一種具有抗真菌活性的馬甲子提取物及其各類制劑與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗真菌活性的馬甲子提取物及其各類制劑與應(yīng)用。本發(fā)明是將馬甲子全株植物或其中任一部位用溶劑提取含有萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類(包括萜類、黃酮類、生物堿類和香豆素類的苷類和單體)和多糖類的成分，然后收集提取液，濃縮干燥后制得馬甲子提取物；并由馬甲子提取物制備出馬甲子提取物片劑、顆粒劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。本發(fā)明的具有抗真菌活性的馬甲子提取物和各類制劑應(yīng)用于抗真菌藥物的制備。
【專利說明】—種具有抗真菌活性的馬甲子提取物及其各類制劑與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及的是一種具有抗真菌活性的馬甲子提取物及其各類制劑與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人口的增多，環(huán)境污染的加重，由真菌引起的各類疾病，如各種甲癬、皮癬等，成為了人類的多發(fā)病。此類疾病發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)真菌病的發(fā)病率高達(dá)78%。真菌病分為淺部真菌病和深部真菌病兩大類。淺部真菌感染又稱為皮膚癬菌病，是一種頑固難治、重新感染率較高的慢性皮膚病，占真菌病總發(fā)病率的80%以上；深部真菌病主要是真菌侵犯皮下組織、粘膜和內(nèi)臟，以白色念珠菌感染為主。真菌病病程長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高，需要患者長(zhǎng)期用藥。臨床上治療此類疾病一般采用軟膏劑局部涂抹治療，或者口服抗生素全身治療。其中純西藥占了很大的比例，中藥卻很少。
[0003]中藥在治療微生物感染性疾病具有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥作用緩和，毒副作用小，標(biāo)本兼顧，適于慢性病或體質(zhì)虛弱患者長(zhǎng)期服用，同時(shí)還可大大降低或延緩微生物耐藥性的發(fā)生。一些具有抗真菌作用的中藥都申請(qǐng)了專利，例如:專利CN102631379A公開了紅豆杉活性提取物的制備方法及其抗真菌的應(yīng)用；專利CN1895331A公開了地錦草有效部位及其有效成分在制備抗真菌作用的藥物的用途；類似的還有CN103155958等?？梢?，中藥在抗真菌作用方面具有的潛在效果。
[0004]馬甲子(Paliurus ramosissimus (Lour.)Poir)為落葉灌木，是一種常見藥用植物，據(jù)報(bào)道枝葉根花果均藥 用。性味苦、平，無毒。能除寒活血，發(fā)表解熱，消腫，治跌打損傷及心腹疼痛。收載于《中藥大辭典民間》及一些地方藥物志。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種具有抗真菌活性的馬甲子提取物及其各類制劑與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種具有抗真菌活性的馬甲子提取物，其制備方法為:取馬甲子全株植物或其中任一部位，加入馬甲子體積的1-20倍的甲醇或乙醇提取，或者將甲醇或乙醇提取物進(jìn)一步用乙酸乙酯或石油醚提??；提取液濃縮后干燥，制得馬甲子提取物。
[0008]所述的馬甲子為鮮品、冷凍干燥品或甲醇或乙醇處理的樣品；所述的提取方法為浸潰、回流或滲漉；所述的干燥方法為減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥或微波干燥。
[0009]所述制得的馬甲子提取物包括萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類及萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類的苷類和單體。
[0010]所述的馬甲子提取物的各類制劑包括馬甲子提取物片劑、顆粒劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。
[0011]所述的馬甲子提取物應(yīng)用于抗真菌藥物的制備。[0012]所述的馬甲子提取物的各類制劑的應(yīng)用于抗真菌藥物的制備。
[0013]本發(fā)明提供的具有抗真菌活性的馬甲子提取物和各類制劑在抗真菌活性的應(yīng)用。所述中藥提取物為馬甲子甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚或類似溶媒提取物。所述馬甲子應(yīng)為鮮品、冷凍干燥品、甲醇(乙醇)或其他有機(jī)溶媒預(yù)處理樣品，以確保有效成分的穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0015]實(shí)施例馬甲子提取物的制備
[0016]1、馬甲子乙醇提取物的制備
[0017](I)取馬甲子全株植物(或其中任一部位)鮮品1kg，加入馬甲子體積的8倍的95% (體積濃度)乙醇浸泡1-2天后，將葉、根和莖粉碎，再用馬甲子體積的12倍95%乙醇提取浸潰3天，收集提取液，減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得馬甲子乙醇提取物。
[0018](2)取馬甲子全株植物鮮品(或其中任一部位)Ikg,粉碎，加入馬甲子體積的8倍的95%乙醇回流提取3次，收集提取液，減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得馬甲子乙醇提取物。
[0019](3)取馬甲子全株植物鮮品(根、莖、葉等)1kg，冷凍干燥后粉碎(也可粉碎后冷凍干燥)，加入馬 甲子體積的10倍的95%乙醇回流提取3次，收集提取液，減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得馬甲子乙醇提取物。
[0020]2、馬甲子甲醇提取物的制備
[0021]取馬甲子全株植物鮮品1kg，粉碎，加入馬甲子體積的6倍的甲醇回流提取3次，收集提取液，減壓回收甲醇，濃縮液冷凍干燥即得馬甲子甲醇提取物。
[0022]3、馬甲子石油醚提取物的制備
[0023](I)馬甲子乙醇提取物的濃縮溶液，用石油醚萃取，回收石油醚干燥。
[0024](2)馬甲子甲醇提物干燥樣品，加10倍水混懸，用石油醚萃取，回收石油醚后干燥。
[0025](3)馬甲子乙醇提取物干燥樣品，用10倍石油醚回流提取，回收石油醚干燥。
[0026]4、馬甲子乙酸乙酯提取物的制備
[0027](I)馬甲子乙醇提取物的濃縮溶液，用10倍石油醚萃取后再用10倍乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后干燥。
[0028](2)馬甲子甲醇提物干燥樣品，加10倍倍水混懸，用10倍石油醚萃取后再用10倍乙酸乙酯萃取?；厥找宜嵋阴ズ蟾稍铩?br> [0029](3)馬甲子乙醇提取物干燥樣品，用6倍乙酸乙酯回流提取2次，回收乙酸乙酯后干燥。
[0030]2、馬甲子乙酸乙酯提取物片劑的制備
[0031]取300g馬甲子乙酸乙酯提取物，粉碎后，過40目篩，加入100g微晶纖維素，57.5g乳糖，20g交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，混勻后，均勻噴灑體積濃度為95 %乙醇溶液適量，濕法擠壓制粒，過24目篩，50°C烘干后，再加入20g交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和2.5g的硬脂酸鎂，充分混勻后，壓片，得到馬甲子乙酸乙酯提取物片劑；[0032]3、馬甲子乙醇提取物顆粒劑的制備
[0033]取1000g馬甲子乙醇提取物，粉碎后，過40目篩，加入4000g糖粉，混勻后，均勻噴灑體積濃度為95%乙醇溶液適量，濕法擠壓制粒，過24目篩，50°C烘干后，整粒，得到馬甲子乙醇提取物顆粒劑；
[0034]4、馬甲子甲醇提取物軟膏劑的制備
[0035]稱取115g十八醇、115g白凡士林、70g單硬脂酸甘油酯，加熱融化，得到油相，加入40g馬甲子甲醇提取物；另取100g甘油、15g十二烷基硫酸鈉、0.01g鹽酸半胱氨酸,加入650ml水溶解，得到水相；分別加熱至75°C~80°C，攪拌下將水相緩緩加入油相，然后繼續(xù)攪拌15分鐘，得到馬甲子甲醇提取物軟膏劑。
[0036]5、馬甲子乙醇提取物凝膠劑的制備
[0037]取IOg卡波姆撒入420ml純化水中，攪拌使溶脹，加入100ml丙二醇攪拌溶解，攪拌下滴加18g三乙醇胺，制成凝膠基質(zhì)；另取100g馬甲子乙醇提取物與2g羥苯乙酯溶解于350ml乙醇中，攪拌下加入凝膠基質(zhì)中，攪勻即得。
[0038]6、馬甲子乙醇提取物涂膜劑的制備
[0039]取40g聚乙烯醇124溶脹于400ml純化水中；另取100g馬甲子乙醇提取物溶于400ml乙醇中，再加入100m l甘油，攪拌均勻后緩緩加入聚乙烯醇溶液中，攪勻后過濾，再自濾器上加乙醇至1000ml，即得。
[0040]7、馬甲子石油醚提取物搽劑的制備
[0041]取100g馬甲子石油醚提取物細(xì)粉置于研缽中，加入500ml花生油研勻，再緩緩加入飽和氫氧化鈣水溶液至1000ml，研磨至均勻白色乳狀物即得。
[0042]8、馬甲子乙醇提取物洗劑的制備
[0043]取100g馬甲子乙醇提取物細(xì)粉置于研缽中，加入50ml甘油和適量純化水，研磨成糊狀，逐漸加入純化水至全量混勻即得。
[0044]二、馬甲子乙醇提取物的成分研究
[0045]樣品供試液的配制:取實(shí)施1(1)中的馬甲子乙醇提取物樣品lg，溶于25ml無水乙醇中，離心。取上清液2ml，用無水乙醇稀釋5倍，至終濃度為0.008g/mi。
[0046]1、三萜類成分的檢識(shí)
[0047](I) L-B 反應(yīng)
[0048]將樣品溶于乙酸酐中，加濃硫酸-乙酸酐(I: 20)數(shù)滴，可產(chǎn)生黃一紅一紫一藍(lán)等顏色變化，最后褪色，表明含有三萜類化合物。
[0049](2) Kahlenberg 反應(yīng)
[0050]將樣品供試液點(diǎn)于濾紙上，噴20%五氯化銻的氯仿溶液(或三氯化銻飽和的氯仿溶液)，干燥后60-70°C加熱，顯藍(lán)色，表明含有三萜類化合物。
[0051](3) R-H 反應(yīng)
[0052]將樣品供試液滴在濾紙上，噴出體積濃度為25%三氯乙酸乙醇溶液，加熱至IOO0C,顯紅色，逐漸變?yōu)樽仙?，表明含有三萜類化合物?br> [0053](4) Salkowki 反應(yīng)
[0054]將乙醇提取物樣品溶于氯仿，加入濃硫酸后，在硫酸層呈現(xiàn)紅色或藍(lán)色，氯仿層有綠色熒光出現(xiàn)，表明含有三萜類化合物。[0055](5) Tschugaeff 反應(yīng)
[0056]將乙醇提取物樣品溶于冰乙酸中，加乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色，表明含有三萜類化合物。
[0057]2、黃酮類成分的檢識(shí)
[0058](I)鹽酸-鎂粉還原反應(yīng)(還原反應(yīng)顯色)
[0059]取少量乙醇提取物樣品溶于ImL乙醇中，加入少許鎂粉及濃鹽酸，振蕩片刻，觀察反應(yīng)顏色呈紫紅色，表明含有黃酮類化合物。
[0060](2)三氯化鋁反應(yīng)(金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)顯色)
[0061]用玻璃棒蘸取乙醇提取物樣品供試液涂于濾紙上，吹干，噴I %的三氯化鋁乙醇溶液，吹干，觀察現(xiàn)象。置紫外燈下顯鮮黃色，表明含有黃酮類化合物。
[0062](3)三氯化鐵反應(yīng)(金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)顯色)
[0063]用玻璃棒蘸取樣品供試液涂于濾紙上，吹干，在紫外燈下觀察熒光后，噴3%的三氯化鐵乙醇溶液，吹干，出現(xiàn)暗藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，再經(jīng)氨熏后轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣珶晒獍唿c(diǎn)，表明含有黃酮類化合物。
[0064](4)堿性試劑顯色
[0065]用玻璃棒蘸取樣品供試液涂于濾紙上，干燥后，噴以氫氧化鈉水溶液或暴露于氨蒸汽中，在日光燈下觀察時(shí)，氨蒸汽能使樣品色點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榱咙S色，表明含有黃酮類化合物。
[0066]3、生物堿類成分的檢識(shí)
[0067](I)改良碘化秘鉀(Dragendorff)法
[0068]①次硝酸鉍0.85g溶于IOml冰醋酸與40ml水中?、诘饣?g溶于20ml水中。試液①與試液②等量混合置棕色瓶?jī)?nèi)保存作貯備液。用前將Iml貯備液、4ml冰醋酸與12ml水混合。將樣品供試液加入上述試劑中，呈紅棕色溶液，加蒸餾水一搖即有沉淀產(chǎn)生，表明含有生物堿類化合物。
[0069](2)碘-碘化鉀(Wagner)法
[0070]碘Ig與碘化鉀IOg溶于50ml /K，加2ml乙酸,加水至100ml。取上述試劑適量,加A Iml甲醇提取物樣品供試液即顯棕褐色，表明含有生物堿類化合物。
[0071](3)娃鶴酸(^Bertrand)法
[0072]5g硅鎢酸溶于100ml水中，加濃鹽酸少量調(diào)至pH = 2左右。取上述試劑適量，加A Iml甲醇提取物樣品供試液即顯棕褐色，表明含有生物堿類化合物。
[0073]4、香豆素類成分的檢識(shí)
[0074](I)異羥肟酸鐵反應(yīng)
[0075]①a.鹽酸輕胺20g溶于50ml水,用乙醇稀釋至200ml,冷處保存；b.氫氧化鉀50g溶于少許水中，加500ml乙醇。②氯化鐵(FeC13 ? 6H20) IOg溶于20ml36%鹽酸溶液中，加乙醚200ml搖勻，置密閉容器內(nèi)保存。使用時(shí)將試液①a.與①b.按1: 2混合，濾去沉淀，濾液放冰箱保存。用玻璃棒蘸取乙酸乙酯提取物樣品供試液涂于濾紙上，先噴ab混合試液，稍干，再噴試液②，即顯紅色，表明含有香豆素類化合物。
[0076](2)重氮化試劑反應(yīng)
[0077]①對(duì)硝基苯胺0.35g,溶于濃鹽酸5ml中，加水至50ml ;②亞硝酸鈉5g,加水50ml。?、?、②液等量在冰水浴中混合后使用。取少量石油醚提取物樣品供試液滴加重氮化試劑，即顯橙紅色，表明含有香豆素類化合物。
[0078]三、馬甲子提取物的抗真菌活性研究
[0079]稱取實(shí)例1(1)中制備的馬甲子乙醇提取物lg，用5%異丙醇溶液溶解配制至IOml, 0.22 iim濾膜過濾除菌。取Iml除菌上述溶液，加入到9ml熔融后冷卻至約5(TC的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻，迅速倒入直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，靜置，制成含有10mg/ml馬甲子提取物的PDA培養(yǎng)平板。用相同體積的5 %異丙醇溶液制成空白對(duì)照PDA培養(yǎng)平板。
[0080]將切取好的菌塊接種體移入上述含藥PDA培養(yǎng)平板，25°C恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，用十字交叉法測(cè)定所有培養(yǎng)平板上的菌落直徑，校正后計(jì)算抑菌率。
[0081]結(jié)果如表1所示。馬甲子醇提物對(duì)受試的各類真菌具有明顯的抑制作用。由于受試真菌均為常見致病真菌，具有明顯的代表性，該結(jié)果提示馬甲子醇提物具有較強(qiáng)抗真菌活性，可望應(yīng)用于抗真菌類藥物的制備。
[0082]表1馬甲子醇提物對(duì)各種真菌的抑制效果(n=3, I±s)
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗真菌活性的馬甲子提取物，其特征在于，其制備方法為:取馬甲子全株植物或其中任一部位，加入馬甲子體積的1-20倍的甲醇或乙醇提取，或者將甲醇或乙醇提取物進(jìn)一步用乙酸乙酯或石油醚提??；提取液濃縮后干燥，制得馬甲子提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物，其特征是，所述馬甲子為鮮品、冷凍干燥品或甲醇或乙醇處理的樣品；所述提取方法為浸潰、回流或滲漉；所述干燥方法為減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥或微波干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物，其特征是，所述制得的馬甲子提取物包括萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類及萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類的苷類和單體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物的各類制劑，其特征是，包括馬甲子提取物片劑、顆粒劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物的應(yīng)用，其特征是，用于治療、緩解真菌引起的臨床疾病，在抗真菌藥物制備中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的馬甲子提取物的各類制劑的應(yīng)用，其特征是，用于治療、緩解真菌引起的臨床疾病，在抗真菌藥物制備中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK103751316SQ201410023850
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】徐超群, 袁志翔, 張磊, 舒光明, 楊薇, 余悅, 胡竟一, 李東曉 申請(qǐng)人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院