分質(zhì)量保留率；
[0020]圖4為實(shí)施例1纖維內(nèi)雜化膠原支架、對比例2仿生鈣化膠原支架和對比例I的仿生硅化膠原支架的機(jī)械性能對比分析圖；
[0021]圖5為實(shí)施例1仿生雜化膠原支架活性硅及鈣離子的釋放特點(diǎn)，SCS:硅化膠原、CCS:鈣化膠原、BCS:雜化膠原；
[0022]圖6為實(shí)施例1的仿生雜化膠原支架在模擬體液中浸泡24小時(shí)后表面形成大量羥基磷灰石沉積；
[0023]圖7為不同支架材料的生物相容性對比圖，圖中相同大寫字母表示不同支架組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，P>0.05 ;相同小寫字母表示不同支架浸提液組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，Ρ>0.05 ；
[0024]圖8為不同支架材料在體外實(shí)驗(yàn)中的促成骨特性，圖A為各組支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的影響；圖B為各組支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外形成礦化結(jié)節(jié)能力的影響；圖C為各組支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，CS:未礦化膠原、SCS:硅化膠原、CCS:鈣化膠原、BCS:雜化膠原；ALP:堿性磷酸酶、COLI:1型膠原、OPN:骨橋蛋白、OC:骨鈣素、OPG:骨保護(hù)素、RANKL:核因子κ B受體活化因子配體N =6表不:每組6個(gè)樣本；
[0025]圖9為不同支架材料在體外實(shí)驗(yàn)中抑制破骨前體細(xì)胞的分化及破骨功能結(jié)果對比圖，A圖為各膠原支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)7天后的OPG及RANKL蛋白表達(dá)變化；Β圖為與支架材料共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對RAW細(xì)胞破骨分化及骨吸收功能的影響，C圖為RAW細(xì)胞TRAP染色，D圖為RAW細(xì)胞骨吸收陷窩檢測；
[0026]圖10為仿生雜化膠原支架激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)通路變化該圖顯示，仿生雜化膠原支架可通過激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P38(由硅激活)及AKT(由鈣激活)通路，顯著促進(jìn)其分泌破骨抑制因子骨保護(hù)素(OPG)，從而抑制破骨前體細(xì)胞的分化及破骨功能，A圖為各膠原支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)7天后的ERK1/2，P38及AKT通路的活化情況。由圖可見仿生硅化膠原支架(SCS)主要活化ERK1/2及P38通路，仿生鈣化膠原支架(CCS)主要活化AKT通路，仿生雜化膠原支架(BCS)三條通路均顯著活化；B圖為A實(shí)驗(yàn)定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；C圖為BCS可顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)破骨抑制因子0PG，該作用可被P38通路抑制劑SB203580及AKT通路抑制劑LY294002顯著阻斷，但ERK1/2通路抑制劑U-0126則無阻斷作用，D圖為為C實(shí)驗(yàn)定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；E為與BCS共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著促進(jìn)RAW細(xì)胞破骨分化及骨吸收功能，第一行為RAW細(xì)胞TRAP染色，第二行為RAW細(xì)胞骨吸收陷窩檢測。BCS的上述作用可被P38通路抑制劑SB203580及AKT通路抑制劑LY294002顯著阻斷，但ERK1/2通路抑制劑U-0126則無阻斷作用。F與G:為E實(shí)驗(yàn)定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。上述結(jié)果表明BCS的抑制破骨作用主要是通過釋放硅激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P38通路，釋放鈣激活其AKT通路，兩者的疊加作用顯著促進(jìn)干細(xì)胞分泌0PG，從而達(dá)到了明顯抑制破骨前體細(xì)胞分化及成熟的效果。BCS釋放硅激活干細(xì)胞ERK1/2通路主要是參與了其成骨分化過程；P_ERK:磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、total-ERK:整體細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、p-p38:磷酸化的p38、total-p38:整體p38、p_AKT:磷酸化的蛋白激酶B、total-AKT:整體蛋白激酶B。圖中相同大寫字母、小寫字母、數(shù)字表示不同組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，P>0.05。
[0027]圖11為仿生雜化膠原支架修復(fù)小鼠顱骨缺損的典型顯微CT圖片。

【具體實(shí)施方式】
[0028]在仿生硅化領(lǐng)域中，硅藻、海綿等生物在常溫常壓下可快速合成硅質(zhì)細(xì)胞壁，這一現(xiàn)象引起研究者的濃厚興趣。從硅藻細(xì)胞壁中提取的長鏈聚胺可以在體外快速催化硅酸前體溶液凝集形成二氧化硅。這一現(xiàn)象提示我們使用合成迅速的二氧化硅替代傳統(tǒng)的羥基磷灰石，有望實(shí)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)的快速有效礦化，形成以膠原纖維內(nèi)部二氧化硅有序沉積為特征的支架材料。同時(shí)這種纖維內(nèi)部的二氧化硅可以進(jìn)一步為纖維內(nèi)羥基磷灰石的聚集、成核、生長提供位點(diǎn)，從而大大加速了纖維內(nèi)鈣化的進(jìn)程，形成以纖維內(nèi)部二氧化硅和羥基磷灰石有序沉積為特征的新型支架材料。已有研究表明二氧化硅水解所釋放的硅酸具有促進(jìn)成骨、成血管的潛能，而羥基磷灰石則具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，從而為早期的骨結(jié)合提供物質(zhì)基礎(chǔ)，那么所形成的新型仿生雜化膠原材料是否具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)的作用呢？國內(nèi)外尚未見利用仿生礦化的方法，實(shí)現(xiàn)膠原分子纖維內(nèi)雜化礦化，構(gòu)建新型纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料并應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的報(bào)道。
[0029]本發(fā)明的纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料可采用下述方法制備:
[0030](I)采用膠原(牛膠原、豬膠原等)溶脹液冷凍干燥法制備疏松多孔的膠原支架，并進(jìn)行交聯(lián)固定；
[0031](2)采用聚丙烯氯化銨溶液對上述制備的膠原支架進(jìn)行表面處理；
[0032](3)通過水解正硅酸四乙酯獲得正硅酸溶液，與不同濃度的氯化膽堿溶液混合后，制備穩(wěn)定的硅酸前體溶液；
[0033](4)將步驟(2)所得的經(jīng)表面處理的膠原支架置于步驟(3)所得的硅酸前體溶液中進(jìn)行礦化處理，制得以纖維內(nèi)二氧化硅礦物質(zhì)在膠原分子內(nèi)的有序沉積為特征的仿生硅化膠原材料；
[0034](5)制備聚陰離子穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液；
[0035](6)將步驟(4)所得的纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料置于步驟(5)所得的聚陰離子穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中孵育制得纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料。該纖維內(nèi)雜化膠原支架材料以膠原纖維內(nèi)羥基磷灰石與二氧化硅有序沉積為特點(diǎn)、具有不同鈣/硅比例的仿生雜化膠原支架材料。
[0036]實(shí)施例1:
[0037]該實(shí)施例為纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料的構(gòu)建:
[0038](I)取新鮮牛腱500g，去除筋膜、脂肪等雜質(zhì)后切成薄片；將切好的腱片加入250mL 0.5%的蛋白酶消化液中，在37°C恒溫下進(jìn)行消化處理3小時(shí)后，使用10mL 0.3g/LH2O2溶液終止酶消化反應(yīng)，蒸餾水反復(fù)沖洗后晾干^flOOg晾干的腱片加入10mL 0.1%的醋酸溶液進(jìn)行溶脹，攪拌均勻并離心除去雜質(zhì)；采用磷酸鹽溶液進(jìn)行反復(fù)鹽析，以提高膠原溶液純度；使用聚乙二醇進(jìn)行濃縮，制備終濃度為20mg/mL的膠原溶液；_20°C預(yù)冷2小時(shí)后，置于正空冷凍干燥機(jī)凍干24小時(shí)，制得多孔膠原海綿；使用0.3M 1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺/0.06M N-羥基琥珀酰亞胺溶液室溫下對膠原海綿進(jìn)行交聯(lián)固定5小時(shí)，以穩(wěn)定支架結(jié)構(gòu)；蒸餾水反復(fù)沖洗后，再次冷凍干燥，制得孔徑50-200 μ m，孔隙率約為90%的膠原海綿支架。
[0039](2)將步驟⑴所得的膠原海綿支架置于10mg/ml的聚丙烯氯化銨溶液中，37°C恒溫下孵育4小時(shí)；蒸餾水反復(fù)沖洗后，冷凍干燥備用，制得經(jīng)聚陽離子表面處理后的膠原海綿支架；
[0040](3)室溫以正硅酸四乙酯為原料采用稀酸水解法制備濃度為3%的正硅酸；將所得正硅酸與72mM的氯化膽堿按照1:1的體積比均勻混合，并將終溶液pH值調(diào)至5.5 ；3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清制得36mM的氯化膽堿穩(wěn)定的1.5%的正硅酸前體溶液。
[0041](4)將步驟(2)所得的經(jīng)表面處理的膠原支架置于步驟(3)所得的穩(wěn)定硅酸前體溶液中進(jìn)行礦化處理，每天更換新鮮的硅酸前體溶液，孵育4天后，使用蒸餾水反復(fù)沖洗，制得纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料。
[0042](5)以Tris緩沖液為溶劑分別制備9mM CaCl2.2H20溶液及4.2mM K2HPO4溶液，將上述溶液等容混合，并加入聚陰離子穩(wěn)定劑如聚天冬氨酸(100 μ g/mL，從而制得聚天冬氨酸穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液(終濃度:4.5mMCaCl2.2H20/2.1mM K2HPO4)。
[0043](6)將步驟(4)所得的纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料置于步驟(5)所得的聚陰離子穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中，每天更換鈣化液，37°C條件下孵育4天，制得仿生鈣/硅雜化膠原支架，如圖1、圖2所示。所得材料使用PBS反復(fù)沖洗材料后冷凍干燥備用。所得仿生雜化膠原支架的礦物質(zhì)含量約為78.7%，如圖3所示，其機(jī)械性能優(yōu)于單純纖維內(nèi)硅化或纖維內(nèi)雜化的材料，如圖4所示。
[0044](7)使用25kGy的Y -射線對步驟(6)所得的纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料進(jìn)行滅菌。
[0045]對比例1:
[0046]該對比例提供的是關(guān)于纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料的制備方法:
[0047](I)膠原支架制備方法同實(shí)施例1步驟⑴。
[0048](2)將步驟⑴所得的膠原海綿支架置于10mg/ml的聚丙烯氯化銨溶液中，37°C恒溫下孵育4小時(shí)；蒸餾水反復(fù)沖洗后，冷凍干燥備用，制得經(jīng)聚陽離子表面處理后的膠原海綿支架。
[0049](3)室溫以正硅酸四乙酯為原料采用稀酸水解法制備濃度為3%的正硅酸；將所得正硅酸與72mM的氯化膽堿按照1:1的體積比均勻混合，并將終溶液pH值調(diào)至5.5 ；3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清制得36mM的氯化膽堿穩(wěn)定的1.5%的正硅酸前體溶液。
[0050](4)將步驟(2)所得的經(jīng)表面處理的膠原支架置于步驟(3)所得的穩(wěn)定硅酸前體溶液中進(jìn)行礦化處理，每天更換新鮮的硅酸前體溶液，孵育4天后，使用蒸餾水反復(fù)沖洗，制得纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架材料。
[0051]對比例2:
[0052]該對比例提供的是關(guān)于纖維內(nèi)仿生鈣化膠原支架材料的制備方法:
[0053](I)膠原支架制備方法同實(shí)施例1步驟(I)。
[0054](2)以0.1M Tris緩沖液為溶劑分別制備9mM CaCl2.2H20溶液及4.2mMK2HP04溶液，將上述溶液等容混合，并加入聚陰離子穩(wěn)定劑如聚天冬氨酸(100 μ g/mL)，從而制得聚陰離子穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液(終濃度:4.5mM CaCl2.2H20/2.1mM K2HPO4)；
[0055](3)將步驟(I)所得的膠原支架置于步驟(2)所得聚陰離子穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中，37°C條件下孵育14天后，使用蒸餾水反復(fù)沖洗后，冷凍干燥備用，制得具有分級結(jié)構(gòu)的纖維內(nèi)仿生鈣化膠原支架材料。
[0056]關(guān)于纖維內(nèi)雜化膠原支架對破骨細(xì)胞生成的抑制作用和纖維內(nèi)雜化膠原支架對骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)(試驗(yàn)對象選擇實(shí)施例1和對比例1、2制備的材料):
[0057](I)硅酸及鈣離子釋放譜試驗(yàn)
[0058]將10mg仿生雜化膠原支架置于15mL pH 7.3的Tris緩沖液中37°C孵育7天，每天使用硅鑰酸藍(lán)分光光度法檢測溶液中硅酸濃度，使用鈣離子電極檢測溶液中的鈣離子濃度。
[0059](2)生物活性試驗(yàn)
[0060]將仿生雜化膠原支架置于模擬體液中，37°C條件下孵育24小時(shí)后，樣品進(jìn)行樹脂包埋及透射電鏡(TEM)觀察所形成的纖維外磷酸鈣鹽情況。
[0061](3)生物相容性試驗(yàn)
[0062]采用MTT法檢測各種膠原支架及其浸提液對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞琥珀色脫氫酶活性的影響。分別制備直徑5_，厚度2_的未礦化膠原、仿生硅化膠原、仿生鈣化膠原及仿生雜化膠原支架，置于10% DMEM中孵育2天。支架材料直接接觸組中，直接在支架材料上接種100 μ I密度為5X 105/mL的細(xì)胞懸液；支架浸提液組中，使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將支架材料與細(xì)胞隔開，支架材料置于Transwell上室，等量細(xì)胞接種于下室。細(xì)胞與材料共培養(yǎng)72h，加入MTT琥珀酸鹽溶液培養(yǎng)60min后采用福爾馬林固定。使用二甲基亞砜將紫色的MTT結(jié)晶物充分溶解，并用酶標(biāo)儀測量562nm處的吸光度。
[0063](4)體外促成骨特性試驗(yàn)
[0064](4.1)堿性磷酸酶活性檢測:同上分別在未礦化膠原、仿生硅化膠原、仿生鈣化膠原及仿生雜化膠原支架上接種100 μ I密度為5 X 105/mL的細(xì)胞懸液，在普通培養(yǎng)基中共培養(yǎng)72h后，采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RAFMX-90021，上海晶曠生物科技有限公司)體外誘導(dǎo)成骨，分別于成骨誘導(dǎo)7及14天后使用ALP染色試劑盒(博士德公司，武漢)檢測堿性磷酸酶的活性；
[0065](4.2)茜素紅染色:細(xì)胞培養(yǎng)同上，于誘導(dǎo)成骨21天后，采用0.1 %茜素紅進(jìn)行染色，10%醋酸處理30分鐘后使用10%氨水中和，酶標(biāo)儀讀取上清液在405nm處的吸光度，根據(jù)已知鈣離子濃度的校正曲線來評估體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力。
[0066](4.3) RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因變化:細(xì)胞培養(yǎng)同上，于成骨誘導(dǎo)7天和14天后采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，Takara反轉(zhuǎn)錄體系(DRR036A)獲得cDNA，SYBR法(Takara，DRR820A)擴(kuò)增，ABI7500檢測待測基因拷貝數(shù)。成骨相關(guān)基因包括:堿性磷酸酶(ALP)、1型膠原(Type I Collagen)、、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣蛋白(OCN)、骨保護(hù)素(OPG)，核因子κΒ受體活化因子配體(RANKL)。
[0067](4.4)Western blot技術(shù)驗(yàn)證相關(guān)蛋白的變化:同上細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后,冰浴條件下用細(xì)胞裂解液消化細(xì)胞，離心取上清，蛋白定量；配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉3h，加一抗4°C孵育過夜,突光二抗孵育lh, Odyssey紅外成像系統(tǒng)觀察拍照；Image Pro Plus 6.0圖象分析軟件分析結(jié)果。檢測分子為OPG和RANKL。
[0068](5)體外抑制破骨特性試驗(yàn)
[0069]使用Transwell系統(tǒng)(96孔,0.4微米,康寧)將不同的支架材料(下層)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(上層)共培養(yǎng)7天。
[0070](5.1)酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色
[0071]將上述支架材料處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(上層)與IX 14的RAW 264.7細(xì)胞(下層)在Transwell中共培養(yǎng)7天，并在培養(yǎng)基中添加50ng/ml的RANKL (R&D Systems公司，Abdingdon，UK)。使用4 %甲醛固定下層細(xì)胞，并使用TRAP染色試劑盒(387-A，Sigma-Aldrich公司)對其進(jìn)行染色。400倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，進(jìn)行TRAP陽性多核細(xì)胞(三個(gè)或更多個(gè)核的每個(gè)細(xì)胞)計(jì)數(shù)(N = 6)。
[0072](5.2)骨吸收陷窩法
[0073]將RAW264.7細(xì)胞(2 X 13/孔)接種在I毫米厚的滅菌牙本質(zhì)片上，37°C下培養(yǎng)24小時(shí)后使用Transwell系統(tǒng)加入上述支架材料處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加50ng/ml的RANKL。14天后，超聲去除牙本質(zhì)表面細(xì)胞，用1%甲苯胺藍(lán)染色2分鐘，染色骨吸收陷窩顯示為藍(lán)色區(qū)域。400倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行拍照，使用Image J圖像分析軟件計(jì)算吸收陷窩的面積。
[0074](6)體外骨缺損修復(fù)能力檢測
[0075]選取4周齡SD大鼠，腹腔注射麻醉后，縱行切開頭皮達(dá)顱骨外膜，沿冠狀縫制備直徑為5mm的圓形標(biāo)準(zhǔn)顱骨缺損，將仿生雜化膠原支架植入缺損區(qū)，并進(jìn)行創(chuàng)口縫合。術(shù)后8周，I %戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，Micro-CT (德國Inveon，SIEMENS)觀察骨修復(fù)情況。
[0076]試驗(yàn)結(jié)果:
[0077]如圖5所示，纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料具有緩慢釋放活性硅及鈣離子的作用，從而為雜化膠原支架優(yōu)越的促成骨特性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0078]如圖6所不,纖維內(nèi)仿生娃I丐雜化膠原支架材料在模擬體液中浸泡24小時(shí)后表面形成大量羥基磷灰石沉積，顯示了良好的生物活性。
[0079]如圖7所示，相比于未礦化膠原、單純硅化膠原及單純鈣化膠原，纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料顯示了更優(yōu)的生物相容性。
[0080]如圖8和圖9所示，在體外實(shí)驗(yàn)中纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料能夠顯著促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、體外礦化結(jié)節(jié)形成及促成骨基因的表達(dá)，同時(shí)在早期(7天)，纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料能夠顯著促進(jìn)OPG的表達(dá)，而抑制RANKL的表達(dá)，而在后期其對OPG的促進(jìn)作用及RANKL的抑制作用則減弱。
[0081]如圖10所示，此外纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料處理后的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制破骨前體細(xì)胞的分化及破骨功能的表達(dá)。
[0082]如圖11所示，將纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)4天后，植入小鼠5-mm顱骨缺損內(nèi)，進(jìn)行骨缺損修復(fù)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)月內(nèi)即可修復(fù)骨缺損區(qū)。
[0083]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】僅限于此，對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單的推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定專利保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料抑制破骨細(xì)胞生成的應(yīng)用。
2.纖維內(nèi)仿生硅鈣雜化膠原支架材料作為骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/24GK104307041SQ201410488125
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】焦凱, 牛麗娜, 陳吉華, 鄭智明, 李齊宏 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)