瓜蔞、紅花和川芎在緩解果蠅腸道氧化應(yīng)激損傷中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是瓜蔞、紅花和川芎提取物在緩解果蠅腸道氧化損傷中的應(yīng)用。采用水提法得到瓜蔞、紅花和川芎提取物，對(duì)瓜蔞、紅花和川芎提取物進(jìn)行果蠅腸道氧化損傷模型修復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瓜蔞、紅花和川芎提取物具有良好的抗氧化、清除自由基等活性，可用于制備抗氧化藥物,尤其是抗腸道氧化損傷的藥物。
【專利說(shuō)明】瓜蔞、紅花和川芎在緩解果蠅腸道氧化應(yīng)激損傷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及瓜萎、紅花和川芎提取物在緩解果蠅腸道氧化損傷方面的應(yīng)用，涉及果蠅天然免疫【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道不僅具有消化吸收功能，而且是人體最大的免疫器官。當(dāng)病原微生物入侵腸道時(shí)，腸道固有免疫系統(tǒng)承擔(dān)著局部防御作用。腸道固有免疫系統(tǒng)主要包括腸黏膜上皮屏障，固有免疫細(xì)胞，固有免疫分子等。其中腸黏膜屏障功能是腸道的一個(gè)重要特征，當(dāng)外界環(huán)境、應(yīng)激、感染等因素刺激腸道時(shí)會(huì)打破腸粘膜屏障中的正常菌群與宿主之間的平衡，造成腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)。
[0003]果蠅作為重要的模式生物，其腸道結(jié)構(gòu)、細(xì)胞構(gòu)成及干細(xì)胞參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與哺乳動(dòng)物有很多相似之處。因此研究果蠅腸道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及腸道干細(xì)胞分化機(jī)制對(duì)揭示人類腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)作用。果蠅成蟲(chóng)腸道組織自我平衡依賴于死細(xì)胞的清除以及新細(xì)胞的產(chǎn)生，而且具有細(xì)胞分裂能力的腸道干細(xì)胞(ISC)在組織穩(wěn)態(tài)的維持方面起至關(guān)重要作用。一個(gè)腸道干細(xì)胞進(jìn)行不對(duì)稱分裂可產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)細(xì)胞為保持干細(xì)胞特性的ISC，另一個(gè)為短暫不分裂的成腸細(xì)胞(enteroblast，EB)，成腸細(xì)胞可繼續(xù)分化為吸收型的腸上皮細(xì)胞(enteiOcyte，EC)或者分泌型的內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cell, EE)。通過(guò)這些細(xì)胞的共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)腸道組織的維持和更新。然而，當(dāng)干細(xì)胞數(shù)目發(fā)生改變或 者功能下降時(shí)會(huì)導(dǎo)致器官一系統(tǒng)衰竭，誘發(fā)癌變及機(jī)體老化。
[0004]瓜萎(Trichosanthes kirilowii Maxim.)具有清熱漆痰、寬胸散結(jié)、潤(rùn)燥滑腸等功效，用于治療肺熱咳嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛等病癥。主要含揮發(fā)油類、油脂類、留醇類、栝樓酯堿、氨基酸等成分，具有抗菌、抗癌、提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇等多種作用。紅花(Carthamus tinctorius L.)是傳統(tǒng)藥材,具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效,用于治療循環(huán)障礙疾病。其有效成分主要是紅花黃色素和紅花紅色素。其中，紅花黃色素具有清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)神經(jīng)免受損傷等作用。川彎(Ligusticum chuanxiong Hort.)具有活血化瘀、祛風(fēng)止痛的功效，用于跌打腫痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛等病癥。主要含揮發(fā)油、生物堿、酚類、多糖及有機(jī)酸、苯酞內(nèi)酯等成分，具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌以及體外清除自由基等作用。然而，目前尚未有對(duì)瓜萎、紅花和川芎提取物用于緩解腸道氧化損傷的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是揭示出瓜萎、紅花和川芎提取物在緩解腸道氧化損傷中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的:
[0007]首先給果蠅喂食氧化應(yīng)激物(Paraquat和H2O2)來(lái)建立果蠅腸道氧化損傷模型，將瓜萎、紅花和川芎提取物進(jìn)行果蠅生存率和腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量觀察等實(shí)驗(yàn)，其次給果蠅分別喂食瓜萎、紅花和川芎提取物，觀察果蠅壽命以及老化果蠅腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瓜萎、紅花和川芎提取物具有很好的抗氧化、清除自由基等活性，可用于制備抗氧化藥物，尤其是治療腸道氧化損傷的藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1為瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)Paraquat和H2O2處理后果蠅生存率的影響；
[0009]圖2為瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)Paraquat處理后果蠅的腸細(xì)胞免疫染色結(jié)果和腸道干細(xì)
[0010]胞和成腸細(xì)胞數(shù)量的影響；
[0011]圖3為瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)果蠅壽命的影響；
[0012]圖4為瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)30day老化果蠅的腸細(xì)胞免疫染色結(jié)果和腸道干細(xì)胞和
[0013]成腸細(xì)胞數(shù)量的影響；
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明:
[0015]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:野生型W1118品系黑腹果蜆(Drosophila melanogaster)為實(shí)驗(yàn)室保存，esgGal4UAS-GFP由北京大學(xué)襲榮文教授提供。果蠅培養(yǎng)溫度為25°C、相對(duì)濕度60%。
[0016]果蠅培養(yǎng)基的配制:對(duì)照組培養(yǎng)基配方為玉米粉14.2g、瓊脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g、丙酸0.94mL、去離子水200mL。實(shí)驗(yàn)組中加入與對(duì)照組去離子水等體積的瓜萎、紅花和)11芎提取液，實(shí)驗(yàn)組中瓜萎、紅花和)11芎提取物的濃度為10 %。
[0017]本實(shí)施例涉及的各實(shí)驗(yàn)試劑均為市售分析純:Paraquat和H2O2等。
[0018]實(shí)施例1瓜萎、紅花和川芎提取液的制備
[0019]瓜萎、紅花和川芎各稱取20g，加入400mL去離子水浸泡12h，中火熬制3h，過(guò)濾，濾渣再加入200mL去離子水用同樣的方法提取I次，合并2次濾液濃縮至IOOmL,即得到質(zhì)量濃度為0.2g/mL(20% )的中草藥水提液，置_40°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]實(shí)施例2瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)Paraquat處理后果蠅腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量的影響
[0021]以普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)的果蠅作為對(duì)照組，瓜萎、紅花和川芎培養(yǎng)基中培養(yǎng)的果蠅作為實(shí)驗(yàn)組。分別隨機(jī)收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組羽化了 3~5d的果蠅，每組中雌雄果蠅各15只。對(duì)各組果蠅饑餓處理2h后轉(zhuǎn)移到放有5層濾紙的果蠅管中，向?yàn)V紙中加入6mMparaquat或I % H2O2溶液(含5%鹿糖)，使濾紙充分濕潤(rùn),每24h更換一次濾紙并記錄果蠅死亡數(shù)。
[0022]結(jié)果顯示:paraquat處理果蠅6d后，對(duì)照組生存率降到1.1 %，而喂食瓜萎、紅花和川芎的實(shí)驗(yàn)組生存率分別為75.5% (#*Ρ〈0.001)、95.6% (***Ρ〈0.001)和67.7 %(**Ρ〈0.01)，與對(duì)照組相比分別提高了 74.4%、94.5%和66.6% (圖1Α)。另外，H2O2處理果蠅6d后，喂食瓜萎、紅花和川芎的實(shí)驗(yàn)組生存率分別為41.1% (**P〈0.01)、50%(**Ρ〈0.01)和 54.4% (***Ρ〈0.001)，是對(duì)照組(16.7% )的 2.4,2.99 和 3.2 倍(圖 1Β)。上述結(jié)果說(shuō)明，瓜萎、紅花和)11芎提取物可緩解paraquat和H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，顯著地提高了果蠅的生存率。
[0023]實(shí)施例3瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)Paraquat處理后果蠅的腸細(xì)胞免疫染色結(jié)果和腸道干細(xì)胞細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量的影響
[0024]隨機(jī)收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組羽化4-5d的雌果蠅喂食含5%鹿糖的paraquat (IOmM)溶液16h，顯微鏡下提取10-12條果蠅腸道于多聚甲醛中，常溫固定30min，DAPI染色lOmin，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0025]結(jié)果顯示:喂食瓜萎、紅花和川芎的實(shí)驗(yàn)組中GFP陽(yáng)性細(xì)胞(前體細(xì)胞，包括腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞)數(shù)量顯著低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比分別減少了 47.1%、38.6%、31.3% (***P〈0.001)。結(jié)果見(jiàn)圖 2。
[0026]實(shí)施例4瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)果蠅壽命的影響
[0027]隨機(jī)收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組羽化4d的果蠅。雌雄分開(kāi)，每組30只。每2d更換一次培養(yǎng)基，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅死亡數(shù)，直至全部死亡。
[0028]結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，瓜萎提取物能夠延長(zhǎng)雌、雄果蠅壽命；紅花或川芎提取物只延長(zhǎng)雌果蠅壽命而對(duì)雄果蠅壽命影響不顯著，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0029]實(shí)施例5瓜萎、紅花和川芎提取物對(duì)30day老化果蠅的腸細(xì)胞免疫染色結(jié)果和腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量的影響[0030]隨機(jī)收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組羽化4d的雌果蠅培養(yǎng)30d后，顯微鏡下提取10-12條果蠅腸道于多聚甲醛中，常溫固定30min，DAPI染色lOmin，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0031]結(jié)果顯示:喂食瓜萎、紅花和川芎的實(shí)驗(yàn)組中GFP陽(yáng)性細(xì)胞(前體細(xì)胞，包括腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞)數(shù)量顯著低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比分別減少了 30.2%、28.6%、41.9% (***Ρ〈0.001)。結(jié)果見(jiàn)圖 4。
[0032]綜上所述，通過(guò)對(duì)果蠅的生存率、果蠅的壽命、腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量變化的分析，我們認(rèn)為瓜萎、紅花和川芎提取物可緩解果蠅腸道氧化損傷。
【權(quán)利要求】
1.瓜萎、紅花和川芎提取物在緩解果蠅腸道氧化損傷中的應(yīng)用，其特征在于，所述中草藥提取物均為水提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，給羽化3-5d的果蠅喂食paraquat(6mM)和H2O2 (1%)，瓜萎、紅花和)11芎提取物可提高果蠅生存率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，給羽化4-5d的雌果蠅喂食paraquat(IOmM)溶液16h，瓜萎、紅花和川芎提取物可減少腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，給羽化4d的雌、雄果蠅分別喂食瓜萎、紅花和川芎提取物，瓜萎提取物能夠延長(zhǎng)雌、雄果蠅壽命；紅花和川芎提取物只延長(zhǎng)雌果蠅壽命O
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，羽化4d的雌果蠅培養(yǎng)30d后，瓜萎、紅花和J11芎提取 物可減少衰老果蠅腸道干細(xì)胞和成腸細(xì)胞數(shù)量。
【文檔編號(hào)】A61K36/428GK103919839SQ201410155605
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】金麗華, 周洋 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 金麗華