一種具有微納米結(jié)構(gòu)的支架制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有微納米結(jié)構(gòu)的支架制備方法，這種支架是一種同時具有微米和納米結(jié)構(gòu)的多級梯度結(jié)構(gòu)支架。它是由直徑微米級和納米級的纖維共同培養(yǎng)獲得，主要步驟為將直徑微米級的纖維與直徑納米級的細(xì)菌纖維素共培養(yǎng)一定時間后，獲得具有微納米結(jié)構(gòu)的支架材料。本發(fā)明提供的支架材料具有良好的力學(xué)性能、吸濕性能和梯度的微納米多級結(jié)構(gòu)，在微觀結(jié)構(gòu)上和宏觀性能上更滿足組織工程對支架材料的要求。本支架制備方法在常壓下可順利完成，工藝簡單，未使用任何有毒藥品，安全無毒性。
【專利說明】一種具有微納米結(jié)構(gòu)的支架制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的組織工程復(fù)合材料支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】 [0002]組織工程學(xué)是近年來迅速發(fā)展的一門新興交叉學(xué)科，是材料學(xué)、工程學(xué)和生命科學(xué)共同發(fā)展并相互融合的產(chǎn)物，其基本原理為選取捐贈者或病患的種子細(xì)胞接種到人工制備合成的具有一定空間結(jié)構(gòu)和力能的支架上培養(yǎng)，經(jīng)過細(xì)胞的增殖生長最終獲得具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官。組織工程包括人工細(xì)胞外基質(zhì)-支架、細(xì)胞以及信息因子三大要素。支架材料作為組織工程的重要組成部分，是組織工程研究的一個重要內(nèi)容，它為細(xì)胞的黏附、生長、增殖、分化和新組織的形成提供空間支持。通過對人體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的分析發(fā)現(xiàn)，從結(jié)構(gòu)角度考慮，體內(nèi)ECM是梯度的纖維結(jié)構(gòu)，它不僅包含微米纖維，同時存在納米纖維，換言之，體內(nèi)ECM是納米和微米的最佳集合體。
[0003]最近幾年，木醋桿菌的分泌物-細(xì)菌纖維素(BC)因其獨(dú)特的納米纖維結(jié)構(gòu)，受到人們的廣泛關(guān)注，具有成為仿生組織工程支架的潛力。BC具有來源廣泛，制備簡單，無交叉感染，無免疫反應(yīng)，力學(xué)性能優(yōu)異，結(jié)構(gòu)與體內(nèi)ECM存在相似性，自身呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等顯著特點(diǎn)。因此，BC眾多的優(yōu)異特點(diǎn)已經(jīng)使之成為近幾年生物材料領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，在骨、軟骨和血管組織工程顯示出很好的前景。BC其顯著特點(diǎn)為納米纖維結(jié)構(gòu)，但是體內(nèi)ECM是梯度的纖維結(jié)構(gòu)，是納米纖維和微米纖維的集合體。因此，為了使BC在組織工程領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用，改善其纖維結(jié)構(gòu)，與微米纖維復(fù)合，獲得具有梯度纖維結(jié)構(gòu)的BC復(fù)合材料?；谶@一思想，許多研究報道了在BC內(nèi)部構(gòu)造微米孔隙的方法及應(yīng)用情況，經(jīng)結(jié)構(gòu)改善的BC復(fù)合材料支架在支撐細(xì)胞生長、增殖以及粘附能力等方面都有顯著的提高。
[0004]基于對體內(nèi)ECM的深入研究以及BC的自身特點(diǎn)，本發(fā)明制備了具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的BC支架材料。相比于現(xiàn)有的BC支架材料，該方法可以改善BC的空間結(jié)構(gòu)，同時具有合成效率高、產(chǎn)量大以及性能優(yōu)勢等特點(diǎn)，此外，加入微米纖維沒有影響木醋桿菌的分泌生長，保持了支架材料的生物相容性。因此，這種在材料微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能以及生物相容性等方面都具有一定優(yōu)勢的支架材料，可以在組織工程領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是制備一種具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的支架材料用于組織工程領(lǐng)域，其關(guān)鍵技術(shù)是將微米纖維置于木醋桿菌的培養(yǎng)基中，采用共培養(yǎng)的方法，將木醋桿菌分泌的BC納米纖維與培養(yǎng)基中的微米纖維相互纏繞，最終獲得微納米結(jié)構(gòu)的BC /某微米纖維復(fù)合材料支架。制備的BC /某微米纖維復(fù)合材料支架具有微納米梯度的微觀結(jié)構(gòu)，同時保持BC的多孔納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，微米纖維的引入可以在支架內(nèi)部構(gòu)造微米孔隙，因此，支架不僅具有微納米梯度結(jié)構(gòu)，又具有多級孔隙結(jié)構(gòu)。這一支架材料的制備，有利于細(xì)胞的粘附、遷移、生長與繁殖，符合組織工程對支架結(jié)構(gòu)仿生的要求，可以更好地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一種具有微納米結(jié)構(gòu)的支架材料的制備予以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案是:將滅菌的微米纖維加入木醋桿菌的液體培養(yǎng)基中，采用靜態(tài)培養(yǎng)或動態(tài)培養(yǎng)方式，共培養(yǎng)一定時間，獲得具有微納米結(jié)構(gòu)的支架，其中納米纖維的重量含量為5% -85%。
[0007] 本發(fā)明所述BC的分泌菌種為木醋桿菌(Acetobacter xylinus),木醋桿菌為革蘭氏陰性(少數(shù)可變)，寬0.6-0.8 μ m，長1.0-4.0ym,淡棕色，呈圓形，以單個、成對或鏈狀存在，不透明，嚴(yán)格好氧，呼吸代謝從不發(fā)酵，接觸酶陽性，氧化酶陰性，最適生長溫度25-300C，最適pH5.4-6.3，常被作為BC研究的標(biāo)準(zhǔn)微生物。本發(fā)明中采用的木醋桿菌的液體培養(yǎng)基組成為:每IL去離子水中包含葡萄糖30g，蛋白胨7.5g，酵母粉10g，磷酸氫二鈉
7.5g，醋酸調(diào)節(jié)pH為5左右，然后高溫滅菌待用。
[0008]本發(fā)明介紹一種具有微納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素/某微米纖維支架材料的制備方法，其具體過程包括如下步驟:
[0009]I)將1-10克一種或幾種微米纖維混合物加入木醋桿菌100-300ml液體培養(yǎng)基，將
上述培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌處理；
[0010]2)將擴(kuò)增后的木醋桿菌種子溶液按照5-10%的比例(體積比)接種到I)中所述的培養(yǎng)液中，在25-30°C的恒溫培養(yǎng)箱中采用靜態(tài)培養(yǎng)或者動態(tài)培養(yǎng)的方式培養(yǎng)3-10天。
[0011]3)取出2)中共培養(yǎng)得到的物質(zhì)，分別采用去離子水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5-10%的氫氧化鈉溶液交替煮沸清洗干凈，最后用去離子水反復(fù)沖洗直至該物質(zhì)呈現(xiàn)中性，即得微納米結(jié)構(gòu)BC /某微米纖維復(fù)合材料支架。
[0012]本發(fā)明首次將一種或幾種微米纖維加入木醋桿菌液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，制備具有微納米結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料支架。微米纖維的加入，沒有影響木醋桿菌對BC的分泌，保持了 BC的生物相容性，同時引入的微米纖維在支架內(nèi)部構(gòu)建了微米孔隙，使支架成為具有微納米梯度結(jié)構(gòu)和多級孔隙結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的粘附、遷移和生長，符合組織工程對支架材料結(jié)構(gòu)仿生的要求。
[0013]本發(fā)明使用的試劑均安全無毒，保證了制備材料的安全性和生物活性，同時所用原料易得，在安全環(huán)境下即可完成支架材料的制備，工藝簡單，具備大量生產(chǎn)的條件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1實(shí)施例1所得樣品的掃描電鏡照片。
[0015]圖2實(shí)施例1所得樣品中BC的紅外光譜圖。
[0016]圖3實(shí)施例2所得樣品的掃描電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0018]實(shí)施例1:
[0019]將30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氫二鈉依次加入IL的去離子水中，充分溶解后用醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5-6.0范圍。
[0020]稱量棉纖維10克，加入上述300ml液體培養(yǎng)基中，115°C高溫滅菌，保溫保壓半小時，自然冷卻至30°C以下后取出，作為木醋桿菌生長的培養(yǎng)基待用。
[0021]將擴(kuò)增好的木醋桿菌種子溶液按照10%的接種比例(體積比)，接種到上述培養(yǎng)基中，充分搖動使菌種分布均勻，30°C恒溫靜態(tài)培養(yǎng)7天，得到濕態(tài)的BC /棉纖維復(fù)合材料支架，用去離子水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氫氧化鈉溶液交替煮沸清洗至乳白色，最終用去離子水清洗至中性。
[0022]將上述中性的乳白色物質(zhì)采用液氮迅速冷凍，然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48小時，得到乳白色類似泡沫的支架材料，儲藏，備用。
[0023]實(shí)施例2:
[0024]將30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氫二鈉依次加入IL的去離子水中，充分溶解后用醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5-6.0范圍。
[0025]稱量棉纖維8克，加入上述200ml液體培養(yǎng)基中，115°C高溫滅菌，保溫保壓半小時，自然冷卻至30°C以下后取出，作為木醋桿菌生長的培養(yǎng)基待用。
[0026]將擴(kuò)增好的木醋桿菌種子溶液按照8 %的接種比例(體積比)，接種到上述培養(yǎng)基中，充分搖動使菌種分布均勻，30C恒溫動態(tài)培養(yǎng)5天，得到濕態(tài)的BC /棉纖維復(fù)合材料支架，取出培養(yǎng)基中懸浮的乳白色物質(zhì)，用去離子水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氫氧化鈉溶液交替煮沸清洗至乳白色，最終用去離子水清洗至中性。
[0027]將上述中性的乳白色物質(zhì)_50°C冷凍24小時，然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48小時，得到乳白色類似泡沫的支架材料，儲藏，備用。
[0028]實(shí)施例3:
[0029]將30g葡萄糖、7.5g蛋白胨、IOg酵母粉和7.5g磷酸氫二鈉依次加入IL的去離子水中，充分溶解后用醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5-6.0范圍。
[0030]稱量麻纖維5克、碳纖維5克，加入300ml液體培養(yǎng)基中，按照實(shí)施例1中滅菌處理后，按照10%的比例(體積比)接種木醋桿菌種子溶液于上述培養(yǎng)基中，30°C恒溫動態(tài)培養(yǎng)7天，采用實(shí)施例2中的方法清洗干凈。將得到的濕態(tài)支架，采用酒精梯度處理(分別置于酒精體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%酒精/水溶液中各30分鐘)后，置于烘箱中60°C恒溫干燥，得到干燥的支架材料，儲藏，備用。
[0031]實(shí)施例4:
[0032]稱量5克麻纖維、3克棉纖維加入200ml的液體培養(yǎng)基中，按照實(shí)施例1中做滅菌處理，按照6%的接種比例(體積比)接種木醋桿菌種子溶液到培養(yǎng)基中，在30°C恒溫靜態(tài)培養(yǎng)5天，得到濕態(tài)的BC /麻纖維/棉纖維復(fù)合材料支架，用去離子水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鈉溶液交替煮沸清洗至乳白色，最終用去離子水清洗至中性。將上述中性的乳白色物質(zhì)采用液氮迅速冷凍，然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48小時，得到類似泡沫的支架材料，儲減，備用。
【權(quán)利要求】
1.一種具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料支架，其特征為支架本身由直徑微米和納米的纖維共同組成，在以下論述中，直徑微米的纖維稱為微米纖維，直徑納米的纖維稱為納米纖維，其中納米纖維的重量含量為5% -85%。
2.權(quán)利要求1中所述的復(fù)合材料支架，其特征在于所述支架是由微米纖維加入木醋桿菌的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)獲得，木醋桿菌在培養(yǎng)發(fā)酵的過程中分泌產(chǎn)生納米纖維，與加入的微米纖維相混合，形成所述支架。培養(yǎng)后得到的支架需用去離子水和5-10wt%氫氧化鈉溶液反復(fù)交替沖洗，最終用去離子水清洗直至中性即得。
3.權(quán)利要求1中所述的復(fù)合材料支架，其特征在于微米纖維為植物纖維、無機(jī)纖維或有機(jī)纖維中的一種或兩種以上的混合物。
4.權(quán)利要求1中所述的復(fù)合材料支架，其特征在于所述支架在使用過程中可以根據(jù)需要選用濕態(tài)或干態(tài)。
5.—種權(quán)利要求1所述的具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料支架的制備方法，其特征在于經(jīng)過如下步驟: 1)將1-10克微米纖維加入木醋桿菌100-300ml培養(yǎng)液里，把帶有微米纖維的培養(yǎng)液經(jīng)高溫滅菌處理待用。 2)將木醋桿菌菌種接種到I)中所述培養(yǎng)液中，在30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-10天。 3)將2)中共培養(yǎng)得到物質(zhì)采用去離子水和5-1(^七％氫氧化鈉溶液反復(fù)交替沖洗干凈，最終采用去離子水清洗至中性，即得具有微納米梯度結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料支架。
6.權(quán)利要求5所述支架的制備步驟，其中步驟2)所述的培養(yǎng)方法可以為靜態(tài)培養(yǎng)或動態(tài)培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求1中所述的復(fù)合材料支架的用途，其特征在于所述支架的應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)榻M織工程支架材料。
【文檔編號】A61L27/50GK103638560SQ201310654053
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】王靜, 劉嬌, 吳寧, 張國利 申請人:天津工業(yè)大學(xué)