可用于治療銀屑病的小rna及其衍生物和藥物制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠用于治療銀屑病的小RNA及其衍生物和藥物制劑。該小RNA通過抑制CREB1和ATF1的表達，抑制銀屑病的致病相關基因產物——TNFα，IL-1a，IL6和IL的表達。該小RNA藥物通過皮膚給藥的方式能夠顯著改善5％的咪喹莫特乳膏涂抹小鼠皮膚形成的銀屑病模型鼠的皮膚癥狀，減輕病變皮膚的表皮增厚程度，改善皮膚的角質化，促進病變皮膚的毛發(fā)生長，對治療銀屑病具有一定的作用。
【專利說明】可用于治療銀屑病的小RNA及其衍生物和藥物制劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因藥物領域，特別是指可用于治療銀屑病的的小RNA及其衍生物和藥物制劑。
【背景技術】
[0002]銀屑病，又名牛皮癬，是一種慢性感染性皮膚失調證，患病率占世界人口的1~3%。1984年我國24個省、市、自治區(qū)進行流行病學調查，其患病率為0.123%，約占皮膚科門診的5~6%。
[0003]患者病變皮膚處出現無傳染性紅色浸潤斑，邊界明顯，其角質細胞異常增生和異常分化并導致表皮增生，同時伴有淋巴細胞滲透和表皮血管擴張、蔓延的特征。
[0004]至今人們對銀屑病發(fā)病機制的認識仍非常有限，通常認為是人體免疫細胞的復雜調控網絡和炎癥細胞因子相互作用的結果。易感個體在誘發(fā)因素的作用下，凋亡細胞釋放的自身DNA和自身RNA與銀屑病皮損中過度表達的抗菌肽LL37結合形成復合體，誘發(fā)漿細胞樣樹突狀細胞激活，通過產生Thl型細胞因子誘導T細胞向Thl型細胞增殖分化。漿細胞樣樹突狀細胞特異性亞型可產生TNF-α及促進一氧化氮合酶產生?；罨臉渫粻罴毎菩羞M入引流淋巴結，初始T細胞在IL-12和IL-23的作用下樹突狀細胞刺激分化成為Thl和Thl7型效應細胞，經體液循環(huán)回流移行進入皮膚組織。T細胞產生大量的TNF- a、IFN_ y、IL-17等細胞因子，刺激角質形成細胞增生活化，產生一系列趨化因子和細胞因子誘導促炎癥活動。其結果導致皮膚內出現大量炎癥細胞的浸潤，表皮角質形成細胞的過度增殖，真皮乳頭微小血管的過度增生，臨床上逐漸出現銀屑病典型的皮疹一-鱗屑性紅斑。在銀屑病樣皮膚病灶中表達的細胞因子主要是Th-Ι和Th-17免疫細胞亞型分泌的，并且主要增加促炎癥反應細胞因子，如腫瘤壞死因子-α，干擾素-Υ，白介素-1，白介素_2，白介素-12，白介素-17，白介素-23，以及粘合素-LFA-1。雖然這些促炎癥細胞因子并不見得是銀屑病的根本原因，但它們在維持銀屑病皮膚病灶的炎癥方面起著關鍵性的作用。因此降低或抑制一個或數個促炎癥細胞因子的表達是治療銀屑病的一個頗有希望的策略。
[0005]不久前人們通過人源化抗體的技術方法，研究發(fā)現針對一個或幾個促炎癥因子的單克隆抗體，能夠有效地治療某些銀屑病病人，其中研究比較多的是針對TNFa的單克隆抗體，其商品名有infliximab和adalimumab,這種抗體通過直接結合TNFa蛋白從而抑制TNFa效應基因，達到臨床治療銀屑病的效果。IL-12/23抑制劑(烏司奴單抗)等新的高選擇性生物制劑在國外也已被批準用于治療銀屑病。為此有報道研究通過小RNA干擾技術直接沉默TNFa的表達，實驗研究表明對人銀屑病的動物模型也具有一定的治療作用。然而單純的針對某一個銀屑病致病細胞因子的治療存在著停藥治療后病情反彈等副作用。因此急需選取新的，對銀屑病致病細胞因子進行新靶點的新型藥物的研發(fā)。
[0006]在對小分子的藥物活性篩選研究中發(fā)現針對p38MAPK通路的蛋白激酶抑制劑小分子化合物能夠有效的用于銀屑病的治療，但由于其毒性大，所以這類藥物除了用于某些腫瘤的治療外，在銀屑病等慢性疾病的治療中一直沒能進入二期臨床。由于小分子藥物的毒性有多種原因，如小分子作用靶點不專一，小分子化合物的代謝產物具有毒性等原因，選取p38 MAPK通路中的調控基因作為銀屑病的基因治療靶點仍具有可行性。近年來對銀屑病病理學的研究進一步佐證了這一點。Yu XJ等和Funding AT等分別報道在銀屑病人的病理組織p38的磷酸化要比正常組織中高出2倍左右，同時在該通路上的MEK，ERK1/2和CREB1的磷酸化也比正常對照組顯著提高。沉默MSK1，MSK2能夠抑制CREB1的表達，同時敲除MSK1還能夠有效的降低和銀屑病直接相關的免疫分子的表達，如IL-6，IL-8和TNF α.然而上述研究并沒有闡明CREB1基因的敲除是否能夠同樣抑制細胞因子TNFa等的表達。
[0007]近年發(fā)展起來的小RNA干擾技術為銀屑病治療的基因藥物研發(fā)帶來新的發(fā)展機會。干擾小RNA是一類長度為20個堿基的能與基因的mRNA互補，經過Dicer-Ag02復合物能使mRNA降解的一類天然或合成小RNA。小RNA藥物的特點是靶點的特異性強，降解產物沒有毒性，是當前新藥研究的一個新的突破點。本發(fā)明就是在選擇銀屑病的新靶點的基礎上，結合小RNA的設計技術和小RNA的透皮傳遞技術，對銀屑病的小鼠模型進行治療，以發(fā)現新的高效、低毒的治療銀屑病的潛在小RNA藥物。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明提出了可用于治療銀屑病的小RNA，其可以沉默靶基因CREBl(genebank基因號:ΝΜ_004379.3 和 NM_134442)、ATF1 (genebank 基因號 ΝΜ_005171.3)的基因表達，并通過直接抑制上述基因的表達而有效抑制皮膚細胞中能夠誘導銀屑病的細胞因子靶基因的TNFa，IL6和IL8的表達，并能夠改善、減輕銀屑病樣動物模型的皮膚組織的炎癥程度。
[0009]本發(fā)明的技術方案是這樣實現的:
[0010]可用于治療銀屑病的小RNA，其具有如SEQ ID N0:1(或如附圖5)所示的核心核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明通過大量的篩選、優(yōu)化和研究，提供了此種能有效沉默CREB1和ATF1的雙鏈小RNA的序列，小RNA s1-CRl具有核心核苷酸序列的雙鏈結構:
[0012]5' -GAAACCCCAUCUCUACUAA-3,
[0013]3' -CUUUGGGGUAGAGAUGAUU-5,
[0014]其中小RNA s1-CRl的反義鏈能夠通過堿基互補直接作用在CREBlmRNA (匪134442)的1156-1174序列上，同時也能通過堿基互補直接作用在ATF1基因mRNA 的 1022-1040 序列上。
[0015]此外，核苷酸序列如SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:30所示(或見表1)的小RNA分子，其也具有相似的抑制靶基因CREB1和ATF1的效果。
[0016]本發(fā)明還提供了由此衍生的含有上述核酸的核心結構的小RNA，包括不同長度的小核酸以及在體內能轉錄生成此類小核酸的小核酸表達載體，也具有相同的抑制炎癥相關因子的功能。
[0017]本領域的技術人員應該理解，本發(fā)明所述的核苷酸序列中的任意一個核苷酸可以是天然無修飾的，也可以是經不同化學方法修飾的，包括肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷酸等。
[0018]另外，本領域的技術人員還應該理解，本發(fā)明所述的核苷酸還可以包括由上述雙鏈核酸衍生出來的單鏈核酸、發(fā)卡核酸等。[0019]此外，本發(fā)明的小RNA藥物可以多肽納米顆粒透皮技術傳送到皮膚的病變組織，實現小RNA藥物的功能，并且本發(fā)明的小RNA可以制成各種制劑，制劑的形式包括霜劑、膏劑、酊劑等各種劑型，用于銀屑病的預防和治療。
[0020]由上可知，本發(fā)明提供了一種能夠用于治療銀屑病的小RNA及其衍生物和藥物制劑。該小RNA通過抑制CREB1和ATF1的表達，抑制銀屑病的致病相關基因產物——TNF α，IL-la，IL6和IL的表達。該小RNA藥物通過皮膚給藥的方式能夠顯著改善5%的咪喹莫特乳膏涂抹小鼠皮膚形成的銀屑病模型鼠的皮膚癥狀，減輕病變皮膚的表皮增厚程度，改善皮膚的角質化，促進病變皮膚的毛發(fā)生長，對治療銀屑病具有一定的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0021]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0022]圖1為人角質細胞HaCaT中轉染siR_l小RNA后靶基因CREB1以及ATF1表達相對水平柱狀圖，NC對照小RNA的序列為正義鏈為5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為 5， -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3，；
[0023]圖2為siR-Ι與透皮多肽納米顆粒組成的透皮劑配方對小鼠皮膚組織的炎性因子基因的表達影響柱狀圖；
[0024]圖3為siR-Ι與透皮多肽納米顆粒組成的透皮劑配方對咪喹莫特藥膏涂抹小鼠CD-1皮膚形成的銀屑病動物模型的皮膚組織的增生及角質化破損的影響對照圖；其中圖3A為正常對照小鼠；圖3B為給造模藥咪喹莫特藥膏50mg/cm221天的銀屑病陽性對照小鼠；圖3C為給造模藥造模藥咪喹莫特藥膏50mg/cm214天形成銀屑病樣皮膚后，再給予生理鹽水的自然恢復組；圖3D為給造模藥14天形成銀屑病樣皮膚后，只給小RNA藥物siR-12 μ g/cm2連續(xù)7天的治療組小鼠；圖3E為正常小鼠只給小RNA藥物siR-12 μ g/cm2連續(xù)7天的對照組；
[0025]圖4為siR-Ι和透皮多肽納米顆粒組成的藥物對小鼠皮膚治療組織切片的HE染色圖，實驗條件同圖3 ；
圖5為本發(fā)明小RNA s1-CRl的核心核苷酸序列的雙鏈結構。
【具體實施方式】
[0026]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0027]本發(fā)明的可用于治療銀屑病的小RNA，其具有如SEQ ID NO:1(或如附圖5)所示的核心核苷酸序列。
[0028]本發(fā)明通過大量的篩選、優(yōu)化和研究，提供了此種能有效沉默CREB1和ATF1的雙鏈小RNA的序列，小RNA s1-CRl具有核心核苷酸序列的雙鏈結構:[0029]5, -GAAACCCCAUCUCUACUAA-3,
[0030]3' -CUUUGGGGUAGAGAUGAUU-5'
[0031]其中小RNA s1-CRl的反義鏈能夠通過堿基互補直接作用在CREBlmRNA(NM_l34442)的1156-1174序列上，同時也能通過堿基互補直接作用在ATF1基因mRNA 的 1022-1040 序列上。
[0032]此外，核苷酸序列如SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:30所示(或見表1)的小RNA分子，其也具有相似的抑制靶基因CREB1和ATF1的效果。
[0033]本發(fā)明還提供了由此衍生的含有上述核酸的核心結構的小RNA，包括不同長度的小核酸以及在體內能轉錄生成此類小核酸的小核酸表達載體，也具有相同的抑制炎癥相關因子的功能。
[0034]本領域的技術人員應該理解，本發(fā)明所述的核苷酸序列中的任意一個核苷酸可以是天然無修飾的，也可以是經不同化學方法修飾的，包括肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷酸等。
[0035]另外，本領域的技術人員還應該理解，本發(fā)明所述的核苷酸還可以包括由上述雙鏈核酸衍生出來的單鏈核酸、發(fā)卡核酸等。
[0036]此外，本發(fā)明的小RNA藥物可以多肽納米顆粒透皮技術傳送到皮膚的病變組織，實現小RNA藥物的功能，并且本發(fā)明的小RNA可以制成各種制劑，制劑的形式包括霜劑、膏劑、酊劑等各種劑型，用于銀屑病的預防和治療。
[0037]以下為具體實施例:
[0038]實施例1:
[0039]小RNA siR-Ι能顯著抑制CREB1、ATF1的mRNA在人角質化細胞中的表達，通過設計上百條小RNA分子進行大量實驗，最終篩選出其中29條，它們能不同程度的抑制靶基因Crebl和Atfl的表達，此29條小RNA分子的序列見表1。
[0040]表1.小RNA單鏈序列(另一條為互補鏈)。
[0041]
【權利要求】
1.可用于治療銀屑病的小RNA，其特征在于:具有如SEQID NO:1至SEQ ID NO:30任一序列所示的核苷酸序列及其互補序列的雙鏈小RNA，其反義鏈可通過堿基互補同時直接作用在CREB1 mRNA的1156-1174序列和ATF1基因mRNA的1022-1040序列上，并抑制此兩基因的表達。
2.根據權利要求1所述的可用于治療銀屑病的小RNA，其特征在于:所述小RNA還包括由所述雙鏈小RNA衍生出來的單鏈核酸、發(fā)卡核酸等。
3.根據權利要求2所述的可用于治療銀屑病的小RNA，其特征在于:所述的核苷酸序列中的任意一個核苷酸可以經化學方法修飾。
4.根據權利要求3所述的可用于治療銀屑病的小RNA，其特征在于:所述化學修飾方法包括肽核苷酸、閉鎖核苷酸、或甲氧-或乙氧修飾等。
5.根據權利要求1至4任一項所述的可用于治療銀屑病的小RNA，其特征在于:所述小RNA以多肽納米顆粒透皮技術傳送到皮膚的病變組織，實現小RNA藥物的功能。
6.包含權利要求1至5任一項所述的可用于治療銀屑病的小RNA的小核酸衍生物。
7.能夠在體內轉錄生成權利要求6所述的小核酸衍生物的小核酸表達載體。
8.根據權利要求1至5任一項所述的可用于治療銀屑病的小RNA制成的藥物制劑。
9.根據權利要求8所述制劑，其`特征在于，所述藥物制劑形式包括霜劑、膏劑、酊劑等。
【文檔編號】A61K48/00GK103736102SQ201310567383
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權日:2013年11月14日
【發(fā)明者】黃兵, 殷勤偉, 張洪杰 申請人:黃兵