一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途
【專利摘要】一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途：對甘草藥材進行脫脂；制備甘草粗多糖，再將其加水煮沸提取，將過濾后的上清液每100ml用0.4g活性炭60℃脫色，濃縮后再沉淀4小時，離心，干燥得到甘草粗多糖；進行分級醇沉：加水稀釋成濃度為2～5%甘草粗多糖溶液，溶脹、離心提取上清液，濃縮，沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積的1/6～1/8，將溶液的乙醇濃度調至75～85%后沉淀，離心15～25分鐘，取沉淀物淋洗后，干燥；純化：依次進行除去蛋白、超濾除鹽和冷凍干燥，即得到小分子甘草多糖。本發(fā)明純度高、服用劑量小，增強自身免疫功能從而表現出顯著的抗腫瘤能力。
【專利說明】一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小分子甘草多糖。特別是涉及一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途。
【背景技術】
[0002]近年來隨著社會的不斷發(fā)展，環(huán)境污染和人們的壓力越來越嚴重，患癌癥的病人的數量及人們患癌癥的幾率也在逐年大量增加。2010年8月第21屆世界抗癌大會上的數據顯示，中國每年癌癥發(fā)病人數約260萬，死亡180萬，在過去的30年中國癌癥死亡率增加了 80%。
[0003]常用癌癥治療方法為外科手術、放射治療、化學治療等。這些治療方法通常會導致癌癥病人身體衰弱、免疫力下降、炎癥反應等副作用影響。因此在癌癥治療期間服用具抗腫瘤及提高免疫作用的藥物來增強患者自身的免疫抗病能力就變得十分重要。因此在天然藥物中研究開發(fā)具抗腫瘤、提高免疫力活性，且副作用相對較低的產品就具有了很強的實際意義。
[0004]甘草為我國常用大宗藥材、藥食兼用品種，其又名國之藥老，有“十方九草”的美譽，其具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效，因此自古以來在臨床上大量使用。隨著現代糖化學技術的發(fā)展，甘草多糖作為甘草中藥活性物質之一也進入了人們的視野。國內外的研究者發(fā)現甘草多糖具有抗腫瘤及多種免疫增強功能(王忱，謝廣茹，史玉榮，等.甘草多糖的體內抑瘤作用及其機制的研究[J].臨床腫瘤學雜志，2003，8 (2):85-87.;王岳五，史玉榮，張海波，等.甘草殘渣中多糖GPS抗腫瘤作用的研究[J].南開大學學報，2000，33(4):46-48.)但是甘草全多糖具有服用劑量大，服用不方便的缺點。目前尚無對甘草中的多糖按分子量劃段精制后對其抗腫瘤活性進行綜合評價的報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種能夠提高治療效果、降低服用劑量、且具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖及其制備方法及用途。
[0006]本發(fā)明所采用的技術方案是:一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，包括如下步驟:
[0007]1)對甘草藥材進行脫脂；
[0008]2)制備甘草粗多糖，將脫脂后的甘草藥材加水煮沸提取2次，每次2小時，將過濾后的上清液每100mL用0.4g活性炭60°C脫色1~3小時，濃縮后再用70~80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時，離心，干燥得到甘草粗多糖；
[0009]3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加水稀釋成濃度為2~5%甘草粗多糖溶液，在室溫下溶脹、離心提取上清液，然后濃縮，用濃度50~60%乙醇醇沉沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積的1/6~1/8，再將溶液的乙醇濃度調至75~85%后沉淀，然后以4500r/min速度離心15~25分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗后，干燥；
[0010]4)純化:依次進行用sevage法除去蛋白、超濾除鹽和冷凍干燥，即得到小分子甘
草多糖。
[0011]步驟I)所述的脫脂是:將甘草藥材切片，用95%濃度乙醇提取2次，每次2小時，然后濾除渣自然風干；
[0012]每次的提取是選用5~8倍量的95%濃度乙醇進行提取。
[0013]在步驟2)所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脫脂后的甘草藥材5~15倍量。
[0014]步驟3)中所述的溶脹時間為2~3小時。
[0015]步驟3)中所述的將溶液的乙醇濃度調至75~85%后沉淀6小時。
[0016]所述小分子甘草多糖用于治療腫瘤藥物的用途。[0017]本發(fā)明的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途，純度高、月艮用劑量小，而且能夠更明顯的誘導體內淋巴因子表達，增強自身免疫功能從而表現出顯著的抗腫瘤能力。因此可以輔助癌癥治療，減輕放射治療和化學治療的副作用，使身體機能更快恢復，保證治療的順利完成。本發(fā)明能夠達到提高治療效果、降低服用劑量的目的。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例和附圖對本發(fā)明的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途做出詳細說明。
[0019]本發(fā)明的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法及用途，是將甘草藥材為原料，經乙醇脫脂后，藥材水提液再通過分級醇沉的方法將甘草多糖按分子量劃段，并通過活性試驗證實了小分子甘草多糖的抗腫瘤活性。再通過離心、干燥、脫蛋白、除鹽等手段得到精制小分子甘草多糖?；钚暂^弱的大分子甘草多糖在甘草總多糖中所占比重為60%，因此制備具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖，除去活性較弱的大分子多糖，可以達到提高治療效果、降低服用劑量的目的。
[0020]本發(fā)明的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，包括如下步驟:
[0021]I)對甘草藥材進行脫脂:
[0022]將甘草藥材切片，用95%濃度乙醇提取2次，每次是選用5~8倍量的95%濃度乙醇進行提取，每次2小時，然后濾過，除去濾液后濾渣自然風干；
[0023]2)制備甘草粗多糖:將脫脂后的甘草藥材加水煮沸提取2次，每次2小時，所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脫脂后的甘草藥材的5~15倍量。然后將過濾后的上清液每100mL加0.4g活性炭60°C脫色I~3小時，濃縮后再用70~80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時，離心，干燥得到甘草粗多糖；用70~80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時
[0024]3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加水稀釋成濃度為2~5%甘草粗多糖溶液，在室溫溶脹，所述的溶脹時間為2~3小時，離心，取上清液，然后濃縮，用濃度50~60%乙醇醇沉沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積的1/6~1/8，再將溶液的乙醇濃度調至75~85%后沉淀6小時，然后以4500r/min速度離心15~25分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗后，干燥；
[0025]4)純化:依次進行用sevage法除去蛋白、超濾除鹽和冷凍干燥，即得到小分子甘
草多糖。
[0026]采用本發(fā)明的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，制備的小分子甘草多糖可用于治療腫瘤藥物的用途。經實驗證明，所述小分子甘草多糖具有較大分子甘草多糖及甘草全多糖更高的抑瘤率。而且能顯著提高癌癥小鼠的脾臟指數和胸腺指數。
[0027]下面給出實體實例:
[0028]實施例一、
[0029]I)甘草藥材脫脂:將甘草藥材切片,5倍量95%乙醇提取2次，每次2小時，濾過，棄去濾液，濾渣自然風干。
[0030]2)制備甘草粗多糖，將脫脂后的甘草藥材加5倍量水煮沸提取2次，每次2小時，將過濾后的上清液每100mL用0.4g活性炭，在60°C下攪拌脫色，I小時，濾過除去活性炭，濾液濃縮后再用70%濃度乙醇醇沉4小時，離心，去掉上清液，沉淀，冷凍干燥，得到甘草粗多糖；
[0031]3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖每2g加入100mL水稀釋成為溶液，在室溫下溶脹2小時、離心，提取上清液，濃縮至該體積的1/2，用濃度50%乙醇醇沉，沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該體積的1/6，再將溶液的乙醇濃度調至75%后沉淀6h，然后放入冷凍離心機，以4500r/min速度離心15分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗后，冷凍干燥；
`[0032]4)純化:用sevage法除去蛋白、之后用超濾法除鹽，冷凍干燥，即得到小分子甘草多糖。
[0033]實施例二、
[0034]I)對甘草藥材進行脫脂:將甘草藥材切片凈制，用8倍量的濃度為95%的乙醇提取2次，每次2小時，濾過，棄去濾液，取濾渣，常溫風干；
[0035]2)制備甘草粗多糖:將脫脂后的甘草藥材加10倍量去離子水煮沸提取2次，每次2小時，濾過，取濾液，每100mL中加入0.4g活性炭，水浴加熱至60°C脫色3小時，濃縮后再用80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時，離心，棄去上清液，取沉淀，60°C真空干燥得到甘草粗多糖；
[0036]3)對甘草粗多糖進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加去離子水，稀釋成濃度為5%的溶液。在室溫下溶脹3小時，離心取上清液，濃縮，用濃度60%乙醇醇沉沉淀4小時，離心、除掉沉淀物，沉淀物為大分子多糖，取除掉沉淀物后的上清液進行濃縮至該體積的1/8，再將溶液的乙醇濃度調至85%，沉淀6小時，然后以4500r/min的速度離心25分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗，70°C真空干燥；
[0037]4)純化:依次用sevage法除去蛋白、超濾法除鹽后，冷凍干燥，即得到小分子甘草多糖。
[0038]實施例三:
[0039]I)對甘草藥材進行脫脂；將甘草藥材切片、凈制，用6倍量的濃度為95%的乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，棄去濾液，將濾渣自然風干，為脫脂后的甘草藥材；
[0040]2)制備甘草粗多糖，將脫脂后的甘草藥材加10倍量水煮沸提取2次，每次2小時，將過濾后的上清液每100mL加入0.4g活性炭，加熱至60°C脫色2小時，過濾夠去掉濾渣，將上清液濃縮后再用80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時，離心，棄去上清液，沉淀烘干得到甘草粗多糖；
[0041]3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加水稀釋成濃度為3%的甘草粗多糖溶液，在室溫下溶脹2小時。離心提取上清液，濃縮上清液，用濃度60%的乙醇醇沉沉淀4小時，沉淀為大分子多糖，離心、除掉沉淀，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積的1/7，再將溶液的乙醇濃度調至75%后沉淀6小時，然后以4500r/min速度離心20分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗去除雜質，干燥；
[0042]4)純化:用sevage法除去小分子多糖中的蛋白、用超濾法除去除蛋白后的小分子多糖中的鹽，冷凍干燥，得到小分子甘草多糖。
[0043]實施例四:
[0044]I)對甘草藥材進行脫脂；將甘草藥材凈制，切片，厚度在0.3厘米左右，加入95%濃度乙醇5倍量提取2小時，兩次，濾過，取濾渣自然風干，得到脫脂后的甘草藥材；
[0045]2)制備甘草粗多糖，將脫脂后的甘草藥材加15倍量去離子水煮沸提取2次，每次2小時，濾過，取上清液每100mL用0.4g活性炭60°C脫色3小時，濾過除去活性炭，將濾液濃縮后再用80%濃度乙醇醇沉，沉淀4小時，離心，棄去上清液，沉淀干燥得到甘草粗多糖；
[0046]3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加去離子水稀釋成濃度為4%甘草粗多糖水溶液，在室溫下溶脹3小時。離心，提取上清液，濃縮，用濃度60%乙醇醇沉，沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積 的1/6，再將溶液的乙醇濃度調至80%，靜置6小時，使用高速冷凍離心機以4500r/min速度離心，20分鐘，棄去上清液，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗后，冷凍干燥；
[0047]4)純化:依次進行用sevage法除去蛋白、超濾法除鹽、冷凍干燥，得到小分子甘草多糖。
[0048]小分子甘草多糖對C-26腫瘤小鼠的影響
[0049]1.實驗樣品的制備
[0050]將粗甘草多糖使用分級醇沉的方法劃分為大分子甘草多糖部分、小分子甘草多糖部分以及全甘草多糖，分別命名為GP-A、GP-B、GP-C。陽性對照藥物為環(huán)磷酰胺。
[0051]2.動物分組和灌胃劑量的設計
[0052]選用體重18g~27g的C-26雌性、雄性腫瘤小鼠各50只，各自隨機均分為5組，每組雄性10只，雌性10只。即GP-A組、GP-B組、GP-C組、空白對照組以及陽性對照組，除陽性對照組采取腹腔注射200mg/kg/d外，其余四組適應性飼養(yǎng)3天后開始灌胃，灌胃劑量均為500mg/kg/d。每天觀察小鼠的腫瘤大小、精神、毛發(fā)等狀況。每隔5天進行一次稱重。
[0053]3.解剖取材
[0054]連續(xù)給予受試物14天，末次給藥30min后，將小鼠頸椎脫臼處死，解剖取腫瘤組織和胸腺、脾臟稱重。分別計算胸腺指數(mg胸腺重/g體重)、脾臟指數(mg脾臟重/g體重)，并計算抑瘤率。
[0055]4.結論
[0056]實驗結果見附表。小分子甘草多糖的抑瘤率比大分子量甘草多糖及甘草全多糖高，提示小分子量的甘草多糖是甘草多糖中主要活性物質。且小分子甘草多糖能提高癌癥小鼠的脾臟指數和胸腺指數，并與陰性對照組相比有顯著性差異。說明小分子甘草多糖具有增強腫瘤小鼠的自身免疫力的能力。
[0057]
【權利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)對甘草藥材進行脫脂； 2)制備甘草粗多糖，將脫脂后的甘草藥材加水煮沸提取2次，每次2小時，將過濾后的上清液每100mL用0.4g活性炭60°C脫色I~3小時，濃縮后再用70~80%濃度乙醇醇沉沉淀4小時，離心，干燥得到甘草粗多糖； 3)進行分級醇沉:將得到的甘草粗多糖加水稀釋成濃度為2~5%甘草粗多糖溶液，在室溫下溶脹、離心提取上清液，然后濃縮，用濃度50~60%乙醇醇沉沉淀4小時，離心、除掉沉淀的大分子多糖，取除掉大分子多糖后的上清液進行濃縮至該除掉大分子多糖后的上清液體積的1/6~1/8，再將溶液的乙醇濃度調至75~85%后沉淀，然后以4500r/min速度離心15~25分鐘，取沉淀物用95%濃度乙醇淋洗后，干燥； 4)純化:依次進行用sevage法除去蛋白、超濾除鹽和冷凍干燥，即得到小分子甘草多糖。
2.根據權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的脫脂是:將甘草藥材切片，用95%濃度乙醇提取2次，每次2小時，然后濾除渣自然風干。
3.根據權利 要求2所述的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，每次的提取是選用5~8倍量的95%濃度乙醇進行提取。
4.根據權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，在步驟2)所述的加水煮沸提取2次中，每一次煮沸所加的水是脫脂后的甘草藥材5~15倍量。
5.根據權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的溶脹時間為2~3小時。
6.根據權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的將溶液的乙醇濃度調至75~85%后沉淀6小時。
7.—種權利要求1所述的具有抗腫瘤活性的小分子甘草多糖的用途，其特征在于，所述小分子甘草多糖用于治療腫瘤藥物的用途。
【文檔編號】A61K31/715GK103864952SQ201410131378
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權日:2014年4月2日
【發(fā)明者】李薇, 宋新波, 余河水 申請人:天津中醫(yī)藥大學, 天津中一制藥有限公司