多功能融合多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多功能融合多肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物工程制藥領(lǐng)域。該多功能融合多肽為六種多肽中一種或其任意多種組合，可用于實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及新生血管性眼病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的多肽是通過人工合成方法制備，其特征在于通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，抑制血管新生，繼而治療與血管新生相關(guān)的疾病，包括實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及新生血管性眼病等。
【專利說明】多功能融合多肽及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及一類多功能融合多肽及其制備方法和在制備治療 實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及新生血管性眼病藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 血管新生（angiogenesis)，指在原始血管叢或已存在血管的基礎(chǔ)上以發(fā)芽方式 形成新生血管的過程，從傷口治愈、胎盤形成以至胚胎發(fā)育等，血管新生在當(dāng)中扮演著重要 的角色。但與此同時(shí)，血管生成在多種病理?xiàng)l件下也會(huì)發(fā)生，所述病理?xiàng)l件包括：腫瘤生長(zhǎng) 和轉(zhuǎn)移；炎性障礙，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、克隆病、潰瘍性結(jié) 腸類以及其它炎性障礙；眼部新血管生成，如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、局部缺血性視網(wǎng)膜病變、 視網(wǎng)膜靜脈或動(dòng)脈閉塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD)、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植以及多種其它眼病中的新血管生 成。
[0003] 惡性腫瘤是人類健康的首要?dú)⑹郑瑹o限生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性標(biāo)志，也是 導(dǎo)致治療失敗和死亡的主要原因。因此，控制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移是改善預(yù)后、提高生 存率的主要措施。1971年Folkman首先提出腫瘤生長(zhǎng)依賴血管新生的理論，腫瘤血管生成 是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，它不僅向腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，也向宿主輸出大量的腫 瘤細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。絕大多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤如卵巢癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等 都是血管依賴性腫瘤，因此，抑制腫瘤血管形成是重要的抗癌措施。
[0004] 關(guān)節(jié)炎是危害人體健康的最常見疾病之一，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，國(guó)內(nèi)外很多 研究者都在探討其病因，尋找有效的預(yù)防和治療方法以改變其預(yù)后不良的狀況。類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA)是一種病因至今尚未肯定的慢性進(jìn)行性的關(guān)節(jié)炎，通常 認(rèn)為它是一種自身免疫性疾患，是機(jī)體防御系統(tǒng)自相殘殺所造成的結(jié)果，另外遺傳、感染、 寒冷潮濕等均可能是致病的因素。RA的病理過程中，血管新生是一種標(biāo)志性的組織學(xué)改變， 新生血管形成伴隨滑膜增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，是RA中血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。因此， 抑制新生血管的形成是治療這類疾病的關(guān)鍵，通過抑制血管生成不僅可阻止向滑膜輸送氧 氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且可直接導(dǎo)致血管退化，從而抑制RA滑膜增生。
[0005] 眼部新生血管主要包括虹膜新生血管（NVI)、脈絡(luò)膜新生血管（CNV)和視網(wǎng)膜新 生血管等，許多眼部病變與新生血管的發(fā)生有著密切的關(guān)系，常見新生血管性眼病主要包 括新生血管性角膜疾病、新生血管性視網(wǎng)膜疾病、新生血管性脈絡(luò)膜疾病、新生血管性青光 眼等幾大類。這些新生血管性病變多與眼組織的缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)有關(guān)，由于新生血管 不具備血管的正常生理結(jié)構(gòu)，通透性高，容易破裂使血液流入玻璃體腔內(nèi)，致使眼底出血， 使患者視力模糊或者完全失去視覺，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，抑制血管新生是治療上 述血管新生性眼病的重要途徑。
[0006] 內(nèi)皮抑素（ES或Endostatin)，是大分子膠原蛋白XVIII的羧基末端非膠原區(qū)片 段，由183個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為20kD。內(nèi)皮抑素是通過抑制腫瘤新生血管 形成從而阻斷其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的血管生成抑制因子，由于它能特異地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)正常 組織內(nèi)的血管不會(huì)造成明顯的影響，因此具有無毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)。動(dòng)物體內(nèi) 試驗(yàn)表明內(nèi)皮抑素具有一定的抗腫瘤效果，但在臨床試驗(yàn)中其抗腫瘤效果并不顯著，最終 被FDA駁回。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)皮抑素的第6-49個(gè)氨基酸和第134-178個(gè)氨基酸均能夠抑 制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，且活性甚至高于內(nèi)皮抑素本身。因此將內(nèi)皮抑素截短， 選取其中的活性片段進(jìn)行研究，不僅利于研究整個(gè)大分子的機(jī)理，同時(shí)能降低開發(fā)成本，為 該類多肽的開發(fā)提供參考。
[0007] 整合素是一類識(shí)別多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體家族，廣泛分布于細(xì)胞表面，能介 導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互黏附，并能通過連接胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白和 細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用參與血管生成。該類受體由α和β兩條鏈組成，目前已發(fā)現(xiàn) 15種α鏈和9種β鏈，不同的α鏈和β鏈的組合決定配體的特異性，整合素 α?β?、 α2β1、α3β1、α6β1、α6β4、α5β1、ανβ3、ανβ5參與血管生成和細(xì)胞遷移，其中 α ν β 3可影響癌變中的幾個(gè)關(guān)鍵過程。α ν β 3可以表達(dá)于多種細(xì)胞類型，能識(shí)別配體分子 中的精-甘-天冬序列（Arg-Gly-Asp，RGD)，并參與腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥、傷 口愈合和凝血等生理和病理過程。因此，R⑶序列可以作為一種載體，靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤血管 新生部位，從而對(duì)新生血管性疾病達(dá)到更高效率的治療。
[0008] 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP)家族是一類結(jié)構(gòu)相似和功能 相關(guān)的蛋白內(nèi)切酶，MMPs在生理狀態(tài)下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合，在病 理狀態(tài)下參與組織重構(gòu)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化（AS)和急性冠脈綜 合征（ACS)的病理進(jìn)程。它們不僅能切割各種細(xì)胞外基質(zhì)，為炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 打開"通路";可以切割細(xì)胞因子或趨化因子，影響炎癥細(xì)胞的募集；還可以切割各種膜連接 分子，包括受體和細(xì)胞間連接分子，從而調(diào)節(jié)這些分子的功能。
[0009] 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶的 典型代表，研究發(fā)現(xiàn)MMP-9可以在幾個(gè)方面促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)：首先，MMP-9是腫瘤部位血管增 生的"開關(guān)"，它可以切割細(xì)胞外基質(zhì)，釋放連接于基質(zhì)上的VEGF，促進(jìn)血管增生，血管增生 是腫瘤生長(zhǎng)的前提條件；MMP-9還可以通過從細(xì)胞外基質(zhì)釋放VEGF的方式促進(jìn)淋巴管增 生，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；其次，腫瘤細(xì)胞以及進(jìn)入腫瘤組織的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表面都表達(dá)有 TNF-α前體，幾種金屬蛋白酶（包括MMP-9)可以切割并釋放有活性的TNF-α，促進(jìn)血管增 生和抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外，腫瘤部位的炎癥細(xì)胞表達(dá)的MMP-9可以通過兩個(gè)方面激 活TGF- β途徑，一是把TGF- β前體切割成有活性的TGF- β，二是切割TGF- β連接蛋白， 把TGF-β從細(xì)胞外基質(zhì)上釋放出來，活化的TGF-β抑制免疫系統(tǒng)，卻不抑制腫瘤本身的生 長(zhǎng)，從而間接的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
[0010] ΜΜΡ抑制劑不但可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還具有靶向功能，不但可早期檢測(cè)到腫 瘤組織，還可以把目的物帶到腫瘤部位。ΜΜΡ-9多肽抑制劑的優(yōu)勢(shì)在于，其序列可以連接 到其它有抗腫瘤活性的多肽或蛋白質(zhì)上，新的分子不但可以抑制ΜΜΡ-9活力，還可以通過 ΜΜΡ-9多肽抑制劑部分把有抗腫瘤活性的成分富集于腫瘤部位，提高其抗腫瘤效果。
[0011] 多功能融合多肽是近年在治療新生血管性疾病中引起極大重視的一類藥物， 針對(duì)腫瘤血管形成分子機(jī)制所設(shè)計(jì)的抗血管生成類藥物主要包括內(nèi)源性多功能融合多 肽、VEGF通路抑制劑、C0X-2抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等。在這些多功能融合多 肽中，尤其以血管抑素和內(nèi)皮抑素最引人注目，但其缺陷也非常明顯：作用靶點(diǎn)不明確， 對(duì)血管的專一性和選擇性不強(qiáng)，治療效果有限，導(dǎo)致用藥量較大，產(chǎn)生不同程度的耐藥 性。因此，一個(gè)好的抗血管生成藥物應(yīng)該對(duì)新生血管的標(biāo)記分子具有選擇性，以達(dá)到對(duì)新 生血管的靶向性作用，從整體上提高藥物對(duì)血管生成的抑制效果。CN102746380所報(bào)道 Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3- (3-批陡基）-L-丙氨酸，Bip 為 L-4, 4' -聯(lián) 苯丙氨酸）多肽片段具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶_9和腫瘤壞死因子釋放 酶的活力，因此該多肽具有抗腫瘤的作用。但并未有進(jìn)一步的文獻(xiàn)公開在其他領(lǐng)域的效果 和應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 1、發(fā)明目的
[0013] 針對(duì)現(xiàn)有的多功能融合多肽作用靶點(diǎn)不明確，對(duì)血管的專一性和選擇性不強(qiáng)等問 題，本發(fā)明提供了一種多功能融合多肽及其制備方法和應(yīng)用，其對(duì)多種實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎以及新生血管性眼部疾病有很好的預(yù)防和治療效果，增加其適應(yīng)癥范圍。
[0014] 2、技術(shù)方案
[0015] 多功能融合多肽，其結(jié)構(gòu)為下述的一種：
[0016] 多膚 I :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr〇-(D_Pyr)-(D_Cys)_Bi p-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp (其中 Pyr 為 3-(3-批陡基）_L_ 丙氨酸， Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸）；
[0017] 多膚 II :Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala_Gly-Gly-G ly-Gly-Pr〇- (D_Pyr) - (D_Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3- (3-批陡基）-L-丙氨酸， Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸）；
[0018] 多膚III :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr〇- (D_Pyr) - (D_Cys) _Bi p-Arg-Gly-Glu (其中Pyr為3-(3-吡啶基）-L-丙氨酸，Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸）；
[0019] 多膚IV :Pr〇- (D_Pyr) - (D_Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Al a-Asp-Arg-Ala (其中Pyr為3-(3-批陡基）-L-丙氨酸，Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸）；
[0020] 多膚 V :Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala_Asp-Arg-Ala ;
[0021] 多膚VI :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala_Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。
[0022] 上述多功能融合多肽中的任意兩種或兩種以上的組合。
[0023] 上述多功能融合多肽多肽在制備治療實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及新生血管性 眼病藥物中的應(yīng)用。
[0024] 所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、 腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱或睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色 素瘤、血管瘤以及肉瘤。
[0025] 所述的多功能融合多肽在制備治療在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的 應(yīng)用。
[0026] 所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脈絡(luò)膜新生血管性眼病、視網(wǎng)膜 新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
[0027] 所述的多功能融合多肽的制備方法，以Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin為起 始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至二十四肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、 后處理即得多功能融合多肽粗品。將粗品溶解，用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，濃縮凍干 得到純品，最后經(jīng)過第三次純化得到多肽。
[0028] 3、有益效果
[0029] 本發(fā)明公開的多肽具有抑制新生血管生成和抑制包括MMP9在內(nèi)的幾種基質(zhì)金屬 蛋白酶活力兩種作用，在多肽I、II、V和VI中加入RGD序列（Arg-Gly-Asp)，使該多肽序列 對(duì)整合素具有靶向結(jié)合作用和親和性，并通過抑制胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分子的 相互作用，來抑制細(xì)胞與細(xì)胞外介質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制血管生成。前期 研究發(fā)現(xiàn)多肽能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，并發(fā)現(xiàn)其能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；進(jìn)一 步研究證實(shí)其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，此外對(duì)眼科疾病也就有很好的治療效 果。說明本發(fā)明涉及的多肽設(shè)計(jì)科學(xué)合理，可行有效，能作為治療或預(yù)防血管及炎癥相關(guān)疾 病，并極大地拓展了該多肽的治療譜，為將來藥物開發(fā)提供新的思路和前景。
[0030] 多肽I -VI是新的氨基酸序列，本申請(qǐng)?jiān)谇叭说幕A(chǔ)上構(gòu)建新的多肽序列，新序 列拓展了原來多肽的應(yīng)用范圍，將其應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和新生血管性眼病領(lǐng)域。
[0031] 研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的多肽序列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala具有抑制血管生成的 作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)序列是整合素的一個(gè)重要配體，含有RGD序列的多 肽X-Arg-Gly-Asp(X可以是1個(gè)或多個(gè)非極性氨基酸）能夠特異性的識(shí)別整合素。本發(fā)明 的多功能融合多肽多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala的C 端或N端連接上與整合素家族具有特異結(jié)合能力的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)序列 和（或）基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多肽序列Pr〇-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(為增加整個(gè)分 子的柔性在多肽I -VI中加入4個(gè)Gly為linker)，構(gòu)建出了一系列具有靶向性的抑制新生 血管生成的多肽，且保證所獲得序列的不同功能片段相互不受影響，各自發(fā)揮作用。
[0032] 經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)獲知該類多功能融合多肽在體外能夠明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)的增殖、遷移，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、 人乳腺癌MDA-MB-231等腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。
[0033] 本發(fā)明的多肽I -VI可以靶向到RA中血管翳形成過程中的新生血管內(nèi)皮，抑制新 生血管形成，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果。發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)獲知多肽 I -VI能夠抑制佐劑型大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和DBA/1小鼠膠原型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具有顯著的治療類風(fēng)濕型關(guān)節(jié)炎的效果，并且副作用少，用量小成本降低。
[0034] 經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)獲知該類多功能融合多肽多肽均能夠抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HRCEC)的增殖，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。通過多功能融合多肽多肽對(duì)小鼠角膜新生 血管和兔虹膜新生血管的作用，表明多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV、多肽V和多肽VI六種 多功能融合多肽均能夠抑制角膜和虹膜新生血管的生長(zhǎng)，有潛力開發(fā)為治療角膜新生血管 性眼病和虹膜新生血管性眼病的藥物，具有潛在的治療新生血管性疾病的作用。
[0035] 脈絡(luò)膜位于眼球后部，實(shí)驗(yàn)證明多功能融合多肽多肽能夠改善脈絡(luò)膜血流，說明 用藥后，通過全身循環(huán)或鞏膜-葡萄膜-視神經(jīng)途徑，能盡快到達(dá)脈絡(luò)膜，對(duì)年齡相關(guān)性黃 斑變性（AMD)的脈絡(luò)膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD以及其它脈絡(luò)膜新生 血管性疾病的預(yù)防或治療。同時(shí)通過多功能融合多肽多肽對(duì)大鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用， 表明六種多功能融合多肽多肽能夠抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管的生成，說明六種多功能融合 多肽對(duì)包括年齡相關(guān)性黃斑變性在內(nèi)的脈絡(luò)膜新生血管性眼病具有一定的治療作用。
[0036] 對(duì)0IR小鼠模型施用多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV、多肽V和多肽VI后，六種多 肽均能夠改善視網(wǎng)膜病理性新生血管的形成，減少視網(wǎng)膜中新生血管叢。說明本發(fā)明的多 功能融合多肽能夠抑制小鼠眼部視網(wǎng)膜的新生血管形成，在一定程度上能夠預(yù)防或治療視 網(wǎng)膜新生血管性眼病。
[0037] 本申請(qǐng)多肽I - VI科學(xué)合理、可行有效，能作為制備治療人類實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎以及新生血管性眼病的治療藥物，極大拓展了該多功能融合多肽的治療譜，為將來 藥物開發(fā)提供新的思路和前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 附圖1多功能融合多肽多肽I對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0039] 附圖2多功能融合多肽多肽II對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0040] 附圖3多功能融合多肽多肽III對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0041] 附圖4多功能融合多肽多肽IV對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0042] 附圖5多功能融合多肽多肽V對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0043] 附圖6多功能融合多肽多肽VI對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCEC)的增殖抑制作 用；
[0044] 附圖7多功能融合多肽多肽對(duì)BALB/c小鼠角膜新生血管的作用；
[0045] 附圖8多功能融合多肽多肽對(duì)大鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用；
[0046] 附圖9多功能融合多肽多肽在0IR小鼠中對(duì)視網(wǎng)膜血管的作用；
[0047] 附圖10多功能融合多肽多肽I對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)的遷移抑制作用；
[0048] 附圖11多功能融合多肽多肽II對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)遷移抑制作用；
[0049] 附圖12多功能融合多肽多肽III對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)遷移抑制作用；
[0050] 附圖13多功能融合多肽多肽IV對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)遷移抑制作用；
[0051] 附圖14多功能融合多肽多肽V對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)遷移抑制作用；
[0052] 附圖15多功能融合多肽多肽VI對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)遷移抑制作用；
[0053] 附圖16多功能融合多肽多肽對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用；
[0054] 附圖17多功能融合多肽多肽對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用；
[0055] 附圖18多功能融合多肽多肽對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖抑制作用；
[0056] 附圖19多功能融合多肽多肽對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 實(shí)施例1多功能融合多肽多肽的制備及檢驗(yàn)
[0058] 多肽采用固相合成法合成，采用制備型HPLC進(jìn)行分離純化，分析型RP-HPLC測(cè)定 多肽的純度。
[0059] 多肽I - VI固相合成法是以Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin (吉爾生化有限 公司）為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至二十四肽，接肽工作完成后充分洗滌， 然后切肽、后處理即得多功能融合多肽粗品。將粗品溶解，用制備型高效液相經(jīng)過兩次純 化，濃縮凍干得到純品，最后經(jīng)過第三次純化得到多肽精制品。該方法不僅能保證合成的效 率，還可提高產(chǎn)物純度。
[0060] 1.接肽（包括接二肽至二十四/十七/十三肽）的步驟如下：
[0061] 稱取Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin適量，倒入玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入 CH2C12適量使樹脂充分膨脹。
[0062] a.脫帽：加入六氫吡啶/DMF的脫帽液適量，反應(yīng)一段時(shí)間后將脫帽液抽干，中間 用DMF洗滌一次，然后再加入一次脫帽液適量反應(yīng)，脫去Fmoc保護(hù)基。
[0063] b.洗滌：將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂幾次，充分洗凈副產(chǎn)物。
[0064] c.縮合：將用于接肽的保護(hù)氨基酸和激活劑溶于DMF和縮合劑中，搖勻，溫度控制 在34°C左右，在反應(yīng)釜中充分反應(yīng)。
[0065] d.洗滌：將反應(yīng)液抽干，用DMF充分洗滌樹脂，洗凈副產(chǎn)物。
[0066] 所述切肽的步驟如下：
[0067] 將抽干的樹脂裝入圓底燒瓶中，加入裂解液充分裂解合好的二十四肽中間體，用 砂芯漏斗將樹脂與多肽分離，所述的裂解液的體積組成為：三氟乙酸：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT = 90 :3 :3 :2 :2。
[0068] 2.后處理步驟如下：先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒 掉，然后再用無水乙醚洗滌多肽，抽干得多肽粗品。
[0069] 3.純化的步驟如下：
[0070] a.溶解：稱取粗品配制成5-20g/L的溶液，用0. 45 μ m的混合濾膜過濾。
[0071] 制備：通過半制備型高效液相色譜進(jìn)行一次純化、二次純化和三次純化得到多肽 精制合格品，流動(dòng)相：A相乙腈，B相0. 1 % TFA水溶液。
[0072] ①一次純化：用30% -40%的乙腈和60% -70%的緩沖溶液，流速為50mL/ min-100mL/min，沖洗10min平衡制備柱。溶解過濾后的粗品用輸液泵上樣。
[0073] 表1 一次純化洗脫梯度
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 多功能融合多肽，其特征在于結(jié)構(gòu)為下列中的一種： 多膚 I :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr〇-(D_Pyr)-(D_Cys)-Bip-Ar 區(qū)-617-6111--617-617-617-617-六找-617-六8口，其中？71'為3-(3-批陡基）-1^-丙氨酸，81口為 L-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸； 多膚 II :Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala_Gly-Gly-Gly-Gl y-Pr〇- (D-Pyr) - (D_Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu，其中 Pyr 為 3- (3-批陡基）-L-丙氨酸，Bip 為 L-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸； 多膚III :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pr〇- (D_Pyr) - (D_Cys) -Bip-Ar g-Gly-Glu，其中Pyr為3-(3-吡啶基）-L-丙氨酸，Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸； 多膚IV :Pr〇- (D_Pyr) - (D_Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-As p-Arg-Ala，其中Pyr為3-(3-批陡基）-L-丙氨酸，Bip為L(zhǎng)-4, 4' -聯(lián)苯丙氨酸； 多膚 V :Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala_Asp-Arg-Ala ; 多膚VI :Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala_Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能融合多肽，其特征在于為多肽中的其中任意兩種或兩 種以上的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能融合多肽在制備治療實(shí)體腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及 新生血管性眼病藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的多功能融合多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在 于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、 膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱或睪丸的原發(fā)或繼發(fā)癌、黑色素瘤、血 管瘤以及肉瘤。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的多功能融合多肽在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物 中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的多功能融合多肽在制備治療新生血管性眼病藥物中的應(yīng) 用，其特征在于所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脈絡(luò)膜新生血管性眼病、視 網(wǎng)膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的多功能融合多肽的制備方法，其特征在于以 Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至二十四 肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得多功能融合多肽粗品，將粗品溶解，用 制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，濃縮凍干得到純品，最后經(jīng)過第三次純化得到多肽。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104045718SQ201410324568
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】康夢(mèng)實(shí), 李夢(mèng)瑋 申請(qǐng)人:南京安吉生物科技有限公司