綠原酸提取物的制備方法
【專利摘要】綠原酸提取物的制備方法。使含有綠原酸的水溶液用第一大孔樹脂吸附單元進(jìn)行吸附分離，至流出水溶液中綠原酸的濃度>上柱前水溶液中綠原酸的濃度后，用pH值2?8的水洗滌，收集、合并所述通過第一大孔樹脂吸附單元后流出的含有綠原酸的水流出液和水洗液并調(diào)節(jié)pH值2?4后，用第二大孔樹脂吸附單元進(jìn)行吸附，用pH值2?4的水洗滌除雜后，再用乙醇體積含量為30?95%的乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液后除去溶劑，得到綠原酸提取物。該制備方法能大大提高綠原酸的含量，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】綠原酸提取物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種綠原酸提取物的制備方法，特別是由來源于各種方法得到的含綠 原酸的產(chǎn)品制備其純化提取物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 綠原酸是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物所合成的一種苯丙 素類物質(zhì)，綠原酸主要存在于忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬及杜仲科杜仲屬植物中?？ㄗ阎芯G 原含量為1. 5~3. 3%，金銀花中綠原含量為0. 2~11. 2%，杜仲葉綠原含量為1~5%。綠原酸具有 利膽、抗菌、抗病毒、降壓、升高白細(xì)胞及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用，綠原酸是透明 質(zhì)酸酶（HAase)和Gle-6-p位移酶的天然特異性抑制劑，也是選擇性輕基自由基和過氧自 由基的清除劑，可作為保健品、食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料。分離純化綠原酸的常 見方法，有醇沉、無機(jī)鹽沉淀、溶劑萃取、離子交換樹脂分離、凝膠色譜分離、高效液相色譜 分離以及大孔吸附樹脂分離等方式。從產(chǎn)品的安全性、生產(chǎn)效率等方面來看，大孔吸附樹脂 分離純化是工業(yè)化生產(chǎn)綠原酸的主要發(fā)展方向。如李進(jìn)飛等報(bào)道了 NKA-9型樹脂對綠原酸 吸附分離性能的研究(華西藥學(xué)雜志，2004, 19(1) :1-4)、王芳等報(bào)道了大孔吸附樹脂對綠 原酸吸附性能的研究(海峽藥學(xué)，2006, 18(1) :97-99)，中國專利CN 102285885A等也公開了 大孔吸附樹脂分離純化綠原酸的方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的由大孔吸附樹脂制備綠原酸的常規(guī) 方法是：將含綠原酸的水溶液或水提取液，上大孔吸附樹脂柱后，先用水洗滌除雜，再用乙 醇洗脫(解析)，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，即得到綠原酸提取物，其中上柱液和洗滌用水 的pH值為f 8,優(yōu)選的pH值為f 4,洗脫用乙醇濃度為2(Γ95%。 申請人:研究發(fā)現(xiàn)，目前報(bào)道 的這類常規(guī)大孔樹脂方法制備得到的綠原酸提取物的含量都較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述情況，本發(fā)明提供了一種綠原酸提取物的制備方法，特別是對由來源于 各種方法得到的含綠原酸的產(chǎn)品制備其純化提取物的方法。
[0004] 本發(fā)明綠原酸提取物的制備方法，是使含有綠原酸的水溶液用第一大孔樹脂吸附 單元進(jìn)行吸附分離，至流出水溶液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度后，用 pH值2~8的水洗滌，收集、合并所述通過第一大孔樹脂吸附單元后流出的含有綠原酸的水 流出液和水洗液并調(diào)節(jié)pH值2~4后，用第二大孔樹脂吸附單元進(jìn)行吸附，然后用pH值2~4 的水洗滌除雜后，再用乙醇體積含量為3(Γ95%的乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液后除去溶 齊U，得到綠原酸提取物。
[0005] 上述方法中作為制備原料的所述含有綠原酸的水溶液，可以來源于各種含綠原酸 成分的原料，如，既可以包括含有綠原酸的藥材或相應(yīng)藥材的加工品，如金銀花、山銀花、川 銀花、杜仲葉、忍冬藤、葵花籽柏；金銀花、山銀花、川銀花的莖枝和/或葉，以及含有綠原酸 的其它藥用植物、藥材和飲片等所得到的水提取液，也可以是由含有綠原酸的藥材或相應(yīng) 藥材加工品的提取物進(jìn)一步制備的相應(yīng)加工產(chǎn)品的水溶液。
[0006] 深入的研究實(shí)驗(yàn)顯示，大孔樹脂對綠原酸及在其提取物中常見的如黃酮、皂苷等 雜質(zhì)性成分都具有吸附能力，但相比較，大孔樹脂對綠原酸的吸附力（強(qiáng)度）較弱。因此， 當(dāng)大孔樹脂吸附飽和后綠原酸最先流出，而黃酮、皂苷等其它成分則仍可被繼續(xù)吸附，并且 隨著所述含有綠原酸的水溶液的繼續(xù)進(jìn)入，通過競爭性吸附作用，原已在樹脂上被吸附的 綠原酸還會被黃酮、皂苷等吸附力更強(qiáng)的成分置換(或替代）而脫離大孔樹脂隨水液流出。 本發(fā)明正是利用這一特性，先用第一大孔樹脂單元吸附飽和后使綠原酸流出，至水流出液 中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度后，再用水洗滌，即可基本洗盡大孔樹脂 上原已吸附的綠原酸成分，繼續(xù)被吸附留存在大孔樹脂上的則是與綠原酸相分離的大量黃 酮、皂苷等欲除去的雜質(zhì)性成分。將收集的通過第一大孔樹脂吸附單元除雜后的含有綠原 酸的水流出液和水洗液合并后，再按常規(guī)方法用第二大孔吸附樹脂單元吸附，然后水洗漆 進(jìn)一步除雜后，再用醇解吸洗脫，洗脫液除去溶劑后，即得到高含量的綠原酸提取物。
[0007] 本發(fā)明上述方法中所述的大孔樹脂吸附單元，可采用最為常用裝填有大孔吸附樹 脂的吸附柱等形式。所述的第一和第二大孔樹脂吸附單元，根據(jù)實(shí)際情況，可以采用相互 獨(dú)立的兩個(gè)大孔樹脂吸附單元(可分別由單根和/或多根樹脂吸附柱組成)，也可以采用由 同一大孔樹脂吸附單元以交替方式輪換操作，分別作為第一和第二樹脂吸附單元使用來實(shí) 現(xiàn)。對于采用相互獨(dú)立設(shè)置的第一和第二大孔吸附樹脂單元而言，還可以采用將其適當(dāng)并 連和/或串連等組合方式操作，以滿足特定的處理規(guī)模和實(shí)際生產(chǎn)的需要。
[0008] 進(jìn)一步，上述方法中所述用第一大孔樹脂吸附單元吸附的所述含有綠原酸的水溶 液的pH值為2~8 ;優(yōu)選的用第一大孔樹脂吸附單元吸附的所述含有綠原酸的水溶液pH值 為2~4。對pH值的調(diào)節(jié)，除優(yōu)選以工業(yè)生產(chǎn)中最為常用和易得的鹽酸外，也可以使用包括磷 酸等其它酸性成分，特別是藥學(xué)中可允許和接受的酸性成分進(jìn)行酸化調(diào)節(jié)。
[0009] 綠原酸為弱酸性成分，堿性條件下不穩(wěn)定，故一般應(yīng)在約中性或酸性條件下吸附 或洗脫，因此，本發(fā)明第一大孔樹脂吸附單元吸附和水洗脫的pH值為2~8,主要是保持綠原 酸穩(wěn)定，由于綠原酸在酸性條件下更易被吸附且樹脂吸附容量更大，故優(yōu)選樹脂吸附的pH 值為2~4,第二大孔樹脂吸附單元水洗脫的pH值也優(yōu)選為2~4。3(Γ95%的乙醇-水混合溶 液均能洗脫完全綠原酸成分，但從降低生產(chǎn)成本考慮，優(yōu)選的洗脫液乙醇濃度可為3(Γ50%。
[0010] 實(shí)驗(yàn)顯示，在本發(fā)明上述方法中第一和第二大孔樹脂吸附單元中允許使用的大孔 吸附樹脂可有較多選擇，例如，兩大孔樹脂吸附單元可分別獨(dú)立地選自但并不限于HPD100、 HPD300、D101、D100、ΝΚΑ-2、ΝΚΑ-9、S-8、LS-600、ΗΖ806 或 ΑΒ-8 等型號的大孔吸附樹脂中的 至少一種。
[0011] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前常規(guī)方法相比，本發(fā)明上述方式的制備方法，能顯著提高綠 原酸提取物的含量。
[0012] 以下通過實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但 不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想 情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 川銀花的水提取液（pH值約為5,綠原酸含量為2. 5mg/ml)，上第一 HPD100大孔吸附 樹脂柱，收集水流出液，HPLC檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的含量為3. Omg/ml， 停止上樣,改用柱床體積2飛倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗 液，調(diào)節(jié)pH值21，再上第二HPD100大孔吸附樹脂柱，用pH值21酸水洗滌后，再用乙醇體 積含量為3(Γ50%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原 酸提取物。
[0014] 實(shí)施例2 山銀花的水提取液(調(diào)pH值為2,綠原酸含量為2. lmg/ml )，上第一 D101大孔吸附樹脂 柱，收集水流出液，HPLC檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的含量為2. 4mg/ml，停止 上樣，改用柱床體積4倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào) 節(jié)pH值為4,再上第二HPD101大孔吸附樹脂柱，用pH=4的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量 為70%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0015] 實(shí)施例3 金銀花的水提取液(調(diào)pH值為3,綠原酸含量為1. 2mg/ml)，上第一 NKA-2大孔吸附樹 脂柱，收集水流出液，HPLC檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的含量為1. 2mg/ml，停 止上樣，改用柱床體積5倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液， 調(diào)節(jié)pH值為3,再上第二NKA-2大孔吸附樹脂柱，用pH=3的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量 為40%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0016] 實(shí)施例4 杜仲葉的水提取液（pH值約為6)，上第一 S-8大孔吸附樹脂柱，收集水流出液，檢測綠 原酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上樣，改用 柱床體積3倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào)節(jié)pH值為2， 再上第二S-8大孔吸附樹脂柱，用pH=4的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量為30%的乙醇-水 溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0017] 實(shí)施例5 葵花籽柏的水提取液(調(diào)pH值為8)，上第一 AB-8大孔吸附樹脂柱，收集水流出液，檢 測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上樣， 改用柱床體積2倍、pH=8的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào) 節(jié)pH值為2,再上第二AB-8大孔吸附樹脂柱，用pH=4的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量為 95%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0018] 實(shí)施例6 川銀花莖枝和葉的水提取液，上第一 HZ806大孔吸附樹脂柱，收集水流出液，檢測綠原 酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上樣，改用柱 床體積3倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào)節(jié)pH值為4， 再上第二LS-600大孔吸附樹脂柱，用pH=4的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量為50%的乙 醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0019] 實(shí)施例7 山銀花提取物的水溶液（pH值約為5)，上第一 S-8大孔吸附樹脂柱，收集水流出液，檢 測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上樣， 改用柱床體積4倍、pH=5的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào) 節(jié)pH值為3,再上第二NKA-9大孔吸附樹脂柱，用pH=3的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量為 60%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0020] 實(shí)施例8 川銀花提取物的水溶液(調(diào)pH值為3)，上第一 D-100大孔吸附樹脂柱，收集水流出液， 檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上 樣，改用柱床體積6倍的水洗脫，收集水洗液，合并含有綠原酸的水流出液和水洗液，調(diào)節(jié) pH值為3,再上第二HPD300大孔吸附樹脂柱，用pH=2的酸水洗滌后，再用乙醇體積含量為 30%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0021] 實(shí)施例9 南江金銀花的水提取液(調(diào)pH值為4,綠原酸含量為2. 3mg/ml)，上第一 HPD100大孔 吸附樹脂柱，收集水流出液，檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的含量為2. 6mg/ml， 停止上樣,改用柱床體積5倍、pH=4的酸水洗脫，收集水洗液，將含有綠原酸的水流出液和 水洗液依次通過第二HPD300大孔吸附樹脂柱，再用乙醇體積含量為40%的乙醇-水溶液洗 脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0022] 實(shí)施例10 黃褐毛忍冬的70%乙醇提取液，回收除盡乙醇，加水稀釋，調(diào)pH值為3,濾過，濾液上第 一 D101大孔吸附樹脂柱，檢測綠原酸的含量，至水流出液中綠原酸的濃度>上柱前水溶液 中綠原酸的濃度，停止上樣，改用柱床體積4倍、pH=3的酸水洗脫，收集水洗液，將含有綠原 酸的水流出液和水洗液依次通過第二NKA-2大孔吸附樹脂柱，再用乙醇體積含量為50%的 乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0023] 實(shí)施例11 杜仲葉提取物的水溶液(調(diào)pH值為2)，上第一 NKA-9大孔吸附樹脂柱，檢測綠原酸的 含量，至水流出液中綠原酸的濃度>上柱前水溶液中綠原酸的濃度，停止上樣，改用柱床體 積5倍、pH=2的酸水洗脫，收集水洗液，將含有綠原酸的水流出液和水洗液依次通過第二 NKA-9大孔吸附樹脂柱，再用乙醇體積含量為30%的乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，除 去溶劑，干燥，得到所述的綠原酸提取物。
[0024] 以下通過對綠原酸提取物的含量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步說明本發(fā)明制備方法的有益 效果。
[0025] 綠原酸含量測定：按2010版中國藥典一部金銀花項(xiàng)下的綠原酸含量測定方法測 定。
[0026] 實(shí)施例1至實(shí)施例11含有綠原酸的藥材及其加工品的水提取液，或是含有綠原酸 的提取物的水溶液，按常規(guī)方法分別用與各實(shí)施例相應(yīng)的大孔吸附樹脂柱吸附后，先用水 洗脫，再按各實(shí)施例所述的乙醇洗脫，除去溶劑，干燥，即得常規(guī)方法制備的綠原酸提取物。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例1至實(shí)施例11得到的綠原酸提取物與按常規(guī)方法制備得到的綠原 酸提取物，按藥典方法進(jìn)行有效成分綠原酸的含量測定，結(jié)果見表1。
[0028] 由表1對比可見，本發(fā)明制備方法得到的綠原酸提取物比常規(guī)方法制備的綠原酸 提取物中綠原酸含量高約50%左右，顯著提高了有效成分的含量，且兩種制備方法中綠原 酸的提取轉(zhuǎn)移率相當(dāng)、無明顯差異(表明本發(fā)明方法用第一大孔吸附樹脂單元的除雜操作， 基本只除去雜質(zhì)，并不會對綠原酸成分的回收造成影響)，約為90%。此外，本發(fā)明方法進(jìn)一 步還具有的意想不到的效果是，洗脫用的乙醇量可減少約一半，從而大大降低了生產(chǎn)成本， 提高了生產(chǎn)效率。而且目前已有文獻(xiàn)報(bào)道/使用的常規(guī)大孔樹脂制備方法中所述的樹脂型 號、洗脫用乙醇濃度、含綠原酸的水提取液或水溶液等，均可適用于本發(fā)明方法，使其更具 有了廣泛推廣應(yīng)用的意義和價(jià)值。
[0029] 表1不同制備方法得到的提取物中綠原酸含量的比較

【權(quán)利要求】
1. 綠原酸提取物的制備方法，其特征是使含有綠原酸的水溶液用第一大孔樹脂吸附單 元進(jìn)行吸附分離，至流出水溶液中綠原酸的濃度 > 上柱前水溶液中綠原酸的濃度后，用pH 值2~8的水洗滌，收集、合并所述通過第一大孔樹脂吸附單元后流出的含有綠原酸的水流 出液和水洗液并調(diào)節(jié)pH值2~4后，用第二大孔樹脂吸附單元進(jìn)行吸附，然后用pH值2~4的 水洗滌除雜后，再用乙醇體積含量為3(Γ95%的乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液后除去溶劑， 得到綠原酸提取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是用第一大孔樹脂吸附單元進(jìn)行吸附分離的 所述含有綠原酸的水溶液，為含有綠原酸的藥材或藥材加工品的直接水提取液，或者是由 含有綠原酸的藥材或藥材加工品的提取物得到的水溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是用第一大孔樹脂吸附單元吸附的所述含有 綠原酸的水溶液的pH值2~8。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是用第一大孔樹脂吸附單元吸附的所述含有 綠原酸的水溶液的pH值2~4。
5. 如權(quán)利要求1至4之一所述的制備方法，其特征是所述各大孔樹脂吸附單元的吸附 樹脂分別獨(dú)立地選自 HPD100、HPD300、D101、D100、NKA-2、NKA-9、S-8、LS-600、HZ806 或 AB-8 型大孔吸附樹脂中的至少一種。
【文檔編號】A61P31/12GK104208122SQ201410257405
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】易進(jìn)海, 劉云華, 劉玉紅, 黃志芳, 陳燕, 楊昌林 申請人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院