一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用，該制備方法以雷公藤內(nèi)酯醇為微生物代謝藥物，通過特殊誘導(dǎo)子對微生物代謝雷公藤內(nèi)酯醇，同時得到多種、高產(chǎn)率的基于雷公藤內(nèi)酯醇的羥基和或甲基化修飾的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，這些雷公藤內(nèi)酯醇衍生物具有抑制腫瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用。本發(fā)明方法綠色環(huán)保、選擇性強(qiáng)、產(chǎn)率高，能夠大規(guī)模利用微生物制備雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
【專利說明】一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.),收載于《滇南本草》，其產(chǎn)地主要分布在中國南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和臺灣等地，其中以福建泰寧產(chǎn)的雷公藤質(zhì)量為最優(yōu)(Zhou ZL, Yang YX, Ding J.et al Triptolide: structuralmodifications, structure - activity relationships, bioactivities, clinicaldevelopment and mechanisms, Nat.Prod.Rep., 2012, 29, 457 - 475.)。而雷公藤甲素(Triptolide, TP，雷公藤內(nèi)酯醇)屬二萜環(huán)氧類化合物，是雷公藤主要的活性成分之一，其在抗癌、抗炎、抗生育、抗血管生成以及免疫抑制等方面表現(xiàn)出了突出的藥理活性，其對美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI),所列出的全部60種癌細(xì)胞均具有良好的抗腫瘤活性，為此，雷公藤甲素在腫瘤和免疫抑制藥物開發(fā)方面，顯示了巨大的應(yīng)用前景。然而，雷公藤內(nèi)酯醇在消化系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)以及泌尿生殖系統(tǒng)中嚴(yán)重的毒副作用和極低的水溶性，限制了其研發(fā)進(jìn)程和臨床應(yīng)用。
[0003]國內(nèi)外學(xué)者成功運用化學(xué)法對雷公藤內(nèi)酯醇進(jìn)行羥基化和甲基化的修飾改造，其中化學(xué)合成法合成的衍生物包括:15、16_羥基雷公藤內(nèi)酯醇、1β、2β-羥基雷公藤內(nèi)酯醇(分別由以下專利公開(Michel J, J, Mahinda, W，Michael, H, etal, Triptolide derivatives useful in the treatment of autoimmune diseases, USPatentl999/6004999, 1999-12-21)，(Yuan,Hff,John H, ff, Dai, DC, et al,Triptolidelactone derivatives as immunomodulators and ant i cancer agent,USPatent2010/0331554, 2010-12-30.), (Dai, DC and John H, ff, Triptolide derivativesas immunomodulators and anticancer agents, PCT W02004/058246A1, 2004-07-15.));5a-羥基雷公藤內(nèi)酯醇(由以下文獻(xiàn)公開:LLDT-8; (Li, YC, Zou JP, Zhang F, Triptolidederivatives and their uses,US Patent US2009/7626044B2,2009-12-01.),(李援朝，左建平，張凡，周茹，丁健。雷公藤內(nèi)酯醇衍生物及其應(yīng)用。中國專利，ZL03102976.02003-01-23))，5 α，6α、5β，6β -雙羥基雷公藤內(nèi)酯醇(分別由以下專利公開:(Li, YC, Zou JP, Zhang F，Triptolide derivatives and their uses, US PatentUS2009/7626044B2, 2009-12-01.)，(Dai,DC and John H, ff, Yuan, HW, Triptolide5, 6derivatives as immunomodulators and anticancer agents and their uses, US PatentUS2010/7820834B2，2010-10-26.)) ；19-甲基雷公藤內(nèi)酯醇(由以下專利公開:.H.袁，J.H.馬瑟，D.戴。用作免疫調(diào)節(jié)藥和抗癌藥的雷公藤內(nèi)酯醇環(huán)衍生物，中國專利號，200580006875.1, 2005-03-02.)，修飾后的產(chǎn)物提高了水溶性，其中LLDT-8正在中國進(jìn)行治療關(guān)節(jié)炎的臨床一期實驗。雖然化學(xué)修飾為大規(guī)模制備雷公藤內(nèi)酯醇相關(guān)衍生物提供了廣闊的前景，但是但化學(xué)合成法存在 得率低、選擇性差、副產(chǎn)品多、過程較繁雜等缺點，具有一定的局限性。[0004]而在另一方面，利用具有仿生代謝能力的微生物直接通過微生物特殊的酶促作用直接轉(zhuǎn)化生物雷公藤內(nèi)酯醇產(chǎn)生多種體內(nèi)代謝、減毒后的雷公藤內(nèi)酯醇的衍生物也取得了一定的效果，例如，Ning等用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleeana)生物轉(zhuǎn)化雷公藤甲素，可以同時得到1β、2β、5α、15、16、19 α、19β位羥基化7種羥基化產(chǎn)物，而且各種產(chǎn)物抑制腫瘤的活性顯著，其毒性均小于雷公藤甲素，通過比較也不難發(fā)現(xiàn)雖然小克銀漢霉菌屬對雷公藤類化合物的轉(zhuǎn)化雖然比較完全，但其轉(zhuǎn)化率都較低，其中轉(zhuǎn)化率最大的代謝產(chǎn)物5 α -羥基雷公藤甲素也只有18%。因此，需要利用生物工程技術(shù)優(yōu)化和完善該技術(shù)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率，以此得到更多的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一，在于提供一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，該方法綠色環(huán)保、選擇性強(qiáng)、產(chǎn)率高，能夠大規(guī)模利用微生物制備雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的上述技術(shù)問題之一的:
[0007]一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一:取保存于4°C、土豆斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化菌種一支，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，以適量無菌水將斜面上的孢子充分吹打下來，使單孢子懸液的濃度調(diào)整至IO7~IO8個/mL，既得種子孢子液；
[0009]步驟二:以100ml, 5mL的接種量，在土豆液體培養(yǎng)基上接種步驟一所得孢子液，在pH至6.0，溫度30°C ±1°C，振蕩速度為200r/min條件下培養(yǎng)12h后；按0.1~4ug的接種量，加入各種不同比例的聯(lián)合誘導(dǎo)子，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，再按I~IOug的接種量加入雷公藤內(nèi)酯醇，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天，每天檢測各種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的含量和轉(zhuǎn)化率，當(dāng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低至0.5~3%時，停止培養(yǎng)，過濾后收集菌絲體，然后將濾液于8000r/min，離心IOmin去除沉淀既得到發(fā)酵提取液；·
[0010]步驟三:將步驟二所得提取液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌絲體則用重量比為1:3~1:10的乙酸乙酯超聲提取30min，然后濾去菌絲體，所得濾液與萃取液合并，既得分離提取液，提取液濃縮至干，得到提取后殘渣；
[0011]步驟四:將經(jīng)過步驟三處理所得的殘渣，用Img:1~IOmL的比例用丙酮溶解后，采用硅膠拌樣后揮干，稱取20倍于樣品量的硅膠，使用濕法進(jìn)行填柱和上樣；首先用5倍柱體積的100%石油醚將樣品中低極性油類物質(zhì)洗脫干凈，然后依次用體積比為:10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1: 2，1: 4，1: 6，1:8的石油醚:乙酸乙酯洗脫液，依次對柱子進(jìn)行洗脫，最后用100%乙酸乙酯再洗脫柱子，TLC控制收集主餾分，最后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將各個餾分的流動相蒸干后，用適量色譜純的甲醇溶解后，用0.22 μ m的有機(jī)膜過濾后，得到分離液；
[0012]步驟五:將經(jīng)過步驟四處理所得的分離液，采用高效液相半制備法分離純化，HPLC梯度洗脫法控制收集不同的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物洗脫液，減壓蒸去溶劑后，用甲醇結(jié)晶后所得到的化合物，即為所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
[0013]進(jìn)一步地，所述的土豆培養(yǎng)基為:土豆200g/L，葡萄糖20g/L ;配置時將土豆去皮后將其切成小塊，加水加熱煮沸30min，過濾，取濾液定容至1L，加入葡萄糖20g，攪拌溶解后，121°C滅菌30min，即得；斜面培養(yǎng)基為:取上述土豆培養(yǎng)基1L，加入瓊脂粉各20g，加熱溶解后分裝于玻璃試管中，于121°C下滅菌30min后取出，傾斜45度，靜置、冷卻既得。[0014]進(jìn)一步地，所述的轉(zhuǎn)化菌種為下述微生物中任意一種:
[0015]短刺小克銀漢霉(Cunninghamellablakesleana)AS 3.970;AS 3.153;AS3.910 ；AS 3.954, AS 3.2016;AS 3.2017;AS 3.2018;AS 3.3401;或者刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)AS 3.154;AS 3.952;AS 3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans.)AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041 ;AS3.2476 ;AS3.2477 ;AS3.2717 ;AS3.3402 ;AS3.2476;小克銀漢霉 CFCC5029;或者 Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorphATCC 9245 ；ATCC 8688a ；ATCC 8983 ;或者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata, teleomorph ATCC 11585a ；ATCC36190 ；ATCC 11585b ；ATCC9244 ；或者Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorph ATCC11064 ；ATCC10028a ;或者 Cunninghamella elegans ATCC36112 ；ATCC26269 ；ATCC10028b ；黑曲霉 Aspergillus niger AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858 ;AS3.2931 ;AS3.3882 ;AS3.3883 ;AS3.4303; AS3928; AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黃曲霉、刺囊毛霉、細(xì)孢毛霉、鏈格孢、微紫青霉和尋麻青霉。
[0016]進(jìn)一步地，所述的聯(lián)合誘導(dǎo)子為下述三組物質(zhì)的至少兩組中的任意一種物質(zhì)組成:
[0017]A組:A1為α -環(huán)糊精，Α2為β _環(huán)糊精，A3為2，6- 二甲基-β -環(huán)糊精，Α4為2-羥丙基-β -環(huán)糊精，Α5為甲基化-β -環(huán)糊精、Α6為羥乙基-β -環(huán)糊精，Α7為葡萄糖-β -環(huán)糊精，AS為磺丁基-β -環(huán)糊精，Α9為Y -環(huán)狀糊精，AlO為羧甲基-β -環(huán)糊精；
[0018]B組:B1為茉莉酸甲酯，B2為水楊酸，B3為殼聚糖，B4為茉莉酸，B5為真菌聚糖類，B6為β -葡聚糖，Β7為谷胱甘肽，Β8為2-羥乙基茉莉，Β9為油菜素內(nèi)酯，BlO為云酯，Bll為甲殼素；Β12為小克銀漢霉屬AL4粗誘導(dǎo)子；
[0019]C組:C1為卡馬西平，C2為莫達(dá)非尼，C3為奈韋拉平，C4為利福平，C5為貫葉連翹，C6為異煙肼，C7為胰島素，C8為奧美拉唑，C9為苯巴比妥，ClO為潑尼松，Cll為潑尼松龍，C12為地塞米松，C13為倍他米松，C14為倍氯米松，C15為戊酸倍他米松，C16為醋酸地塞米松，C17為9-氣~16 α -甲基11 β , 17- 二羥基_3-氧-1,4-雄二稀-17 β -竣酸。
[0020]進(jìn)一步地，所述TLC控制收集主餾分，用體積比為85:5的氯仿和甲醇為展開劑；
[0021]所述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的高效液相色譜檢測方法為:色譜柱Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18柱，其中分析柱內(nèi)徑乘以長度為4.6mmX 250mm，粒徑為5 μ m ;雷公藤內(nèi)酯醇檢測波長:218nm;溫度:室溫；進(jìn)樣量=IOyL ；
[0022]所述梯度洗脫法控制不同的雷公藤衍生物的高效液相色譜檢測方法為:色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，其中分析柱內(nèi)徑乘以長度為4.6_X250_，粒徑為5 μ m ;吸收波長:218nm ；
[0023]流動相:乙腈:水的體積比和洗脫時間分別如下:10:90、洗脫時間Omin ；16:84、洗脫時間IOmin ；30:70、洗脫時間36min ；30:70、洗脫時間50min, 10:90、洗脫時間53min ；10:90、洗脫時間60min ；
[0024]上述對應(yīng)的流速為:0.5ml/min ;0.5ml/min ； lml/min ； lml/min ；0.5ml/min ；
0.5ml/min ；
[0025]柱穩(wěn):25°C,進(jìn)樣量:20μI。
[0026]進(jìn)一步地，所述方法可用于制備的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物如下:16_羥基雷公藤內(nèi)酯醇、15-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、2 β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、I β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5 α -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、19 α-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、19 β-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5α-羥基-14表雷公藤甲素、5β、6β -雙羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5 α、6α-雙羥基雷公藤內(nèi)酯醇、和14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇。
[0027]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二，在于提供一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其具有高效、低毒等特點，具有抑制腫瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用，為雷公藤內(nèi)酯醇衍生物提供了廣闊的應(yīng)用前景。
[0028]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的上述技術(shù)問題之二的: [0029]一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物結(jié)構(gòu)式a如下:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一:取保存于4°c、土豆斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的、轉(zhuǎn)化菌種一支,置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，以適量無菌水將斜面上的孢子充分吹打下來，使單孢子懸液的濃度調(diào)整至IO7~IO8個/mL，既得種子孢子液； 步驟二:以100ml，5mL的接種量，在土豆液體培養(yǎng)基上接種步驟一所得孢子液，在pH至6.0，溫度30°C ±1°C，振蕩速度為200r/min條件下培養(yǎng)12h后；按0.1~4ug的接種量，加入各種不同比例的聯(lián)合誘導(dǎo)子，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，再按I~IOug的接種量加入雷公藤內(nèi)酯醇，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天，每天檢測各種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的含量和轉(zhuǎn)化率，當(dāng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低至0.5~3%時,停止培養(yǎng),過濾后收集菌絲體，然后將濾液于8000r/min,離心IOmin去除沉淀既得到發(fā)酵提取液； 步驟三:將步驟二所得提取液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌絲體則用重量比為1:3~1:10的乙酸乙酯超聲提取30min，然后濾去菌絲體，所得濾液與萃取液合并，既得分離提取液，提取液濃縮至干，得到提取后殘渣； 步驟四:將經(jīng)過步驟三處理所得的殘渣，用Img:1~IOmL的比例用丙酮溶解后，采用硅膠拌樣后揮干，稱取20倍于樣品量的硅膠，使用濕法進(jìn)行填柱和上樣；首先用5倍柱體積的100%石油醚將樣品中低極性油類物質(zhì)洗脫干凈，然后依次用體積比為:10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚:乙酸乙酯洗脫液，依次對柱子進(jìn)行洗脫，最后用100%乙酸乙酯再洗脫柱子，TLC控制收集主餾分，最后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將各個餾分的流動相蒸干后，用適量色譜純的甲醇溶解后，用0.22 μ m的有機(jī)膜過濾后，得到分離液； 步驟五:將經(jīng)過步驟四處理所得的分離液，采用高效液相半制備法分離純化，HPLC梯度洗脫法控制收集不同的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物洗脫液，減壓蒸去溶劑后，用甲醇結(jié)晶后所得到的化合物，即為所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于: 所述的土豆培養(yǎng)基為:土豆200g/L，葡萄糖20g/L ;配置時將土豆去皮后將其切成小塊，加水加熱煮沸30min，過濾，取濾液定容至1L，加入葡萄糖20g，攪拌溶解后，121°C滅菌30min,即得；斜面培養(yǎng)基為:取上述土豆培養(yǎng)基1L，加入瓊脂粉各20g，加熱溶解后分裝于玻璃試管中，于121°C下滅菌30min后取出，傾斜45度，靜置、冷卻既得。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)化菌種為下述微生物中任意 一種: 短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana)AS 3.970;AS 3.153;AS 3.910;AS 3.954, AS 3.2016; AS 3.2017; AS 3.2018; AS 3.3401;或者刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)AS 3.154;AS 3.952;AS 3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans.) AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克銀漢霉 CFCC5029;或者 Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorphATCC 9245 ；ATCC 8688a ；ATCC 8983 ;或者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata, teleomorph ATCC 11585a ；ATCC36190 ；ATCC 11585b ；ATCC9244 ；或者Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorph ATCC`11064 ；ATCC10028a ;或者 Cunninghamella elegans ATCC36112 ；ATCC26269 ；ATCC10028b ；黑曲霉 Aspergillus niger AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.8`79;AS3.939;AS3.940;AS3.1858 ;AS3.2931 ;AS3.3882 ;AS3.3883 ;AS3.4303; AS3928; AS3.43`04;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黃曲霉、刺囊毛霉、細(xì)孢毛霉、鏈格孢、微紫青霉和尋麻青霉。
4.如權(quán)利要求3所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于:所述的聯(lián)合誘導(dǎo)子為下述三組物質(zhì)中的至少兩組中的任意一種物質(zhì)組成: A組:Al為α -環(huán)糊精，Α2為β -環(huán)糊精，A3為2，6_ 二甲基-β -環(huán)糊精，Α4為2-羥丙基-β -環(huán)糊精，Α5為甲基化-β -環(huán)糊精、Α6為羥乙基-β -環(huán)糊精，Α7為葡萄糖-β -環(huán)糊精，AS為磺丁基-β -環(huán)糊精，Α9為Y -環(huán)狀糊精，AlO為羧甲基-β -環(huán)糊精； B組:B1為茉莉酸甲酯，B2為水楊酸，B3為殼聚糖，B4為茉莉酸，B5為真菌聚糖類，B6為β -葡聚糖，Β7為谷胱甘肽，Β8為2-羥乙基茉莉，Β9為油菜素內(nèi)酯，BlO為云酯，Bll為甲殼素；Β12為小克銀漢霉屬AL4粗誘導(dǎo)子； C組:C1為卡馬西平，C2為莫達(dá)非尼，C3為奈韋拉平，C4為利福平，C5為貫葉連翹，C6為異煙肼，C7為胰島素，C8為奧美拉唑，C9為苯巴比妥，ClO為潑尼松，Cl I為潑尼松龍，C12為地塞米松，C13為倍他米松，C14為倍氯米松，C15為戊酸倍他米松，C16為醋酸地塞米松，C17為9-氟-16 α -甲基11 β，17- 二羥基_3_氧_1，4_雄二烯-17 β -羧酸。
5.如權(quán)利要求1所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于:所述TLC控制收集主餾分，用體積比為`85:5的氯仿和甲醇為展開劑； 所述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的高效液相色譜檢測方法為:色譜柱Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18柱，其中分析柱內(nèi)徑乘以長度為4.6mmX 250mm，粒徑為5 μ m ;雷公藤內(nèi)酯醇檢測波長:218nm;溫度:室溫；進(jìn)樣量=IOyL ； 所述梯度洗脫法控制不同的雷公藤衍生物的高效液相色譜檢測方法為:色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，其中分析柱內(nèi)徑乘以長度為4.6_X250_，粒徑為5μ m ;吸收波長:218nm ； 流動相:乙腈:水的體積比和洗脫時間分別如下:10:90、洗脫時間Omin ；16:84、洗脫時間 IOmin ；30:70、洗脫時間 36min ；30:70、洗脫時間 50min, 10:90、洗脫時間 53min ；10:90、洗脫時間60min ；
上述對應(yīng)的 '流速為:0.5ml/min ；0.5ml/min ； lml/min ； lml/min ；0.5ml/min ；0.5ml/min ； 柱穩(wěn):25°C，進(jìn)樣量:20 μ I。
6.如權(quán)利要求1所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法，其特征在于:所述方法可用于制備的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物如下:16_羥基雷公藤內(nèi)酯醇、15-羥基雷公藤內(nèi)酯醇、2β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、I β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5 α -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、19 α -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、19β_羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5α-羥基-14表雷公藤甲素、5β、6β -雙羥基雷公藤內(nèi)酯醇、5 α、6α -雙羥基雷公藤內(nèi)酯醇、和14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇。
7.—種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物是利用權(quán)利要求1所述的一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的制備方法制得，其特征在于:所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物結(jié)構(gòu)式a如下:

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其特征在于=CR1R2為CH3H時，其中X5為α -羥基，X2為β -羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者X5為β -羥基，X2為α -羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者&為α-羥基，X2為α-羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者&為β_羥基，&為β_羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者其中&為α-羥基，X1S β-羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者X5為β_羥基，X1為α-羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者X5為α-羥基，X1為α-羥基，其余的基團(tuán)X是氫；或者X5為β-羥基，\為β_羥基，其余的基團(tuán)X是氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其特征在于:當(dāng)CR3R4為CH3H時，其中X5為α -羥基，X19為β -羥基,或者X5為β -羥基，X19為α --羥基，或者X5為α -羥基，X19為α-羥基；或者X5為β-羥基，X19S β —羥基，其余的基團(tuán)X是氫。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其特征在于:其中X2tl為羥基時，其余為氫，或者X6為羥基，其余的基團(tuán)X是氫。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其特征在于:所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物具體為； 6α -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、6 β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、20 α -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、20 β -羥基雷公藤內(nèi)酯醇、2 β ,5α-二羥基-14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、2 α，5 β - 二羥基_14_甲基雷公藤內(nèi)酯醇、2 α,5α-二羥基-14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、2 β，5 β - 二羥基_14_甲基雷公藤內(nèi)酯醇、I β ,5α-二羥基-14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、I α，5 β - 二羥基_14_甲基雷公藤內(nèi)酯醇、1α，5α-二羥基-14-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、I β，5 β - 二羥基_14_甲基雷公藤內(nèi)酯醇、19 β，5 α - 二羥基-16-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、19 α，5 β - 二羥基_16_甲基雷公藤內(nèi)酯醇、19α, 5α- 二羥基-16-甲基雷公藤內(nèi)酯醇、19 β，5 β - 二羥基_16_甲基雷公藤內(nèi)酯醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求7~11所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的應(yīng)用，其特征在于:所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物可以用于治療與腫瘤相關(guān)的疾病，包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗藥的肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤系統(tǒng)疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求7~11所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的應(yīng)用，其特征在于:所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物可以用于治療與病毒相關(guān)的疾病，包括艾滋病、乙肝、皰疹、流感病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的應(yīng)用，其特征在于:所述雷公藤內(nèi)酯醇衍生物用于治療艾滋 病和乙肝病毒性疾病。
【文檔編號】A61P31/18GK103627772SQ201310598500
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】張景紅, 謝深霞, 唐圓圓 申請人:華僑大學(xué)