腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子及其制備方法，屬于含有卟啉的醫(yī)藥配制品，或利用波能處理材料的方法制得的醫(yī)用配制品。本發(fā)明將功能基團的卟啉或其衍生物與聚醚鏈段的聚乙二醇、聚丙二醇之間經(jīng)化學鍵或基團的酯鍵或酰胺鍵連接，聚合為卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，負載具有共軛結構的化療藥物后透析而成。本方法制備的納米材料產(chǎn)率高，形狀規(guī)則、分布均勻。生物安全性好，能夠對具有共軛結構的抗腫瘤藥物進行有效負載；水溶性的光敏劑經(jīng)近紅外光照射后，可以有效的逆轉化療藥物耐受；可高效的靶向定位腫瘤，并有很好的滯留性并有效抑制腫瘤生長，在制備靶向乳腺癌腫瘤的藥物方面具有廣闊的應用前景。
【專利說明】腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含有卟啉的醫(yī)藥配制品，或利用波能處理材料制得的醫(yī)用配制品，具體涉及一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]化療是惡性腫瘤治療的重要手段之一，然而大量的臨床實踐表明腫瘤的藥物治療效果并不理想，其原因主要包括:(I)化療藥物對腫瘤細胞選擇性差；目前用于腫瘤治療的化療藥物化療藥物在殺死癌細胞的同時，也損傷患者的正常細胞，毒副作用大，極大限制了用藥劑量，嚴重影響治療效果。(2)腫瘤細胞的多重耐藥機制；腫瘤細胞膜上固有的高表達ABC蛋白(如P-糖蛋白)，能將各種抗腫瘤藥物從胞內轉運至胞外，導致胞內藥物濃度降低，表現(xiàn)出天然的耐藥特性，并且用藥過程中還能誘導這些ABC蛋白的表達，從而產(chǎn)生獲得性耐藥，進一步降低了藥物的治療效果。迄今為止，對于肝癌尚無有效的化療藥物。因此，增強化療藥物的腫瘤靶向性和提高藥物對腫瘤細胞的化療敏感性(即提高藥效)是改善腫瘤化療效果的重要途徑。
[0003]多功能納米載體能夠作為多種藥物傳遞的有效平臺，通過識別靶向細胞的獨特表面信號以及對藥物的可控有序釋放，使藥物發(fā)揮協(xié)同增效作用，并顯著降低藥物的毒副作用，在腫瘤化療方面具有獨特的優(yōu)勢。目前關于納米材料應用于藥物腫瘤靶向投遞的已有大量研究，盡管取得了一定的成效，但由于其生物相容性性，最終都極大地限制了其臨床應用。因此，利用生物體自有材料制備腫瘤藥物載體，實現(xiàn)腫瘤的靶向投遞，已成為解決腫瘤化療治療的關鍵問題。
[0004]光動力療法(photo-dynamic therapy, PDT)是二十世紀80年代新發(fā)展起來的一種治療腫瘤的新方法，光敏藥物進入體內，富集于病灶后，在匹配吸收波長的激光作用下，能生成活性很強的單態(tài)氧，產(chǎn)生細胞毒性作用，進而導致細胞受損乃至死亡。由于光動力學療法對靶組織及損傷程度都具有可選擇性，與手術、化療、放療等常規(guī)治療手段相比，可減少對正常組織的損傷。最新研究表明:光動力治療可以增敏化療，光動力療法為腫瘤治療提供了新思路。
[0005]盡管光動力治療在腫瘤的治療中有很多優(yōu)勢，但還面臨很多的問題:1)大部分的光敏劑都是疏水性的，需要用一定的有機溶劑溶解后才能使用，因此很難直接注射到患者的體內；2)光敏劑在體內的代謝較快，因此很難在病灶部位有效的聚集；3)光動力治療自身抑制腫瘤效果非常有限。因此，光動力療法在腫瘤治療中通常作為腫瘤的輔助治療方案。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明就是為了克服化療藥物靶向定位能力差、長期用藥產(chǎn)生的化療耐藥問題，而提供了一種可直接用于臨床注射應用的腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子及制備方法和用途。
[0007]本發(fā)明的設計原理:構建納米載藥體系以實現(xiàn)藥物的腫瘤靶向投遞，并結合光動力療法提高化療效果，實現(xiàn)化療增敏。設計了以生物體自有材料一卟啉為原料制備納米藥物載體，由于卟啉自身形成的大環(huán)共軛結構，與含有共軛結構的化療藥物通過共軛高效負載藥物；卟啉作為光敏劑能選擇性的聚集在腫瘤組織中，負載藥物后可實現(xiàn)藥物的靶向投遞。因此，葉啉材料在醫(yī)學及材料科學等領域均具有良好的應用前景。盡管在腫瘤中的藥物靶向控制投遞和光動力藥物治療過程中取得了一定的研究成果，但都存在一些問題，而且至今沒有一種將水溶性的光敏劑直接用于靶向藥物投遞的技術。
[0008]即本發(fā)明以卟啉或其衍生物與功能化基團封端的聚醚為原料合成，血卟啉結構中存在兩個羧基和兩個羥基，改善了水溶性，并且利用羧基和/或羥基的反應活性與聚醚接枝，合成制備納米粒子的聚合物，并通過透析法制備。
[0009]本發(fā)明是按照以下技術方案實現(xiàn)的。
[0010]一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子，包括由聚醚鏈段和功能基團制備的聚合物，其特征在于:所述功能基團的卟啉或其衍生物與聚醚鏈段的聚乙二醇、聚丙二醇之間經(jīng)化學鍵或基團的酯鍵或酰胺鍵連接，制成卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，并攜帶具有共軛結構的化療藥物而成，葉啉環(huán)在近紅外光照激發(fā)下產(chǎn)生單線態(tài)氧，抑制腫瘤生長，所述納米粒子的粒徑為20-80nm,外形為球形或接近球形。
[0011] 一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，
①卟啉或其衍生物-聚乙二醇納米藥物載體的合成
a.按0.5-3mg/lml濃度將卟啉或其衍生物與2-嗎啉乙磺酸(MES)的混合溶液室溫攪拌過夜；
b.將羧基活化基團的EDC3-20 mg、NHS 2_15mg室溫活化5_6h，加入上述混合溶液IOml中，室溫下攪拌2~8h后，加入2-巰基乙醇15-85 ul淬滅EDC，NaOH調整pH值至
7.5~8.0，備用；
c.將淬滅后溶液緩速滴加到濃度為4-10mg/lml雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇的磷酸鹽緩沖液IOml中，攪拌過夜，并轉移至透析袋中，在硼酸鹽緩沖液中透析48h，得到卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，備用；
②載藥卟啉或其衍生物納米材料的合成
a.按濃度l_2mg/lml將具有共軛結構化療藥物溶解于雙蒸水中，室溫下攪拌lh，備
用；
b.按0.5mg/ml濃度,取2ml上述藥液逐滴加入到1_8 mL卟啉或其衍生物納米粒子水分散液中，4°C室溫避光過夜后，置于透析袋中，雙蒸水透析2h，得到粒徑為20-80nm的腫瘤革巴向的光動力載藥納米粒子。
[0012]所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子在制備治療癌癥藥物中的應用，
a.腫瘤靶向光動力載藥納米粒子在制備治療乳腺癌藥物中的應用；
b.腫瘤靶向光動力載藥納米粒子在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0013]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1.載體載藥效率高，載藥率達到80%以上，并有很好的緩釋和控釋能力；
2.納米材料近紅外光照射后，有效的協(xié)助化療藥物阿霉素從胞漿進入細胞核；
3.藥物半數(shù)抑制濃度降低8倍以上，有效的逆轉了化療藥物耐受；
4.近紅外光照射納米藥物載體后，有效的啟動線粒體一凋亡信號通路，誘導細胞凋亡；
5.尾靜脈體內注射治療,納米藥物載體高效的靶向定位腫瘤,并有很好的滯留性并有效抑制腫瘤生長。
[0014]因此，本發(fā)明對腫瘤具有主動靶向性，能高效攜帶具有共軛結構的抗腫瘤藥物，實現(xiàn)藥物在腫瘤病灶部位的有序釋放，并且在近紅外光照響應下有效的抑制腫瘤的體內外生長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是原料血卟啉(HP)的核磁圖譜；
圖2是雙端氨基封端異丙基聚乙二醇(PEG)的核磁圖譜；
圖3是合成的血卟啉-聚乙二醇納米藥物載體(HPP)的核磁圖譜；
圖4是實施例1中HP的的原子力顯微鏡照片；
圖5是實施例1中HPP的原子力顯微鏡照片；
圖6是實施例1中HP的透射電鏡照片；
圖7是實施例1中HPP的透射電鏡照片；
圖8是實施例1中不同比例的原料血卟啉、阿霉素(Dox，ADR)合成納米粒子的熒光譜 圖；
圖9是實施例1中制備的HPH)納米粒子在不同pH值及有無近紅外光照條件下的藥物釋放曲線；
圖10實施例1中制備的HPro納米粒子的粒徑分布圖；
圖11為實施例1中制備的HPro納米粒子對阿霉素耐藥乳腺癌細胞(ADR/MCF-7)藥物半數(shù)抑制濃度測定曲線圖；
圖12是實施例1中制備的HPro納米粒子對ADR/MCF-7小鼠模型的體內抑瘤效果和組織分布圖；
圖13是實施例1中未光照HPH)納米粒子對ADR/MCF-7小鼠模型的組織分布圖；
圖14是實施例1中光照HPH)納米粒子對ADR/MCF-7小鼠模型的組織分布圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行具體描述。
[0017]一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子，包括由聚醚鏈段和功能基團制備的聚合物，所述功能基團的卟啉或其衍生物與聚醚鏈段的聚乙二醇、聚丙二醇之間經(jīng)化學鍵或基團的酯鍵或酰胺鍵連接，制成卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，并攜帶具有共軛結構的化療藥物而成，葉啉環(huán)在近紅外光照激發(fā)下產(chǎn)生單線態(tài)氧，抑制腫瘤生長，所述納米粒子的粒徑為20-80nm,外形為球形或接近球形。
[0018]所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子，其卟啉或其衍生物一聚乙二醇納米粒子水分散液冷凍干燥后為紅棕色粉末狀聚合物，或紫色粉末狀聚合物。
[0019]一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，
①卟啉或其衍生物-聚乙二醇納米藥物載體的合成
a.按0.5-5mg/lml濃度將卟啉或其衍生物與2-嗎啉乙磺酸(MES)的混合溶液室溫攪拌過夜；
b.將羧基活化基團的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)3-20 mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 2-15 mg室溫活化5-6h，加入上述混合溶液IOml中，室溫下攪拌2~8h后，加入2-巰基乙醇15-85 ul淬滅EDC，NaOH調整pH值至7.5~8.0，備用；
c.將淬滅后溶液緩速滴加到濃度為4-10mg/lml雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇的磷酸鹽緩沖液(PBS) IOml中，攪拌過夜，并轉移至透析袋中，在硼酸鹽緩沖液中透析48h，得到卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，備用；
②載藥卟啉或其衍生物納米材料的合成
a.按濃度l_2mg/lml將具 有共軛結構化療藥物溶解于雙蒸水中，室溫下攪拌lh，備
用；
b.按0.5mg/ml濃度,取2ml上述藥液逐滴加入到1_8 mL卟啉或其衍生物納米粒子水分散液中，4°C室溫避光過夜后，置于透析袋中，雙蒸水透析2h，得到粒徑為20-80nm的腫瘤革巴向的光動力載藥納米粒子。
[0020]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其具有共軛結構化療藥物是阿霉素，或表阿霉素，或米托蒽醌。
[0021]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，所述的卟啉或其衍生物為原卟啉，或血卟啉，或尿卟啉、或糞卟啉。
[0022]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇的分子量為2000-6000Da。
[0023]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，所述具有共軛結構的化療藥物與納米藥物載體中的質量比為8:廣1:8。
[0024]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為2: f 1:1。
[0025]所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其如②b所述透析袋的截留分子量為2000-6000Da，同時大于使用的聚乙二醇分子量；透析后載藥納米粒子的粒徑為20_80nm。
[0026]所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子在制備治療癌癥藥物中的應用，
a.腫瘤靶向光動力載藥納米粒子在制備治療乳腺癌藥物中的應用；
b.腫瘤靶向光動力載藥納米粒子在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0027]實施例一:
1、血卟啉一聚乙二醇(HPP)納米藥物載體的合成
X稱取22mg血卟啉，溶于22mL 2-嗎啉乙磺酸(MES) (200mM, pH=6.0)緩沖液，室溫攪拌過夜；加入12.6 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，7.6 mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中，羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為1: 1，室溫活化5-6h，加入28uL 2-巰基乙醇淬滅EDC ；
I稱取60 mg雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)(分子量為1500)溶于10 mL 200 mM磷酸鹽緩沖液(PBS) (200mM，pH =7.5~8.0)，將步驟X中溶液用NaOH(IM)迅速調節(jié)pH值至7.5^8.0，移入恒壓滴液漏斗，控制滴加速度(IOs/滴)，攪拌反應過夜，硼酸緩沖液(200mM，pH= 8.5)透析48h (截留分子量2000 Da)。得到HPP納米粒子水分散液。將此分散液冷凍干燥，即得紅棕色粉末狀產(chǎn)物，其結構確證圖譜見圖3。動態(tài)光散射測得粒徑29nm，載藥納米材料粒徑24nm。
[0028]2、載藥血卟啉(HPPD)納米材料的合成
取20mg阿霉素(Dox)溶解于IOmL雙蒸水中，室溫下攪拌Ih,備用；取2mL配好的阿霉素溶液逐滴加入到5mL HPP納米粒子水分散液(0.5mg/mL), 4°C過夜后，置于透析袋中，用雙蒸水透析處理2h。其結構確證圖譜見圖4-7。粒徑分布見圖10。阿霉素的載藥量采用紫外分光光度計法檢測(檢測波長為480nm)，為85.2%，結果見圖8。載藥納米材料粒徑35nm。
[0029]3、載藥納米粒子的體外藥物釋放
將IOmL HPPD放于透析袋(截留分子量1000 Da)中，分別置于50mL pH 5.8和pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，37 °C,100 rpm避光振蕩，規(guī)定時間點將整個釋放介質用新鮮介質置換，紫外分光光度計法檢測(檢測波長為480nm)。藥物釋放百分率按照以下公式進行計算:釋放百分率=(藥物釋放量/藥物總量)X 100%。結果如圖9所示，載藥納米粒子可以有效的實現(xiàn)藥物控制釋放。
[0030]4、HPPD對耐藥乳腺癌細胞ADR/MCF-7的細胞毒性
將指數(shù)生長期ADR/MCF-7細胞以6000個/每孔接種于96孔培養(yǎng)板中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，傾去培養(yǎng)基，加入150 μ L培養(yǎng)基及不同濃度的游離ADR或HPTO納米分散液及光照條件下的HPH)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用MTT法:每孔加入3- (4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 yL,37 1:繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基 亞砜(DMSO) 150 yL，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以空白調零，并設對照無處理孔。測每孔的光密度值(0D值)，計算存活率；
存活率=(實驗孔OD值/對照孔OD值)X 100 %
根據(jù)細胞存活率(如圖11)，利用IC50計算軟件得到IC50。結果顯示，HPH)照射IC50值較單藥治療治療組降低了近9倍，有效降低了藥物用量，逆轉了化療耐受。
[0031 ] 5、HPPD在ADR/MCF-7細胞中的蓄積及分布
稱取10.9 mg異硫氰酸熒光素(FITC)溶于ImL DMS0,緩慢加入上述HPTO水分散液攪拌反應過夜，透析48h備用。
[0032]ADR/MCF-7細胞培養(yǎng)后接種于玻璃底細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為5 X IO4細胞/mL， 分別加入游離ADR和FITC標記的HPH)納米分散液(ADR溶度16.7 μ g/ml), 37°C孵育
4 h后近紅外光照70s，24h后，棄去培養(yǎng)液，用冷PBS液洗3次，3.7%多聚甲醛固定15 min,用激光共聚焦顯微鏡觀察(圖12)。結果顯示HPH)經(jīng)紅外照射后能攜載阿霉素藥物由胞漿進入細胞核，有利于逆轉腫瘤多藥耐藥。
[0033]6、HPro的體內抑瘤效果
ADR/MCF-7乳腺癌小鼠模型:取裸鼠(雌性)，4飛周齡，體重18~22g，隨機分為5組，分別為對照組、HPP +照射組、游離阿霉素(Dox)組、HPH)組和HPH) +照射組，每組8只小鼠，按
3.2 mg/kg藥物劑量尾靜脈給藥，每周給藥三次，給藥三周。測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。結果表明，游離藥物組對腫瘤抑制效果不理想，至觀察期結束，腫瘤體積一直持續(xù)快速生長，相對腫瘤體積比(治療后腫瘤體積與初始腫瘤體積比)從1.0增至5.0 ;而HPro +照射組可以顯著抑制腫瘤生長，在觀察期第10天，即可以完全抑制腫瘤生長。
[0034]MHCC-97H肝癌小鼠模型:取裸鼠(雌性)，4飛周齡，體重18~22g，隨機分為5組，分別為對照組、游離Dox組(5mg/kg)、HPPD組(1.5mg/kg)、HPPD組(5mg/kg),每周給藥三次，給藥兩周。測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。結果表明，HPH) (1.5mg/kg)給藥組在觀察期內，相對腫瘤體積比(治療后腫瘤體積與初始腫瘤體積比)始終維持在1.0左右；ΗΡΗ)(5mg/kg)給藥組給藥兩周后,相對腫瘤體積比由I降到了 0.2，結果表明,HPF1D納米藥物可以有效抑制了腫瘤的體內生長。 [0035]7、HPPD在小鼠體內的組織分布
取N-羥基丁二酰亞胺封端封端的cy-5.5溶解于DMSO中20 μ L (I mg/mL),逐滴加入500yL合成的HPP，室溫攪拌2h，透析48h (截留分子量1000 Da)后，制備cy5.5-HPH)。
[0036]MHCC-97H肝癌模型:將裸鼠隨機分為3組，分別為PBS_cy5.5、PEG_cy5.5、HPPD-cy5.5，按0.4ug/g熒光劑量尾靜脈給藥，2h和24 h運用小動物成像儀觀察納米藥物在小鼠各組織臟器中的分布。結果表明，2h尾靜脈注射PBS-cy5.5后，熒光信號強，且平均分布在小鼠各組織臟器中，24h后熒光基本在各組織臟器中全部消失，表明cy5.5熒光燃料沒有組織靶向性；PEG-cy5.5組2h尾靜脈注射后，熒光集中在腫瘤和腎臟中，24h主要集中在腎臟；HPro-cy5.5組2h尾靜脈注射后，熒光集中在腫瘤和腎臟中，24h后熒光主要富集在腫瘤，說明納米藥物具有很強的腫瘤靶向性和腫瘤滯留性。
[0037]ADR/MCF-7乳腺癌模型:將裸鼠隨機分為2組，分別為HPro_cy5.5,HPPD-cy5.5 +照射組，按0.4 μ g/g熒光劑量尾靜脈給藥，2h和24 h運用小動物成像儀觀察納米藥物在小鼠各組織臟器中的分布。結果表明，相對于HPro-cy5.5組，照射組能夠更加有效的增加納米藥物在腫瘤部位的富集，減少腎臟的攝取。
[0038]本發(fā)明藥物體內分布見圖13、14。
[0039]8、HPPD在小鼠體內的急性毒性實驗。
[0040]取裸鼠(雌性)，4飛周齡，體重If 22 g，隨機分為3組，分別為對照組、游離Dox組、HPPD,每組3只小鼠，按10mg/kg藥物劑量尾靜脈給藥，24h后取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等器官，勻漿后，加入甲醇溶液萃取組織中的阿霉素，4度，5000rpm離心lOmin，2次，取上清，紫外分光光度計測定阿霉素在各器官中的藥物分布。
[0041]結果表明,Dox通過HPF1D的攜載,藥物在心臟中的分布顯著降低(從84 μ g/g降低到60 μ g/g)，有利于緩解ADR的心臟毒性；此外，通過HPH)的攜載，Dox主要分布于腫瘤組織(50增加至135 μ g/g)，明顯高于其它器官組織。
[0042]實施例二:
血卟啉一聚乙二醇(HPP)納米藥物載體的合成
1:稱取111^血卟啉，溶于221^1^(200禮，ρΗ=6.0)緩沖液，室溫攪拌過夜。加入12.6 mg EDC, 7.6 mg NHS室溫活化5_6h，其中，羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為2:1，加入15 μ L 2-巰基乙醇淬滅EDC;
I 稱取 30 mg NH2-PEG-NH2 (分子量為 2500)溶于 10 mL 200 mM PB 緩沖液(200mM,pH =7.5~8.0)，將步驟X中溶液用NaOH (1M)迅速調節(jié)pH值至7.5~8.0，移入恒壓滴液漏斗，控制滴加速度(IOs/滴)，攪拌反應過夜，硼酸緩沖液(200mM，pH= 8.5)透析48h (截留分子量3000 Da)。得到HPP納米粒子水分散液。將此分散液冷凍干燥，即得紅棕色粉末狀產(chǎn)物2。動態(tài)光散射測得粒徑29nm。
[0043]實施例三:
血卟啉一聚乙二醇(HPP)納米藥物載體的合成
I稱取22mg血卟啉，溶于22mL MES (200mM，ρΗ=6.0)緩沖液，室溫攪拌過夜。加入15 mg EDC, 9 mg NHS室溫活化5_6h，其中，羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為1.2:1，加入55 μ L 2-巰基乙醇淬滅EDC;.2；稱取 50 mg NH2-PEG-NH2 (分子量為 4000)溶于 10 mL 200 mM PB 緩沖液(200mM,pH =7.5~8.0)，將步驟I中溶液用NaOH (1M)迅速調節(jié)pH值至7.5~8.0，移入恒壓滴液漏斗，控制滴加速度(IOs/滴)，攪拌反應過夜，硼酸緩沖液(200mM，pH= 8.5)透析48h (截留分子量5000 Da)。得到HPP納米粒子水分散液。將此分散液冷凍干燥，即得紅棕色粉末狀產(chǎn)物3。動態(tài)光散射測得粒徑30nm。
[0044]實施例四:
糞卟啉一聚乙二醇(PP)納米藥物載體的合成
X稱取111^糞卟啉，溶于221^1^(200禮，ρΗ=6.0)緩沖液，室溫攪拌過夜。加入19.3 mg EDC, 11.6 mg NHS室溫活化5_6h，其中，羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為1.5:1，加入56 μ L 2-巰基乙醇淬滅EDC;
J；稱取 60 mg NH2-PEG-NH2 (分子量為 1500)溶于 10 mL 200 mM PB 緩沖液(200mM,pH =7.8.0)，將步驟φ中溶液用NaOH (1Μ)迅速調節(jié)pH值至7.5^8.0，移入恒壓滴液漏斗，控制滴加速度(IOs/滴)，攪拌反應過夜，硼酸緩沖液(200mM，pH= 8.5)透析48h (截留分子量2000 Da)。得到HPP納米粒子水分散液。將此分散液冷凍干燥，即得深紫色色粉末狀產(chǎn)物4。
[0045]實施例五:
載藥血卟啉(HPPD)納米材料的合成
取20mg表阿霉素溶解于IOmL雙蒸水中，室溫下攪拌Ih,備用；取ImL配好的表阿霉素溶液逐滴加入到0.5mL實施例1中制備的HPP納米粒子水分散液(0.5mg/mL),其中，化療藥物與納米藥物載體的質量比為8:1，4° C過夜后，置于透析袋中，用雙蒸水透析處理2h。載藥量采用紫外分光光度計法檢測，為80.1%。動態(tài)光散射測得粒徑67nm。
[0046]實施例六:
載藥血卟啉(HPPD)納米材料的合成
取IOmg表阿霉素溶解于IOmL雙蒸水中，室溫下攪拌Ih,備用；取ImL配好的表阿霉素溶液逐滴加入到2mL實施例1中制備的HPP納米粒子水分散液(0.5mg/mL)，其中，化療藥物與納米藥物載體的質量比為1:1，4° C過夜后，置于透析袋中，用雙蒸水透析處理2h。載藥量采用紫外分光光度計法檢測，為86.1%。動態(tài)光散射測得粒徑70nm。
[0047]載藥血卟啉(HPPD)納米材料的合成
取5mg表阿霉素溶解于IOmL雙蒸水中，室溫下攪拌Ih,備用；取ImL配好的表阿霉素溶液逐滴加入到8mL實施例1中制備的HPP納米粒子水分散液(0.5mg/mL)，其中，化療藥物與納米藥物載體的質量比為1:8，4° C過夜后，置于透析袋中，用雙蒸水透析處理2h。載藥量采用紫外分光光度計法檢測，為89.3%。動態(tài)光散射測得粒徑73nm。
[0048]實施例七:
載藥血卟啉(HPPD)納米材料的合成
取IOmg米托蒽醌溶解于IOmL雙蒸水中，室溫下攪拌lh，備用；取2mL配好的米托蒽醌溶液逐滴加入到5mL實施例1中制備的HPP納米粒子水分散液(0.5mg/mL)，其中，化療藥物與納米藥物載體的質量比為4:5，4° C過夜后，置于透析袋中，用雙蒸水透析處理2h。載藥量采用紫外分光光度 計法檢測，為85.2%。動態(tài)光散射測得粒徑62nm。
[0049]實施例五和實施例六的載藥納米粒子的體外藥物釋放、細胞毒性、體內抑瘤效果等實驗與實施例1中數(shù)據(jù)相仿，在此不重復敘述。
【權利要求】
1.一種腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子，包括由聚醚鏈段和功能基團制備的聚合物，其特征在于:所述功能基團的卟啉或其衍生物與聚醚鏈段的聚乙二醇、聚丙二醇之間經(jīng)化學鍵或基團的酯鍵或酰胺鍵連接，制成卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，并攜帶具有共軛結構的化療藥物而成，葉啉環(huán)在近紅外光照激發(fā)下產(chǎn)生單線態(tài)氧，抑制腫瘤生長，所述納米粒子的粒徑為20-80nm,外形為球形或接近球形。
2.根據(jù)權利要求1所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子，其特征在于:卟啉或其衍生物一聚乙二醇納米粒子水分散液冷凍干燥后為紅棕色粉末狀產(chǎn)物，或紫色粉末狀產(chǎn)物。
3.如權利要求1所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于: ①卟啉或其衍生物-聚乙二醇納米藥物載體的合成 a.按0.5-3mg/lml濃度將卟啉或其衍生物與2-嗎啉乙磺酸(MES)的混合溶液室溫攪拌過夜； b.將羧基活化基團的EDC3-20 mg、NHS 2_15mg室溫活化5_6h，加入上述混合溶液IOml中，室溫下攪拌2~8h后，加入2-巰基乙醇15-85 ul淬滅EDC，NaOH調整pH值至7.5~8.0，備用； c.將淬滅后溶液緩速滴加到濃度為4-10mg/lml雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇的磷酸鹽緩沖液IOml中，攪拌過夜，并轉移至透析袋中，在硼酸鹽緩沖液中透析48h，得到卟啉或其衍生物納米粒子水分散液，備用；
②載藥卟啉或其衍生物納米材料的合成 a.按濃度l_2mg/lml將具有共軛結構化療藥物溶解于雙蒸水中，室溫下攪拌lh，備用； b.按0.5mg/ml濃度,取2ml上述藥液逐滴加入到1_8 mL卟啉或其衍生物納米粒子水分散液中，4°C室溫避光過夜后，置于透析袋中，雙蒸水透析2h，得到粒徑為20-80nm的腫瘤革巴向的光動力載藥納米粒子。
4.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:具有共軛結構化療藥物是阿霉素，或表阿霉素，或米托蒽醌。
5.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:所述的卟啉或其衍生物為原卟啉，或血卟啉，或尿卟啉、或糞卟啉。
6.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:雙端氨基封端的異丙基聚乙二醇的分子量為1500-5000Da。
7.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:所述具有共軛結構的化療藥物與納米藥物載體中的質量比為8: f 1:8。
8.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:羧基活化基團的EDC、NHS與卟啉或其衍生物中羧基單元的摩爾比為2:1:1。
9.根據(jù)權利要求3所述瘤靶向的光動力載藥納米粒子的制備方法，其特征在于:如②b所述透析袋的截留分子量為2000-6000Da，同時大于使用的聚乙二醇分子量；透析后載藥納米粒子的粒徑為20_80nm。
10.如權利要求1或3所述腫瘤靶向的光動力載藥納米粒子在制備治療癌癥藥物中的應用， a.腫瘤靶向光動力載藥納米粒子在制備治療乳腺癌藥物中的應用；b.腫瘤靶向光 動力載藥納米粒子在制備治療肝癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/704GK103536919SQ201310505945
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權日:2013年10月24日
【發(fā)明者】張寧, 任玉, 王銀松, 郭華 申請人:天津市腫瘤研究所