一種重組豬防御素及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組豬防御素，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，本發(fā)明還公開了表達重組豬防御素的工程菌及其發(fā)酵方法和發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明重組豬防御素的抗菌活性高，可以用于制備抗菌藥物，本發(fā)明工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性高，安全，營養(yǎng)價值高，可用于制備抗菌飼料添加劑，工藝步驟簡單，成本低廉，具有良好的工業(yè)應用前景。
【專利說明】一種重組豬防御素及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組豬防御素及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]抗菌肽(AntibacterialPeptides, ABPs),又稱抗微生物肽(AntimicrobialPeptides, AMPs),廣義上是指廣泛存在于生物體內(nèi)具有抵御外界微生物侵害，清除體內(nèi)突變細胞的一類小分子多肽，是生物先天免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，在黏膜免疫系統(tǒng)中起重要作用，稱之為“第一道防御體系”或“第一道免疫體系”?？咕膹V泛存在于細菌、植物、無脊椎動物及脊椎動物體內(nèi)，不僅具有廣譜抗細菌能力，而且對真菌、病毒及癌細胞也有一定殺抑作用。此外，還具有穩(wěn)定、水溶性好、抗菌機理獨特、無耐藥性、對高等動物正常細胞無害等特點，從而顯示了其在醫(yī)學和農(nóng)業(yè)上潛在的研究和應用價值。
[0003]豬防御素屬于抗菌肽家族的一員，其抗菌活性好，但是豬體內(nèi)天然防御素表達量低、分子小，分離困難，化學合成防御素成本高，所以利用分子生物學技術重組表達外源基因是獲取目標蛋白的有效途徑。
[0004]彭章華等，“豬 防御素PBD-1基因的克隆及其表達載體構建”，遺傳繁育，中國畜牧獸醫(yī)，2005年第32卷第11期以及羅剛等，“豬防御素基因PBD-1在大腸桿菌中的重組和融合表達”，遺傳2003年第2卷第25期中，均公開了構建豬防御素基因PBD-1重組表達載體的方法，但是均未表達得到有活性的重組豬防御素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種有抑菌活性的重組豬防御素及其制備方法。
[0006]本發(fā)明重組豬防御素的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]編碼如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2或者SEQ IDN0.3所示。
[0008]本發(fā)明提供了 SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明提供了一種重組載體，它包括SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。所述的重組載體優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體PPIC9。
[0010]本發(fā)明提供了一種重組菌，它包括前述的重組載體。所述重組菌優(yōu)選為重組畢赤酵母。
[0011]本發(fā)明提供了前述重組菌的發(fā)酵方法，它是將前述重組菌在酵母菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，甲醇誘導表達，即可。
[0012]其中，前述發(fā)酵方法包括如下步驟:
[0013](I)菌體生長:將重組菌置于BMGY培養(yǎng)基中，于25~35°C培養(yǎng)36~60h,離心收集菌體；
[0014](2)誘導表達:再用BMMY誘導培養(yǎng)基懸浮菌體，在25~35°C下誘導培養(yǎng)48~120h。[0015]BMGY培養(yǎng)基，其配方如下:2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ (無氨基酵母氮源)，4Χ 10_5%生物素，1%甘油；
[0016]BMMY誘導培養(yǎng)基，其配方如下:2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸鉀緩沖液(ρΗ6.0)，1.34%ΥΝΒ (無氨基酵母氮源)，4Χ 10_5%生物素，0.5%甲醇。
[0017]優(yōu)選地，步驟(1)中，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時間為60h ;步驟(2)中，培養(yǎng)溫度為30°C，誘導時間為96h。
[0018]其中，前述發(fā)酵方法包括如下步驟:它包括如下步驟:
[0019]1、制備種子:將重組菌置于Yr o培養(yǎng)基中，于25~35°C搖瓶培養(yǎng)24~48h，收集菌液；
[0020]I1、接種:以4~6%的接種量接種到BMGY培養(yǎng)基中，在25~35°C條件下振蕩培養(yǎng);
[0021]II1、補料:待碳源耗盡后，加入濃度為25% (w/v)葡萄糖溶液3.2~3.6L ;
[0022]IV、誘導表達:補料結束后，流加甲醇誘導表達，甲醇的濃度維持在0.5%，誘導表達的時間為48~120h。
[0023]YPD培養(yǎng)基，其配方如下:1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
[0024]優(yōu)選地，步驟I中，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為24h ；
[0025]步驟II中，接種量為5% ;培養(yǎng)溫度為30°C ；
[0026]步驟III中，葡萄糖溶液的加入量為3.4L ；
[0027]步驟IV中，誘導表達的時間為120h。
[0028]本發(fā)明還提供了前述任意一項方法制得的發(fā)酵產(chǎn)物。
[0029]本發(fā)明還提供了前述蛋白的制備方法，它是取前述發(fā)酵產(chǎn)物，靜置，得上清，分離純化，即得。
[0030]所述分離純化的方法包括如下步驟:
[0031]a、將上清液用濃度為20~90% (w/v)硫酸銨溶液鹽析兩次，脫鹽；
[0032]b、加入磷酸緩沖液，采用陰離子交換柱純化，得流穿液；
[0033]C、調(diào)流穿液的pH為5.0~5.4，采用陽離子交換柱純化，以濃度為0.8~1.2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液；
[0034]d、在洗脫液中加入4~8的％硫酸銨，采用疏水層析純化，脫鹽，干燥，用pH為
6.7~7.1的磷酸鈉和氯化鈉的混合溶液重溶，混合溶液中，磷酸鈉的濃度為15~25mmol/L,氯化鈉的濃度為0.05~0.15mmol/L ；
[0035]e、分子篩純化；
[0036]f、高效液相色譜純化，即可。
[0037]優(yōu)選地,步驟a中，兩次鹽析采用的硫酸銨濃度依次為70% (w/v)和65% (w/v)；
[0038]步驟b中,所述陰離子交換柱為Q-Sepharose陰離子交換柱；
[0039]步驟c中,所述pH為5.2,所述陽離子交換柱為S-Sepharose陽離子交換柱,所述氯化鈉溶液的濃度為lmol/L ；
[0040]步驟d中，所述硫酸銨的濃度為6%,疏水層析的介質(zhì)為Phenyl SepharoseCL_4B ；混合溶液的PH為6.9，磷酸鈉的濃度為20mmol/L，氯化鈉的濃度為0.01mmol/L
[0041]步驟e中，所述分子篩為Sephacryl S-100HR分子篩；[0042]步驟f中，高效液相色譜的條件如下:固定相:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相A:乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的濃度為10%，三氟乙酸的濃度為0.1% ;流動相B:乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的濃度為90%，三氟乙酸的濃度為0.07% ;洗脫條件:0-8min，流動相B的用量為15% ；8-35min,流動相B用量為40% ；35-55min,流動相B的用量為85%;55min后，流動相B的用量為15% ;檢測波長:220nm。
[0043]本發(fā)明還提供了前述蛋白或者發(fā)酵產(chǎn)物在制備抗菌藥物或者抗菌飼料添加劑中的應用。
[0044]本發(fā)明從豬防御素基因出發(fā)，用基因工程的方法制備得到具有抑菌活性的重組豬防御素，其抗菌活性高，可用于制備抗菌藥物；采用本發(fā)明工程菌(含有SEQ ID N0.2所述基因片段的重組菌)表達得到的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性高，發(fā)酵罐(5L)發(fā)酵得到的產(chǎn)物效價高達2000IU/ml,安全,營養(yǎng)價值高,可用于制備抗菌飼料添加劑,工藝步驟簡單,成本低廉，具有良好的工業(yè)應用前景。
[0045]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基 本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0046]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1陽性轉化子的PCR檢測結果。泳道1:DNA分子量，泳道2-7，10，11為陽性克隆子，泳道8，9為陰性克隆子；
[0048]圖2發(fā)酵產(chǎn)物活性隨著誘導時間增加的變化情況；
[0049]圖3發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌圈實驗結果，I為陰性對照(無菌水)，2，3，4，5，6，7，8為發(fā)酵
產(chǎn)物上清液。
[0050]圖4發(fā)酵產(chǎn)物的電泳結果；
[0051]圖5分子篩純化的色譜圖，色譜圖中加入maker，以標記本發(fā)明收集產(chǎn)物的分子量;
[0052]圖6高效液相色譜圖；
[0053]圖7瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中，泳道1:發(fā)酵產(chǎn)物上清；泳道2:鹽析沉淀；泳道3:純品溶液；
[0054]圖8純品溶液的抑菌圈實驗結果，1,3,9陰性對照(無菌水)，樣2，5，7為發(fā)酵產(chǎn)物上清液，4，6，8為純品溶液。
【具體實施方式】
[0055]本發(fā)明抑菌活性的測定均采用如下方法:
[0056]1.原理
[0057]本法基于待測物質(zhì)的殺菌抑菌能力，利用在特定條件下一定濃度的待測物質(zhì)在含有微生物的培養(yǎng)基內(nèi)擴散并形成固定大小的抑菌區(qū)域的原理進行測定，同時通過微生物檢定法二劑量法計算待測物質(zhì)相當于標準抗菌物質(zhì)的效價單位。[0058]2.參考文獻及標準
[0059]《中華人民共和國獸藥典》2010版——抗生素微生物鑒定法(QB2394-2007食品添加劑乳酸鏈球菌素)
[0060]3.試劑
[0061]3.1底層瓊脂1.5g瓊脂，加水至IOOmL, 115。。，滅菌20min。
[0062]3.2上層瓊脂:蛋白胨1.0g,酵母浸粉0.5g，NaCll.0g,加水至IOOmL,瓊脂糖1.5g, ρΗ7.0,115°C，滅菌 20min。
[0063]3.3LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCll.0g，加水至lOOmL，瓊脂1.5g, ρΗ7.0,115°C，滅菌 20min。
[0064]3.4LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCll.0g，加水至IOOmL, 115。。，pH7.0,滅菌 20min。
[0065]3.5 磷酸緩沖液:K2HP042.0g, ΚΗ2Ρ048.0g，加蒸餾水定容至 1000mL,過濾，115°C,30min,備用。
[0066]3.6指示菌:購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，大腸埃希氏菌CICC編號10389。
[0067]4.分析步驟
[0068]4.1指示菌的活化
[0069]按照試劑3.4的配方，配置30mL的培養(yǎng)液，取出一支指示菌，吸取ImL無菌水加入其中并充分混勻，最后轉接ImL指示菌菌懸液于培養(yǎng)液中，放入搖床，200rpm, 37°C，培養(yǎng)18h。取出培養(yǎng)好的指示菌菌懸液，600nm下用無菌蒸餾水調(diào)零，測定其OD值，如果OD值介于1.5—2.0，菌懸液的加入量為40微升每IOmL上層培養(yǎng)基，如果OD值在2.0—2.5之間，菌懸液加入量為35微升每IOmL上層培養(yǎng)基。
[0070]4.2標準品液的制備
[0071 ] 4.2.1硫酸粘桿菌素標準液
[0072]準確稱取硫酸粘桿菌素標準品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量22156U/mg) 0.0360g,用試劑3.5磷酸緩沖液定容至10mL，2000rpm，離心10min后再稀釋10倍后作為高劑量濃度，并將其稀釋I倍，使之配成高低劑量兩個濃度梯度溶液。
[0073]4.2.2待測物質(zhì)供試品
[0074]準確稱取待測物質(zhì)3.8000g,并溶于6.2mL的磷酸緩沖液當中，混勻，2000rpm，離心lOmin，留上清液作為高劑量濃度，并將其稀釋I倍，使之配成高低劑量兩個濃度梯度溶液。
[0075]4.3平板的制備
[0076]用無菌20mL移液管移取15mL的平板試劑3.1底層瓊脂于平板上,將平板放置于水平的操作臺上至冷卻，備用。
[0077]加熱融化試劑3.2上層瓊脂，呆冷卻置50°C時(剛好不燙手的溫度)，按步驟4.1指定量加入大腸桿菌懸液，搖勻后置于50°C恒溫水浴鍋中，用無菌IOmL移液管每次精確移取IOmL試劑3.2上層瓊脂注入含底層瓊脂的平板上，迅速輕放于于水平操作臺上至冷卻，保證瓊脂膠凝后效價測定培養(yǎng)基平面的平整度。
[0078]4.4 上樣[0079]用直尺將平板劃分為均勻的四份，在每個制備好的平板中以等距離安置牛津杯4個。樣品和標準品的高低劑量分別以對角形式加入，加入量為160微升。上樣完成后，放入培養(yǎng)箱，用事先烘干(烘箱120°C，2h)的陶瓦蓋代替平板上蓋蓋好平板，37°C，培養(yǎng)6h。實驗
重復5組。
[0080]4.5測量及結果計算
[0081]將平板取出，倒出牛津杯，將平板放置在一個黑色背景的平臺上，用游標卡尺測量各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式I計算效價，或使用二劑量法生物效價測定軟件計
算[0083]式中:
[0084]CSH——樣品溶液的效價，單位為U/mg ;
【權利要求】
1.一種蛋白，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； 優(yōu)選地，編碼如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDN0.2或者SEQ IDN0.3所示。
2.SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
3.一種重組載體，其特征在于:它包括SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列； 優(yōu)選地，所述重組載體是重組畢赤酵母表達載體PPIC9。
4.一種重組菌，其特征在于:它包括權利要求4或5所述的重組載體；優(yōu)選地，所述重組菌為重組畢赤酵母。
5.一種發(fā)酵方法，其特征在于:它是將權利要求6或者7所述的重組菌，置于酵母菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，甲醇誘導表達，即得到包含權利要求1所述蛋白的發(fā)酵產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)菌體生 長:將重組菌接種到BMGY培養(yǎng)基中，于25~35°C培養(yǎng)36~60h，離心收集菌體； (2)誘導表達:再用BMMY誘導培養(yǎng)基懸浮菌體，在25~35°C下誘導培養(yǎng)48~120h； 優(yōu)選地，步驟(1)中，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時間為60h ;步驟(2)中，培養(yǎng)溫度為30°C，誘導時間為96h。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:它包括如下步驟: I、制備種子:將重組菌接種至Yro培養(yǎng)基中，于25~35°C搖瓶培養(yǎng)24~48h，收集菌液； II、接種:以4~6%v/v的接種量接種到BMGY培養(yǎng)基中，在25~35°C條件下振蕩培養(yǎng); III、補料:待碳源耗盡后，加入濃度為25%(w/v)葡萄糖溶液3.2~3.6L ; IV、誘導表達:補料結束后，流加甲醇誘導表達，甲醇的濃度維持在0.5%，誘導表達的時間為48~120h ； 優(yōu)選地，步驟I中，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為24h ； 步驟II中，接種量為5% ;培養(yǎng)溫度為30°C ； 步驟III中，葡萄糖溶液的加入量為3.4L ； 步驟IV中，誘導表達的時間為120h。
8.權利要求5~8任意一項方法制得的保護權利要求1所述蛋白的發(fā)酵產(chǎn)物。
9.一種制備權利要求1所述蛋白的方法，其特征在于:它是取權利要求13所述的發(fā)酵產(chǎn)物的上清，分離純化，即可； 優(yōu)選地，所述分離純化的方法包括如下步驟: a、將上清液用濃度為20~90%(w/v)硫酸銨溶液鹽析兩次，脫鹽； b、加入磷酸緩沖液，采用陰離子交換柱純化，收集流穿液； C、調(diào)流穿液的pH為5.0~5.4，采用陽離子交換柱純化，以濃度為0.8~1.2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液； d、在洗脫液中加入4~8的％硫酸銨，采用疏水層析純化，脫鹽，干燥，用pH為6.7~7.1的磷酸鈉和氯化鈉的混合溶液重溶，混合溶液中，磷酸鈉的濃度為15~25mmol/L,氯化鈉的濃度為0.05~0.15mmol/L ； e、分子篩純化； f、高效液相色譜純化，即可。 進一步優(yōu)選地，步驟a中,兩次鹽析采用的硫酸銨濃度依次為70% (w/v)和65% (w/v)； 步驟b中,所述陰離子交換柱為Q-Sepharose陰離子交換柱； 步驟c中，所述PH為5.2，所述陽離子交換柱為S-Sepharose陽離子交換柱，所述氯化鈉溶液的濃度為lmol/L ； 步驟d中，所述硫酸銨的濃度為6%,疏水層析的介質(zhì)為Phenyl SepharoseCL_4B ;混合溶液的PH為6.9，磷酸鈉的濃度為20mmol/L，氯化鈉的濃度為0.0ImmoI/L 步驟e中，所述分子篩為Sephacryl S-100HR分子篩； 步驟f中，高效液相色譜的條件如下:固定相:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相A:乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的濃度為10%，三氟乙酸的濃度為0.1% ;流動相B:乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的濃度為90%，三氟乙酸的濃度為0.07% ;洗脫條件:0-8min，流動相B的用量為15% ;8-35min，流動相B用量為40% ;35_55min，流動相B的用量為85%;55min后，流動相B的用量為15% ;檢測波長:220nm。
10.權利要求1所述的蛋白或者權利要求8所述的發(fā)酵產(chǎn)物在制備抗菌藥物或者抗菌飼料添加劑中的應用 。
【文檔編號】A61P31/04GK103965343SQ201410036717
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2013年1月25日
【發(fā)明者】李鋼, 王小忠, 王小行 申請人:四川華德生物工程有限公司