一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應用反應器全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原的方法，本發(fā)明使用生物反應器全懸浮無血清培養(yǎng)生產(chǎn)PCV2抗原，制備滅活疫苗。該發(fā)明方法可以大量降低生產(chǎn)成本，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低90％以上，投入產(chǎn)出比提高4～10倍，較傳統(tǒng)反應器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低50％～70％，產(chǎn)量提高3～5倍，此發(fā)明無需載體，無血清殘留，生產(chǎn)的疫苗安全性更高，同時制品的批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高制品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
【專利說明】一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應用生物反應器全懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原的方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，國內(nèi)豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)的疫苗抗原生產(chǎn)主要采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，少數(shù)采用微載體懸浮培養(yǎng)方法。轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)半成品抗原效價較低，僅為14 5~6_°TCID5(l/ml，不能穩(wěn)定提供合格的抗原(合格抗原每毫升抗原含量應≥15-5TCID50)，需要進行高倍濃縮。且轉(zhuǎn)瓶工藝勞動強度大，生產(chǎn)一批需要100~200個大轉(zhuǎn)瓶，需多人同時進行長時間的消化傳代操作，增加污染風險；生產(chǎn)周期長，需要10天；效率較低，只能收獲一次；因培養(yǎng)基中含有一定濃度的血清，其制備的抗原中雜蛋白比較多，易造成免疫動物的應激反應；生產(chǎn)成本較高，人工、場地及原料費用大；對環(huán)境要求較高，需要較大的場地和符合GMP要求的高級別的凈化廠房；不同生產(chǎn)批次及同一生產(chǎn)批次的轉(zhuǎn)瓶之間生產(chǎn)的抗原效價存在較大差異，容易造成批內(nèi)及批間的抗原質(zhì)量差異，進而影響疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)瓶清洗需要大量水，并且產(chǎn)生的含毒廢水需要專門處理，容易對環(huán)境造成污染，如處理不當會造成生物安全和公共衛(wèi)生問題。
[0003]而微載體懸浮培養(yǎng)工藝，較轉(zhuǎn)瓶工藝雖有提高，仍存在較大改進空間，其生產(chǎn)周期仍需6~7天，依靠轉(zhuǎn)瓶提供帶毒細胞，無法避免轉(zhuǎn)瓶清洗產(chǎn)生的帶毒廢水，另微載體昂貴，可重復利用次數(shù)較少，廠商建議重復利用2~3次，因此微載體成本占疫苗成本比例較高，此外，微載體擴大 培養(yǎng)時的球轉(zhuǎn)球工藝相對較難。轉(zhuǎn)瓶工藝及傳統(tǒng)的反應器微載體懸浮培養(yǎng)工藝，其生產(chǎn)的抗原中存在較高含量的血清，所產(chǎn)疫苗，仍會使動物機體產(chǎn)生不同程度的不良反應。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法及微載體懸浮培養(yǎng)法的不足之處，提供一種應用反應器全懸浮培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模高密度生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗原的方法。該方法可以大量降低生產(chǎn)成本，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低80~90%，較傳統(tǒng)反應器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低50~70%，無需載體，且該工藝占地小，可迅速進行規(guī)?；a(chǎn)，對環(huán)境要求較低，自動化程度高，人工成本少，生產(chǎn)批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
[0005]為了實現(xiàn)上述指標，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
[0006]一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，包括如下步驟:
[0007](I)種子細胞在搖瓶中的培養(yǎng)及傳代在搖瓶中培養(yǎng)種子細胞PK-15B1，取樣進行細胞計數(shù)，當細胞密度達到I~3 X 16個/ml時，靜置搖瓶，待懸浮細胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去1/2~2/3上清，輕輕反復吹打細胞，加入種子細胞生長液后，按照I~3X105個/ml的密度等量分裝入數(shù)個搖瓶，并在37°C，80~120r/min轉(zhuǎn)速的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；[0008](2)種子細胞的接毒將前述培養(yǎng)所得的種子細胞PK-15B1懸液，2000~4000r/min離心5min后，棄去上清，用反應器最終培養(yǎng)液體積3 %~5%的PCV2種毒液將細胞重懸起來，并在37°C，80~120r/min的條件下在搖瓶或反應器中維持lh，將接毒后的細胞注入反應器中，并加入細胞生長液(細胞生長液的成份(V/V)為:低糖
NBCS5%~10%，雙抗1%，D-氨基葡萄糖0.5%~2%，硫酸葡聚糖0.5%~2% )，使細胞達到I~3X 15個/ml的密度，并設(shè)定反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020%~80%，攬祥速度100~150r/min ；
[0009](3)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述條件下培養(yǎng)了 48~72h后取樣，進行細胞密度測定，如細胞密度達到I~3X 16個/ml，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，排出1/2~2/3上清，并將細胞維持液(細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM93%~97.5%，硫酸葡聚糖0.5~2%，伴刀豆球蛋白A0.5%~2%，水解酪蛋白0.5%~2%，雙抗1% )補足至培養(yǎng)終培養(yǎng)體積，設(shè)定反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min，在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后，取樣進行細胞活力測定并靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，收獲上清，并根據(jù)細胞活力測定結(jié)果決定補液策略如死細胞數(shù)百分比在90%以下時，則繼續(xù)補加新鮮細胞維持液至培養(yǎng)終體積，并在pH7.0~
7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，重復上述過程，直至死細胞數(shù)量達到90%以上，將細胞全部收獲，將收獲的抗原反復凍融3次后再經(jīng)過濾去除細胞碎片，作為半成品，進行 病毒含量測定；
[0010](4)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗；
[0011](5)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15B1細胞中大量增殖，經(jīng)滅活后加入佐劑進行乳化，制備疫苗。
[0012]本發(fā)明【具體實施方式】
[0013]采用攪拌式生物反應器作為培養(yǎng)設(shè)備；PK-15B1克隆細胞(CCTCC N0.C200936,南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)作為種細胞；豬圓環(huán)病毒2型SH株(南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)作為種毒；含有硫酸葡聚糖和D-氨基葡萄糖的低糖DMEM作為細胞生長液；含有伴刀豆球蛋白A、硫酸葡聚糖和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM作為細胞維持液；包括如下步驟:
[0014](I)種子細胞在搖瓶中培養(yǎng)及傳代
[0015]種子細胞PK-15B1在搖瓶中培養(yǎng)，取樣進行細胞計數(shù)，當細胞密度達到I~3X 16個/ml時，靜置搖瓶，待懸浮細胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去上清1/2~2/3，輕輕反復吹打細胞，加入種子細胞生長液(種子細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM87%~93.5%，新生牛血清(NBCS)5%~10 %，雙抗I %，硫酸葡聚糖0.5~2 % )后，按照I~3 X 15個/ml的密度等量分裝入數(shù)個搖瓶，并在37°C，80~120r/min轉(zhuǎn)速的條件下繼續(xù)培養(yǎng);
[0016](2)種子細胞接毒
[0017]將前述培養(yǎng)所得的種子細胞懸液，以2000~4000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后，棄去上清，用設(shè)定培養(yǎng)終體積的3%~5%的PCV2CGMCCN0.2389株(由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)種毒液將沉淀的細胞重懸起來，并在37°C，80~120r/min轉(zhuǎn)速的條件下在搖瓶或反應器中維持lh，隨后將接入病毒后的細胞懸浮液注入反應器中，并加入細胞生長液(細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM85~93%，NBCS5%~10%，雙抗1%，D-氨基葡萄糖0.5 %~2 %，硫酸葡聚糖0.5 %~2 % )至設(shè)定培養(yǎng)的最終體積，使細胞達到I~3 X 15個/ml的密度，反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min ；
[0018](3)病毒的收獲和含量測定
[0019]待細胞在前述條件下培養(yǎng)48~72h后取樣，進行細胞密度測定，如細胞密度達到I~3X106個/ml，靜置，待培養(yǎng)的懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，排出1/2~2/3的上清液(棄去)，加入細胞維持液(細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM93%~97.5%，硫酸葡聚糖0.5%~2%，伴刀豆球蛋白A0.5%~2%，水解酪蛋白0.5%~2%，雙抗為1% )設(shè)定培養(yǎng)的最終體積，反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min，在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后，取樣進行細胞活力測定并靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，收獲上清；根據(jù)細胞活力測定結(jié)果決定補液策略，如死細胞數(shù)百分比在90%以下時，繼續(xù)補加新鮮細胞維持液至設(shè)定培養(yǎng)的最終體積，并在pH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，重復上述過程，直至死細胞百分數(shù)達到90 %，將收獲全部細胞病毒培養(yǎng)液，與前各次收獲的上清液混合，并經(jīng)反復凍融3次后再經(jīng)過濾去除細胞碎片，進行病毒含量測定后成為制苗用抗原(半成品)。
[0020](4)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗。
[0021](5)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15B1細胞中大量增殖，經(jīng)滅活后加入佐劑進行乳化，制備疫苗。
[0022]以上所述的生物反應器為攪拌式生物反應器，其可自動控制培養(yǎng)溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，容積為2L~3000L ;培養(yǎng)溫度為33~38°C、pH6.5~7.4、溶氧20%~80%、攪拌速度80~200r/min，生物反應器在使用前需調(diào)試，滅菌；
[0023]本發(fā)明所述種子細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM (AXF4246IDCHYCL0NE)87%~93.5%,NBCS(130502杭州天杭生物科技有限公司)5%~10%，雙抗1%，硫酸葡聚糖(1C221C22生興生物)0.5^-2% ；
[0024]本發(fā)明所述細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM85~93%，NBCS5%~10%，雙抗I %，D-氨基葡萄糖(C4875SIGMA) 0.5 %~2 %，硫酸葡聚糖0.5 %~2 % ;
[0025]本發(fā)明所述細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM93%~97.5%，硫酸葡聚糖0.5%~2%，伴刀豆球蛋白A (C5275SIGMA) 0.5 %~2 %，水解酪蛋白(BCBL0573VFLUKA)0.5%~2%，雙抗為 1% ；
[0026]本發(fā)明所述雙抗為含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0027]本發(fā)明所述細胞活力檢測，采用Muse? Cell Analyzer (MERCK MILLIP0RE)及Muse?Count&Viability Kit (14-0156MERCK MILLIP0RE)。
[0028]微生物資源信息
[0029]豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus2, PCV2) SH 株(保藏號為 CGMCC N0.2389,由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)；PK-15B1株細胞(保藏號:CCTCC N0.C200936,由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)；該毒株和細胞為我國商品化豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(SH株)的生產(chǎn)用種毒和細胞，該疫苗由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部批準為二類新獸藥(農(nóng)業(yè)部公告1448號，2010.08.27 發(fā)布)。
[0030]本發(fā)明積極意義
[0031] 本發(fā)明涉及了一種應用反應器全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原的方法，本發(fā)明使用生物反應器全懸浮無血清培養(yǎng)生產(chǎn)PCV2抗原，制備滅活疫苗。該發(fā)明方法可以大量降低生產(chǎn)成本，相比轉(zhuǎn)瓶工藝單位抗原成本降低90%以上，投入產(chǎn)出比提高4~10倍，較傳統(tǒng)反應器培養(yǎng)工藝單位抗原成本降低50%~70%，產(chǎn)量提高3~5倍，此發(fā)明無需載體，無血清殘留，生產(chǎn)的疫苗安全性更高，同時制品的批間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定易于控制，可明顯提高制品的產(chǎn)量及質(zhì)量。
[0032](I)本發(fā)明用生物反應器全懸浮培養(yǎng)工藝代替轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價低、成本高、成品苗不良反應強的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和工藝的改變，全面提高疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提升疫苗的安全性。
[0033](2)本發(fā)明應用生物反應器進行疫苗生產(chǎn)，較轉(zhuǎn)瓶工藝自動化水平高，降低人工成本，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，操作簡便易擴大，較傳統(tǒng)生物反應器工藝，無需使用微載體，避免使用胰酶進行細胞傳代，從而避免胰酶對細胞的損傷，無血清培養(yǎng)，提高病毒收獲次數(shù)，并在細胞維持液中添加伴刀豆球蛋白A，提高了病毒效價，進而提高了抗原的產(chǎn)量及滴度，進一步降低制苗成本。
[0034](3)本發(fā)明的產(chǎn)品病毒效價比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)法提高10~30倍，病毒效價可以穩(wěn)定在107_°TCID5(l/ml以上；抗原質(zhì)量穩(wěn)定,每罐收獲的病毒抗原一致均一,易于規(guī)模化生產(chǎn)，且整個生產(chǎn)工藝過程帶毒部分均完全在密閉的罐體和管道中進行，為封閉狀態(tài)，不涉及傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝及傳統(tǒng)反應器生產(chǎn)工藝所存在的其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1本發(fā)明的制備工藝流程圖。
實施例
[0036]以下結(jié)合說明書附圖及具體實施例來對本發(fā)明作進一步的描述。
[0037]實施例1
[0038]—全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原
[0039]1.豬圓環(huán)病毒2型抗原的制備(I)種子細胞在搖瓶中的培養(yǎng)及傳代
[0040]種子細胞PK-15B1 (CCTCC N0.C200936,由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)在搖瓶中培養(yǎng)生長，取樣進行細胞計數(shù)，細胞密度達到2 X 16個/ml時，靜置搖瓶，待懸浮細胞自然沉淀至瓶底后，用吸管吸去上清2/3，輕輕反復吹打細胞，加入種子細胞生長液(細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM88%，NBCSlO%，硫酸葡聚糖1%，雙抗1% )后，按照2X 15個/ml的密度等量分裝入數(shù)個搖瓶，并在37°C，100r/min轉(zhuǎn)速的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
[0041](2)種子細胞的接毒
[0042]將前述培養(yǎng)所得的種子細胞懸液，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后，棄去上清，使用反應器培養(yǎng)終體積5%的PCV2CGMCC N0.2389 (由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授提供)種毒液將細胞重懸起來，并在37°C，100r/min轉(zhuǎn)速的條件下在搖瓶中維持lh，隨后將接毒后的細胞注入反應器中，并加入細胞生長液(細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM87%，NBCSlO%,雙抗I %，D-氨基葡萄糖I %，硫酸葡聚糖I % )至設(shè)定培養(yǎng)終體積5L，細胞達到2 X 15個/ml的密度，反應器控制條件為:pH7.2，D050%，攪拌速度120r/min。
[0043](3)病毒的收獲和含量測定[0044]待細胞在前述條件下，細胞生長液中培養(yǎng)48h后取樣，進行細胞密度測定，細胞密度達到1.85X 16個/ml，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，排出上清1/2 (約
2.5L)，并使用細胞維持液補足至設(shè)定的培養(yǎng)液最終體積5L，反應器控制條件為:pH7.2，D040 %，攪拌速度120r/min，在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，收獲上清(一收)，并取細胞進行細胞活力檢測，死細胞百分比在30%左右，繼續(xù)補加新鮮細胞維持液(制苗細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM97%，伴刀豆球蛋白A0.5%，蛋白水解物0.5<%，硫酸葡聚糖1%，雙抗1(%)至設(shè)定培養(yǎng)液的最終體積5L，并在pH7.2，D040%，攪拌速度120r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h，重復上述過程共3次收次，直至死細胞數(shù)量達到90%將收獲全部細胞病毒培養(yǎng)液，與前2收次的上清液混合，并經(jīng)反復凍融3次后經(jīng)過濾去除細胞碎片，進行病毒含量測定后成為制苗用抗原(半成品)。
[0045]2.半成品檢驗
[0046]半成品病毒含量測定采用IFA測定法，即將PCV2病毒液作10—1到10_8倍用維持液比稀釋后分別接種于長滿單層的PK-15B1細胞，每個稀釋度4個孔，每孔0.2ml，同時設(shè)立陰性對照，37°C含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)48h后，無水乙醇固定細胞，用倒置熒光顯微鏡觀察每個稀釋度含有PCV2陽性細胞(綠色熒光)的孔數(shù)，按Karber氏法計算病毒含量。
[0047](I)半成品病毒含量測定根據(jù)國家標準病毒含量應≥105_5TCID5cZml，此實施例中豬圓環(huán)病毒2型抗原的病毒含量為107_33TCID5(l/ml。
[0048](2)無菌檢驗按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典。2010年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011年，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)，無菌生長。
[0049]3.疫苗制造、成品檢驗
[0050](I)疫苗制造用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗，包括:將PCV2株在PK-15B1細胞中大量增殖，經(jīng)滅活后加入佐劑進行乳化，制備疫苗。
[0051](2)成品檢驗按《豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(SH株)質(zhì)量標準》(農(nóng)業(yè)部公告1448號，2010.08.27發(fā)布，參見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心組編.獸用生物制品質(zhì)量標準匯編(2010)，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011)要求進行，抗體效價為1:6400，符合要求。
[0052]本實施例采用的技術(shù)方案中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于全懸浮培養(yǎng)細胞的生物反應器，容積為7.5L。
[0053]本技術(shù)方案中，所述雙抗為含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0054]本技術(shù)方案中，所述細胞活力檢測，采用Muse? Cell Analyzer及Muse?Count&Viability Kit。
[0055]實施例2
[0056]—全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原
[0057]1.豬圓環(huán)病毒2型抗原的制備
[0058](I)種子細胞在搖瓶中的培養(yǎng)及傳代
[0059]取樣進行細胞計數(shù)，細胞密度達到2.5 X 16個/ml時，靜置搖瓶，待懸浮細胞自然沉淀至瓶底后，用吸管吸去上清2/3，輕輕反復吹打細胞，加入種子細胞生長液后，按照4X 15個/ml的密度等量分裝入數(shù)個搖瓶，并在37°C，100r/min轉(zhuǎn)速的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
[0060](2)種子細胞的接毒
[0061]將前述培養(yǎng)所得的健康細胞懸液，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后，棄去上清，使用培養(yǎng)終體積5%的PCV2CGMCC N0.2389種毒液(3750ml)將細胞重懸起來，并在37°C，100r/min轉(zhuǎn)速的條件下在反應器中維持lh，隨后將接毒后的細胞注入反應器中，并加入細胞生長液至培養(yǎng)終體積75L，使細胞達到2 X 15個/ml的密度，反應器控制條件為:pH7.2，D050%，攪拌速度 120r/min。
[0062](3)病毒的收獲和含量測定
[0063]待細胞在前述條件下，細胞生長液中培養(yǎng)72h后取樣，進行細胞密度測定，細胞密度達到2.8X 16個/ml，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，排出2/3上清(約50L)，并使用細胞維持液補足培養(yǎng)終體積75L，反應器控制條件為:pH7.2，D050%，攪拌速度150r/min，在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h后，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，收獲上清液(一收)，并取細胞進行細胞活力檢測，死細胞百分比在35%左右，繼續(xù)補加新鮮細胞維持液至培養(yǎng)終體積75L，并在pH7.2，D050%，攪拌速度150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h，重復上述過程至4收，死細胞數(shù)量達到90%以上，將細胞病毒培養(yǎng)液全部收獲，與前3收次的上清液混合，并經(jīng)反復凍融3次后經(jīng)過濾去除細胞碎片，進行病毒含量測定后成為制苗用抗原(半成品)。
[0064]2.半成品檢驗及疫苗制造、成品檢驗
[0065](I)半成品病毒含量測定:根據(jù)國家標準病毒含量應≥105_5TCID5tlAiL此實施例中豬圓環(huán)病毒2型的病毒含量為107_°TCID5(l/ml
[0066](2)無菌檢驗:按《中國獸藥典》附錄301頁進行，均無菌生長。
[0067]3.疫苗制造、成品檢驗
[0068](I)疫苗制造用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗，包括:將PCV2株在PK-15B1細胞中大量增殖，經(jīng)滅活后加入佐劑進行乳化，制備疫苗。
[0069](2)成品檢驗成品檢驗按《豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(SH株)質(zhì)量標準》要求進行，此實施例中的疫苗抗體效價為1: 5280，符合要求。
[0070]本實施例采用的技術(shù)方案中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于全懸浮細胞培養(yǎng)的生物反應器，容積為100L。
[0071]本技術(shù)方案中，所述種子細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM89%，NBCSlO%,雙抗1%。
[0072]本技術(shù)方案中，所述制苗細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM87%，NBCSlO%,雙抗I %，D-氨基葡萄糖I %，硫酸葡聚糖I %。
[0073]本技術(shù)方案中，所述制苗細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM97%，伴刀豆球蛋白A0.5 %，蛋白水解物0.5%，硫酸葡聚糖I %，雙抗I %。
[0074]本技術(shù)方案中，所述雙抗為含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶液。
[0075]本技術(shù)方案中，所述細胞活力檢測，采用Muse? Cell Analyzer及Muse?Count&Viability Kit。
[0076]實施例3
[0077]——三種不同細胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(SH株)的比較結(jié)果，見表1
[0078]表1不同細胞培養(yǎng)工藝對比表
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，該方法包括如下步驟: (1)種子細胞在搖瓶中的培養(yǎng)及傳代在搖瓶中培養(yǎng)種子細胞PK-15B1，取樣進行細胞計數(shù)，當細胞密度達到I~3X 16個/ml時，靜置搖瓶，待懸浮細胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去1/2~2/3上清，輕輕反復吹打細胞，加入種子細胞生長液后，按照I~3X 15個/ml的密度等量分裝入數(shù)個搖瓶，并在37°C，80~120r/min轉(zhuǎn)速的條件下繼續(xù)培養(yǎng)； (2)種子細胞的接毒將前述培養(yǎng)所得的種子細胞PK-15B1懸液，2000~4000r/min離心5min后，棄去上清，用反應器最終培養(yǎng)液體積3%~5%的PCV2種毒液將細胞重懸起來，并在37°C，80~120r/min的條件下在搖瓶或反應器中維持lh，將接毒后的細胞注入反應器中，并加入細胞生長液，使細胞達到I~3 X 15個/ml的密度，反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020% ~80%，攪拌速度 100 ~150r/min ； (3)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述條件下培養(yǎng)了48~72h后取樣，進行細胞密度測定，如細胞密度達到I~3X 16個/ml，靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，排出1/2~2/3上清，并將細胞維持液補足至培養(yǎng)終培養(yǎng)體積，設(shè)定反應器控制條件為:pH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min，在該條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h后，取樣進行細胞活力測定并靜置，待懸浮細胞自然沉降至罐體底部后，收獲上清，并根據(jù)細胞活力測定結(jié)果決定補液策略:死細胞數(shù)百分比在90%以下時，則繼續(xù)補加新鮮細胞維持液至培養(yǎng)終體積，并在PH7.0~7.4，D020%~80%，攪拌速度100~150r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，重復上述過程，直至死細胞數(shù)量達到90%以上，將細胞全部收獲，將收獲的抗原反復凍融3次后再經(jīng)過濾去除細胞碎片，作為半成品，進行病毒含量測定。 (4)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗； (5)用以上所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15B1細胞中大量增殖，經(jīng)滅活后加入佐劑進行乳化，制備疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原的方法，其特征在于種子細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM87%~93.5%，NBCS5%~10%，雙抗1%，硫酸葡聚糖0.5%~2%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原的方法，其特征在于:所述細胞生長液的成份(V/V)為:低糖DMEM85%~93%，NBCS5%~10%，雙抗1%，D-氨基葡萄糖0.5%~2%，硫酸葡聚糖0.5%~2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型抗原的方法，其特征在于:所述細胞維持液的成份(V/V)為:低糖DMEM93%~97.5%，硫酸葡聚糖0.5~2%，伴刀豆球蛋白A0.5%~2%，水解酪蛋白0.5%~2%，雙抗1%。
【文檔編號】A61K39/12GK104027798SQ201410313057
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】何海蓉, 孫石靜, 王正春, 董彥鵬, 何葉峰, 胡芳, 張志華, 繆芬芳, 劉怡, 姜沖 申請人:江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司