一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，屬于天然藥物化學(xué)與化妝品的開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域。以漆樹木質(zhì)為原料、經(jīng)過提取、萃取、大孔樹脂純化和干燥得到漆樹多酚提取物。本發(fā)明制備的漆樹多酚提取物含量高、抑制作用明顯，漆樹多酚含量>50%，對酪氨酸酶活性的抑制率>60%，其原料天然、無毒，因此利用漆樹多酚開發(fā)天然酪氨酸酶抑制劑，用于美白化妝品、預(yù)防和治療由于人體黑色素過多導(dǎo)致的沉著性疾病，具有很好的商業(yè)前景。
【專利說明】一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，屬于天然 藥物、化妝品【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 漆樹（Rhus verniciflua stokes)，為漆樹科（Anacardiaceae)漆樹屬 ((Toxicodendron)的一種落葉喬木。漆樹是我國重要的特用經(jīng)濟林，生漆是天然樹脂涂 料，素有"涂料之王"的美譽。它還是一種優(yōu)良的藥用木材，漆樹的葉、花、根、皮、果實、干漆 和木心都可入藥，有止咳、消癖、通經(jīng)、殺蟲、消腫等功效。漆樹木質(zhì)部位的多酚化合物是繼 生漆漆酚、漆多糖后的主要活性物，大量的研究表明其具有優(yōu)良的抗氧化性、抗腫瘤、抑菌 和免疫調(diào)節(jié)等作用。
[0003] 據(jù)調(diào)研了解，我國化妝品市場以每年15%左右的速度增長，2011年已突破2000億 大關(guān)，我國目前是全球第三大化妝品市場。根據(jù)市場研究公司Euromonitor的數(shù)據(jù)顯示，在 我國的皮膚護理品市場中，美白產(chǎn)品占據(jù)了 71%的份額。目前市場上銷售的許多美白、祛斑 產(chǎn)品都是以抑制酪氨酸酶達到美白作用，從而促使了與酪氨酸酶抑制劑相關(guān)研究的蓬勃發(fā) 展。由于酪氨酸酶抑制劑在化妝品中的廣泛使用，研究可以長期使用、安全、有效的藥物將 成為人們要考慮的主要問題。世界各國植物資源豐富，天然資源因其藥效溫和、不良反應(yīng)小 而被廣泛認同，天然酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)將成為化妝品領(lǐng)域一個備受矚目的課題。
[0004] 酪氨酸酶（EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase)廣泛分布于微生物、動植物以及人體中。 酪氨酸酶具有獨特的雙重催化功能：催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴和氧化L-多巴 形成多巴醌，是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，與人的衰老、昆蟲的傷口愈合與發(fā)育、果蔬 的褐變等有密切關(guān)系。其活性異常過量表達可導(dǎo)致人體的色素沉著性疾?。ㄈ缛赴摺ⅫS褐 斑、老年斑等）。
[0005] 我國是漆樹的原產(chǎn)地，主要集中在陜西、四川、重慶、湖北、貴州、甘肅和云南七個 省，在鎮(zhèn)雄、大方、畢節(jié)、赫章、北川、恩施等60多個縣建立了漆樹產(chǎn)業(yè)化種植基地，種植面 積達100萬hm2,栽種漆樹達150, 000萬株。但是目前漆樹的產(chǎn)業(yè)主要集中在天然生漆涂 料的生產(chǎn)及開發(fā)，在漆籽的利用方面也比較薄弱，另外在漆樹生長、利用過程中，大量的枝 椏莖材未得到利用，為了擴大漆樹產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；?，延伸漆樹資源的產(chǎn)業(yè)鏈，因此開展漆樹多 酚的提取制備和生物活性研究，對于漆樹資源的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。已知的國內(nèi)外文 獻對漆樹多酚的的研究主要集中在抗腫瘤、抑菌和抗氧化等方法，對漆樹多酚抑制酪氨酸 酶活性的研究與開發(fā)尚屬空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明了一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方 法，其特征在于由以下步驟組成： (1)提取 將漆樹木材干燥、粉碎，去渣，按質(zhì)量體積比為l:5~l:30(g:mL)，加入質(zhì)量分數(shù)為 5(Γ95%的乙醇水溶液，常溫或加熱回流提取、或減壓回流提取、或超聲波輔助提取或微波輔 助提取2~3次，每次lOmirTlOh，過濾，濾液合并，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，再經(jīng)真空 干燥或冷凍干燥，得到粗提物； (2) 萃取 粗提物按質(zhì)量比1:5~1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取:Γ5次，分 離，在4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取:Γ5次， 分離，在4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯相； (3) 大孔樹脂純化 將乙酸乙酯相按質(zhì)量比1:5~1:10 (g:mL)加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩 溶解，加入大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶液進行洗脫，洗至無色，這部 分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，洗 脫劑用量為3-6倍住體積，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多 酚提取物； (4) 提取物多酚含量和化學(xué)成分分析 將漆樹多酚提取物進行化學(xué)成分分析，總多酚含量為5(Γ60%，經(jīng)HPLC分析，漆樹多酚 提取物的主要化學(xué)成分為漆黃素含量為〇. 4~0. 7%，黃顏木素含量為5~10%，硫黃菊素含量 為0. 5~1%和紫鉚花素含量為0. 2、. 5%，漆酚的含量<5PPm; (5) 提取物抑制酪氨酸酶活性 將漆樹多酚提取物進行抑制酪氨酸酶活性研究，當濃度范圍在40(T600ug/mL，抑制率 為6(Γ80%，其IC50值為308 μ g/mL。通過對抑制酪氨酸酶活性的機理研究，其抑制類型為 混合型。
[0007] (6)本專利采用常溫或加熱回流提取、或減壓回流提取、或超聲波輔助提取或微 波輔助提取進行提取，其中加熱回流提取的溫度為5(T90°C，減壓回流提取的真空度為 0. 04?0. IMPa，溫度4(T70°C，超聲輔助提取的功率為12(T600W，溫度為3(T60°C，微波輔助 提取的功率為50(T800W，溫度4(T70°C。按質(zhì)量體積比為1:51:30 (g:mL)，加入質(zhì)量分數(shù) 為5(Γ95%的乙醇水溶液，提取2?3次，每次lOmirTlOh，過濾，濾液合并，于4(T60°C下減壓 蒸發(fā)除去溶劑，再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到粗提物。
[0008] (7)本專利采用大孔樹脂進行漆樹多酚的純化，將乙酸乙酯相按質(zhì)量比 1: 5?1:10 (g:mL)加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩溶解，加入大孔吸附樹脂，乙 酸乙酯相與大孔吸附樹脂的質(zhì)量體積分數(shù)為1:2(Γ50,先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶 液進行洗脫，洗至無色，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60% 的乙醇水溶液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體積，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā) 除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。其中大孔樹脂選自LK001、122、聚酰胺、DM21、DM101、 AB-8、M1180N和D285中的一種或幾種。
[0009] (8)本專利采用HPLC分析漆樹多酚提取物中的主要化學(xué)成分，其色譜條件為：色 譜柱為1^ _18 611(1〇3口口6(1柱（4.6\25〇111111，5 4 111)，流動相為體積比為 35:65 的甲醇-〇.5% 醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長為280和360nm，流速為lmL/min。
[0010] (9)本專利所得到的漆樹多酚提取物對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，能夠用于 美白化妝品、預(yù)防和治療由于人體黑色素過多導(dǎo)致的沉著性疾病。
[0011] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明所提供的一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，還具有以 下特點： 本發(fā)明采用負壓、超聲和微波等提取方法，可以有效地防止多酚提取物的分解，大大地 提1?提取得率； 本發(fā)明采用逐步萃取方法，可以有效地除去漆酚化合物，具有低敏性特點； 本發(fā)明采用大孔樹脂純化，可以有效地提高漆樹多酚的含量(總多酚>50%); 本發(fā)明工藝操作簡單，易實施，產(chǎn)品色淺，純度高； 漆樹多酚提取物對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，能夠用于美白化妝品、預(yù)防和治療 由于人體黑色素過多導(dǎo)致的沉著性疾病。
[0012]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為漆樹多酚提取物的HPLC色譜圖； 圖2漆樹多酚提取物對酪氨酸酶的抑制作用； 圖3漆樹多酚提取物對酪氨酸酶催化L-酪氨酸形成多巴色素的抑制作用的紫外-可 見光譜圖； 圖4漆樹多酚提取物對酪氨酸酶催化單酚底物的抑制作用； 圖5漆樹多酚提取物對酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲線； 圖6漆樹多酚提取物與酪氨酸酶和二價銅的紫外-可見光譜圖。

【具體實施方式】
[0013] 以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。
[0014] 實施例1漆樹多酚的分析方法 精確稱取沒食子酸標準品20mg，加入蒸饋水溶解并定容到200mL，得到0. lmg/mL的標 準品標準溶液。分別移取〇、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8和lmL的0. lmg/mL的標準溶液至10mL的容 量瓶中，分別加入lmLFC試劑（0. 2mol/L)和2mL的15% Na2C03溶液，用蒸餾水定容至刻度， 25°C反應(yīng)2h。在760nm處測吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線，并擬合線性回歸方程。 回歸方程y=〇. 〇6895x+0. 0465,相關(guān)系數(shù)R=0. 99985。沒食子酸在2-10ug/mL濃度區(qū)間具有 良好的線性關(guān)系。
[0015] 實施例2HPLC分析 色譜柱以十八燒基化學(xué)鍵合固定相為填充劑，即RP_18 endcapped (250mmX4.6mm， 5 μ m);紫外檢測波長為280和360nm，室溫；流動相為體積比為65:35的甲醇-0. 5%醋酸水 溶液，流速為lmL/min，各標準品之間的分離度要求大于1. 5。分別稱取黃顏木素、漆黃素、 紫鉚花素和硫黃菊素標準品，精確至〇. OOOOlg，分別加入甲醇配成〇. 5mg/mL的溶液，再稀 釋成50 μ g/mL的標準溶液。各標準溶液吸取20 μ L，16 μ L，12 μ L，8 μ L和4 μ L，進樣，計 算峰面積，分別建立黃顏木素、漆黃素、紫鉚花素和硫黃菊素峰面積與樣品量（μ g)關(guān)系， 確定回歸方程，繪制相應(yīng)的標準曲線。漆黃素的回歸方程y=5E+06x+25177，相關(guān)系數(shù)R= 0. 9999,在0. 25-10 μ g有良好的線性范圍。黃顏木素的回歸方程y =3E+06x-76260,相關(guān)系 數(shù)R = 0.9999，在0.25-10μg有良好的線性范圍。紫鉚花素的回歸方程y=5E+06x+33948， 相關(guān)系數(shù)R = 0. 9999,在0. 25-10yg有良好的線性范圍。硫黃菊素的回歸方程y =6E+06x +39412,相關(guān)系數(shù)R = 0.9996，在0.25-10 μ g有良好的線性范圍。圖1為漆樹多酚提取 物的HPLC分析圖譜，280nm下主要峰為12min，為黃顏木素，360nm下主要峰為32min，36min 和38min，主要為漆黃素、硫黃菊素和紫鉚花素。
[0016] 實施例3 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入95%的乙醇溶液，常溫下浸提10h，提 取3次，過濾，濾液合并，在60°C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物 25g，測得多酚含量為35%，抑制率為30%。再將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:5 (g:mL)加入 蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取3次，分離，在40°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃 取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取5次，分離，在40°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙 酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比1:5~1:10 (g:mL)加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超 聲震蕩溶解，加入聚酰胺大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶液進行洗脫， 洗至無色，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%的乙醇水溶 液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體積，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干 燥，即得漆樹多酚提取物。測得多酚含量為60%，抑制率為80%。漆黃素含量為0. 7%，黃顏木 素含量為7%，硫黃菊素含量為0. 8%和紫鉚花素含量為0. 5%，漆酚的含量<5PPm。
[0017] 實施例4 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入60%的乙醇溶液，采用加熱回流浸提 3h，提取溫度5(T90°C，提取2次，過濾，濾液合并，在60°C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng) 過冷凍干燥得到粗提物29g，測得多酚含量為37%，抑制率為32%。再將漆樹多酚粗提物按 質(zhì)量比1:8 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取4次，分離，在40°C下減壓蒸發(fā) 除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取3次，分離，在60°C下減壓蒸發(fā)除 去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比l:5~l:10(g:mL)加入質(zhì)量分數(shù) 為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩溶解，加入AB-8大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的 乙醇水溶液進行洗脫，洗至無色，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù) 為3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體積，收集洗脫液，于4(T60°C下 減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測得多酚含量為58%，抑制率為76%。漆黃 素含量為〇. 4%，黃顏木素含量為6%，硫黃菊素含量為0. 6%和紫鉚花素含量為0. 3%，漆酚的 含量<5PPm。
[0018] 實施例5 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用超聲波輔助提 取l(T30min，超聲功率為12(T600W，溫度為3(T60°C，提取3次，過濾，濾液合并，在40°C下 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物28g，測得多酚含量為40%，抑制率 為40%。再將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃 取5次，分離，在40°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取4 次，分離，在60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比 1: 5?1:10 (g:mL)加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩溶解，加入LK001大孔吸附樹 月旨，先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶液進行洗脫，洗至無色，這部分收集液不用，以除去 極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體 積，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測得多酚含 量為50%，抑制率為60%。漆黃素含量為0. 4%，黃顏木素含量為5%，硫黃菊素含量為0. 5%和 紫鉚花素含量為〇. 2%，漆酚的含量<5PPm。
[0019] 實施例6 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入70%的乙醇溶液，采用微波輔助提 取2(T30min，超聲功率為50(T800W，溫度4(T70°C，提取3次，過濾，濾液合并，在50°C下減 壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物26g，測得多酚含量為38%，抑制率為 40%。再將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:7 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取 4次，分離，在50°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取4 次，分離，在60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比 1:5?1:10 (g:mL)加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩溶解，加入122大孔吸附樹 月旨，先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶液進行洗脫，洗至無色，這部分收集液不用，以除去 極性大的雜質(zhì)，再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體 積，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測得多酚含 量為54%，抑制率為70%。漆黃素含量為0. 5%，黃顏木素含量為8%，硫黃菊素含量為0. 6%和 紫鉚花素含量為〇. 3%，漆酚的含量<5PPm。
[0020] 實施例7 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用減壓回流提取 l~2h，真空度為0. 04、. IMPa，溫度4(T70°C，提取3次，過濾，濾液合并，在60°C下減壓旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物30g，測得多酚含量為40%，抑制率為40%。再 將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:7 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取4次，分 離，在50°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取4次，分離， 在60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相再將漆樹多酚粗提 物按質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入DM101大孔吸附樹脂，先用(Γ20%的 乙醇水溶液進行洗脫，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用3(Γ60%的乙醇水溶 液進行洗脫，收集洗脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測 得漆樹多酚的含量為56%，抑制率為78%。漆黃素含量為0. 6%，黃顏木素含量為10%，硫黃菊 素含量為1%和紫鉚花素含量為〇. 5%，漆酚的含量<5PPm。
[0021] 實施例8 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用減壓回流提取 1?2h，真空度為0. 04、. IMPa，溫度4(T70°C，提取3次，過濾，濾液合并，在60°C下減壓旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物30g，測得多酚含量為40%，抑制率為40%。 再將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取5次， 分離，在40°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取4次，分 離，在60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入Ml 180N大孔吸附樹脂，先用(Γ20%的乙醇水溶液進行洗 脫，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，收集洗 脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測得漆樹多酚的含量 為58%，抑制率為80%。漆黃素含量為0. 65%，黃顏木素含量為8%，硫黃菊素含量為0. 9%和 紫鉚花素含量為0. 45%，漆酚的含量<5PPm。
[0022] 實施例9 將500g漆樹木為原料，經(jīng)干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用減壓回流提取 1?2h，真空度為0. 04、. IMPa，溫度4(T70°C，提取3次，過濾，濾液合并，在60°C下減壓旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，水相經(jīng)過冷凍干燥得到粗提物30g，測得多酚含量為40%，抑制率為40%。 再將漆樹多酚粗提物按質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取5次， 分離，在40°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取4次，分 離，在60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取相。將乙酸乙酯相按質(zhì)量比1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入D285大孔吸附樹脂，先用(Γ20%的乙醇水溶液進行洗 脫，這部分收集液不用，以除去極性大的雜質(zhì)，再用3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，收集洗 脫液，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥，即得漆樹多酚提取物。測得漆樹多酚的含量 為56%，抑制率為74%。漆黃素含量為0. 5%，黃顏木素含量為7%，硫黃菊素含量為0. 85%和 紫鉚花素含量為〇. 34%，漆酚的含量<5PPm。
[0023] 實施例10漆樹多酚提取物抑制酪氨酸酶活性研究 (1)蘑菇酪氨酸酶溶液精密稱取5mg蘑菇酪氨酸酶，加入適量4 °C的磷酸鹽緩沖液 溶解、定容，配制成濃度為0.5 mg. mL-1的蘑菇酪氨酸酶溶液，4°C保存。
[0024] (2)L_酪氨酸溶液精密稱取0. 0181g L-酪氨酸，加入適量pH6. 8磷酸鹽緩沖液， 超聲至完全溶解、定容，配制成濃度為1 mm〇l.L-l的L-酪氨酸溶液，4 °C保存。
[0025] 將漆樹多酚提取物配制成濃度為5、10、50、100、200、300、400、500和600 μ g/mL進 行測定。結(jié)果如圖2所示，從圖可以看出，漆樹多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用對濃 度呈現(xiàn)依賴性，隨著濃度的增大，其抑制率增加，對漆樹多酚提取物的濃度與酪氨酸酶抑制 率的變化規(guī)律進行線性擬合，可以得到擬合方程為： Y = 0. 001X + 0. 192 (1) 式中：Y=漆樹多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制率，％ ; x=漆樹多酚提取物的質(zhì)量濃度，μ g/mL。
[0026] 該擬合方程（1)的相關(guān)系數(shù)R2為0.995，說明，這組數(shù)據(jù)的線性擬合是有效的。 根據(jù)方程可以計算漆樹多酚提取物的IC50為308 μ g/mL。Vc的IC50為130 μ g/mL。
[0027] 實施例11漆樹多酚提取物對多巴色素形成的抑制作用 將漆樹多酚提取物與L-酪氨酸、酪氨酸酶混合，在酶標儀中記錄12min內(nèi)250-600nm 波長范圍光譜吸收的變化，如圖3所示，320nm處為多巴醌，492nm處為多巴色素，從圖中可 以看出，隨著時間的延長，多巴色素的不斷升成，含量變大，但是在漆樹多酚提取物存在的 情況下，雖然多巴色素有在生成，但生成緩慢，說明漆樹多酚提取物對多巴色素的形成具有 一定的抑制作用。
[0028] 酪氨酸酶催化單酚底物具有遲滯效應(yīng)，主要是由于酪氨酸酶對單酚底物羥基化 時，由于酪氨酸酶的自身特點使該過程受到較大的空間位阻。為了考察漆樹多酚提取物對 遲滯時間的影響，L-酪氨酸的濃度為lmmol/L，測定不同質(zhì)量濃度的提取物物對酪氨酸酶 單酚酶抑制作用的進程曲線，如圖4所示。當增大漆樹多酚提取物在反應(yīng)體系中的濃度時， 在相同反應(yīng)時間內(nèi)，反應(yīng)體系中的產(chǎn)物生成量降低，當漆樹多酚提取物質(zhì)量濃度為500ug/ mL時，在30min內(nèi)，多巴色素的吸光度增加不明顯，說明漆樹多酚提取物對酪氨酸酶具有一 定的抑制作用。
[0029] 實施例12漆樹多酚提取物對二酚催化活性抑制的類型 在反應(yīng)體系中，固定酶的濃度，通過改變底物L(fēng)-多巴的濃度，測定不同濃度樣品對反 應(yīng)體系的影響。采用Lineweaver-Burk即雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為X軸， 反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V為y軸作圖，雙倒數(shù)曲線如圖5所示，其線性擬合方程如表2所示，從 圖表可以看出隨著提取物濃度增大，Κ π值增大而反應(yīng)初速度Vn值隨之下降，雙倒數(shù)曲線交 于第二象限，其抑制類型表現(xiàn)為混合型抑制。再以各直線的斜率和截距分別對濃度進行二 次作圖，由橫軸截距可求出復(fù)合物[ΕΙ]和[ESI]的解離常數(shù)，計算結(jié)果分別為75. 94 和137. 29 μ g/mL。從數(shù)據(jù)可知K'L可知，[ESI]的穩(wěn)定性較[ΕΙ]差，因此，在體系中漆樹 多酚提取物更容易與游離酶結(jié)合，從而影響了酶對底物的催化。
[0030] 表2漆樹乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的Lineweaver-Burk 方程

【權(quán)利要求】
1. 一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，其特征在于由以下步驟 組成： 第一步 將漆樹木材干燥、粉碎，去渣，按質(zhì)量體積比為l:5~l:30(g:mL)，加入質(zhì)量分數(shù)為 5(Γ95%的乙醇水溶液，常溫或加熱回流提取、或減壓回流提取、或超聲波輔助提取或微波輔 助提取2~3次，每次lOmirTlOh，過濾，濾液合并，于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，再經(jīng)真空 干燥或冷凍干燥，得到粗提物； 第二步 粗提物按質(zhì)量比1:5~1:10 (g:mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取:Γ5次，分 離，在4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取:Γ5次， 分離，在4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯相； 第三步 將乙酸乙酯萃取物按質(zhì)量比1:5~1:10加入質(zhì)量分數(shù)為10%的乙醇水溶液，超聲震蕩 溶解，用大孔吸附樹脂柱吸附分離，乙酸乙酯萃取物與大孔吸附樹脂質(zhì)量體積比（g:mL)為 1:2(Γ50 ;先用質(zhì)量分數(shù)為ΚΓ20%的乙醇水溶液進行洗脫，洗至無色，除去極性大的雜質(zhì)， 再用質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%的乙醇水溶液進行洗脫，洗脫劑用量為3-6倍住體積，收集洗脫液， 于4(T60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥，即得漆樹多酚提取物； 第四步 將漆樹多酚提取物進行HPLC分析，總多酚含量為5(Γ60%，其中漆黃素含量為 0. 4、. 7%，黃顏木素含量為5~10%，硫黃菊素含量為0. 5~1%和紫鉚花素含量為0. 2~0. 5%，漆 酚的含量<5PPm; 第五步 將漆樹多酚提取物進行抑制酪氨酸酶活性研究，當濃度范圍在40(T600ug/mL，抑制率 為6(Γ80%，其IC50值為308 μ g/mL ;通過對抑制酪氨酸酶活性的機理研究，其抑制類型為混 合型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求所述一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，其特 征在于第一步中加熱回流提取的溫度為5(T90°C，減壓回流提取的真空度為0. 04~0. IMPa， 溫度4(T70°C，超聲輔助提取的功率為12(T600W，溫度為3(T60°C，微波輔助提取的功率為 50(T800W，溫度 4(T70°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，其 特征在于第二步中石油醚萃取的目的為除去漆樹漆酚化合物，漆酚的含量<5PPm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，其 特征在于第三步中的大孔吸附樹脂選自1^001、122、聚酰胺、011101、48-8、]\1118(^和0285中 的一種或幾種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方 法，其特征在于第四步中的HPLC分析，其色譜條件為：色譜柱為RP-18 endcapped柱 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，流動相為體積比為35:65的甲醇-0. 5%醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測 波長為280和360nm,流速為lmL/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種有抑制酪氨酸酶活性的漆樹多酚提取物及其制備方法，其 特征在于漆樹多酚提取物對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，能夠用于美白化妝品、預(yù)防和 治療由于人體黑色素過多導(dǎo)致的沉著性疾病。
【文檔編號】A61P17/00GK104147064SQ201410402087
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】王成章, 陳虹霞, 葉建中 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所