利用wave波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，該方法包括：（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；（2）病毒液的增殖：沉降微載體、洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種豬圓環(huán)病毒2型病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；（3）將病毒液滅活后，乳化，即得。本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)PK15細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了PK15細(xì)胞的培養(yǎng)效率，最終顯著提高了豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力。免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明方法所制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗對于家畜有確切的免疫保護(hù)效力。
【專利說明】利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，屬于豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進(jìn)而增殖豬圓環(huán)病毒。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過程中對細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時補(bǔ)給，無法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動化程度低，勞動強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠，批間差較大。而PCV2的生物學(xué)特殊性比較特殊，它在細(xì)胞上的增殖滴度很低，而且不引起細(xì)胞病變，因此產(chǎn)毒滴度較低也是一個更為重要的問題，并且與當(dāng)前大規(guī)模動物疫苗生產(chǎn)不相適應(yīng)。此外如要擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模只能通過增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量的方法，結(jié)果導(dǎo)致車間規(guī)模、設(shè)備通入、人員等需求更大，勞動量更大。另外提高病毒毒價，保證良好的臨床效果是解決豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗產(chǎn)業(yè)化的當(dāng)務(wù)之急。而用生物反應(yīng)器替代轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)疫苗株則克服了上述所述不足，成為最具有前途的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗生產(chǎn)技術(shù)之一。
[0003]WAVE波浪生物反應(yīng)器是采用拋棄型生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的一種新型反應(yīng)器，其工作方式是，細(xì)胞接種于可拋棄的細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，接種細(xì)胞的培養(yǎng)袋固定在托盤上以一定的方式搖動，精密控制的搖動保證了培養(yǎng)體系的有效混合和傳氧效率。采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，主要優(yōu)點(diǎn)有:1)免除生物反應(yīng)器清洗、消毒及其相關(guān)認(rèn)證。2)封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，無需固定的管道，簡化細(xì)胞培養(yǎng)廠房，縮短反應(yīng)器安裝和生產(chǎn)產(chǎn)品轉(zhuǎn)換時間。3)細(xì)胞培養(yǎng)袋Cellbag放在特殊設(shè)計(jì)的搖動平臺上，平臺的搖動在培養(yǎng)液中產(chǎn)生波浪提供培養(yǎng)物混合和氧氣傳遞，產(chǎn)生一個適于細(xì)胞生長的完美環(huán)境。
[0004]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗時，所加入微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)袋的搖動參數(shù)等生產(chǎn)條件對于豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力的高低等有非常顯著的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中需要對這些條件進(jìn)行優(yōu)化才能有效提高豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，該方法對微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有效提升了豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，包括:(I)細(xì)胞的培養(yǎng):將PK15細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種豬圓環(huán)病毒2型病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液滅活后，乳化，得到豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗；其中，所述的搖動條件為擺動角度8°、擺動速度為14rpm。[0008]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)PK15細(xì)胞時，搖動培養(yǎng)參數(shù)對于細(xì)胞在微載體上的吸附以及細(xì)胞生長有非常顯著的影響，為了篩選到最適宜的搖動培養(yǎng)參數(shù)以最大限度的促進(jìn)細(xì)胞生長，本發(fā)明對搖動培養(yǎng)時的擺動角度以及擺動速度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化考察，觀察不同的培養(yǎng)條件對于細(xì)胞的生長所帶來的影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對于細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞進(jìn)行搖動培養(yǎng)時，擺動角度以及擺動速度對于細(xì)胞的生長有非常顯著的影響；本發(fā)明最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)搖動培養(yǎng)時的培養(yǎng)條件為擺動角度8°、擺動速度為14rpm能夠最為顯著的促進(jìn)細(xì)胞的生長，該培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長速度顯著高于其它的培養(yǎng)條件。
[0009]此外，細(xì)胞接種密度與微載體含量對細(xì)胞生長的影響也密切相關(guān)，其中重要的標(biāo)志是接種時要保證合適的細(xì)胞密度與載體的比例關(guān)系。在每克微載體接種相同細(xì)胞數(shù)的前提下，本發(fā)明考察微載體(Cytodexl)含量為 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L時細(xì)胞生長情況，用來確定合適的載體用量。為了生產(chǎn)高滴度的病毒，需要細(xì)胞密度較高，同時，為了較快和高效的培養(yǎng)細(xì)胞，又要求細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，隨著微載體含量的增加，細(xì)胞密度會有所增加，但細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較低。當(dāng)微載體含量為3g/L時，不僅細(xì)胞密度高，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)也較高。
[0010]在確定了微載體最適宜用量的基礎(chǔ)上，本發(fā)明為3g/L的微載體用量，分別以不同的接種密度接種細(xì)胞，每天取樣分析，以篩選最適宜的細(xì)胞接種密度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)微載體含量相等，不同的接種密度對PK15細(xì)胞生長影響較大。以5X 104、I X IO5個/mL接種時，接種密度低接種后5天仍在緩慢生長，沒有進(jìn)入穩(wěn)定生長期的明顯標(biāo)志；以2X105、3X 105、4X 105、5X 105、6X IO5個/mL接種時接種密度高，PK15細(xì)胞在接種后第2天進(jìn)入穩(wěn)定生長期；隨著細(xì)胞接種密度的增高，PK15細(xì)胞生長速度的增加并不與細(xì)胞接種密度增加保持同步；iPK15細(xì)胞接種密度為3 X IO5個/mL時，PK15細(xì)胞在第4天和第5天后的生長速度要明顯高于其它接種密度的生長速度，因此，本發(fā)明優(yōu)選采用3X IO5個/mL的接種量接種PK15細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)PK15細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了PK15細(xì)胞的培養(yǎng)效率，最終顯著提高了豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力；免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明方法所制備的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗對于家畜有確切的免疫保護(hù)效力。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施方案來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0013]生物材料及儀器
[0014]1.1、生物反應(yīng)器:美國Wave Biotech公司W(wǎng)AVE波浪生物反應(yīng)器。
[0015]1.2、微載體=Cytodex-1 (購自美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)。[0016]1.3、豬圓環(huán)病毒2型病毒毒株:購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.5774。
[0017]實(shí)施例1利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗
[0018]1.細(xì)胞的培養(yǎng)
[0019]1.1微載體處理:按培養(yǎng)的終體積稱取微載體(Cytodex-1)適量，用無Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過夜，棄去PBS，再用無Ca2+、Mg2+-PBS洗一次，棄去，最后加入無Ca2+、Mg2+-PBS 高壓滅菌(115°C、lOps1、15min)。
[0020]1.2細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng):用方瓶培養(yǎng)從液氮罐中復(fù)蘇的PK15細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括:pH值7.2、溫度37°C ;培養(yǎng)48-72h，形成良好細(xì)胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)；該過程中使用的培養(yǎng)基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。
[0021]1.3微載體培養(yǎng):用EDTA-胰酶細(xì)胞消化液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按2 X IO5個ZmL的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為:微載體濃度為2g/L、DO值50%、溫度37°C、擺動角度7°、擺動速度16次/min。在培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產(chǎn)生，同時在不同的節(jié)點(diǎn)上細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cytodexl上的細(xì)胞計(jì)數(shù)先用PBS漂洗2次，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核)，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到I X 106-2X IO6個/mL時開始灌注，依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2個工作體積的速度，以維持細(xì)胞的生成。
[0022]2.病毒液的增殖
[0023]當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到達(dá)第四天時沉降微載體，排出細(xì)胞培養(yǎng)袋中液體，加入PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，加入病毒 維持液并接種豬圓環(huán)病毒2型，其中病毒接種劑量為5%、病毒增值的培養(yǎng)基為含1%血清的MEM，pH值7.4，溫度36.5°C，培養(yǎng)24h后將細(xì)胞維持液棄去，以0.01mol/L的PBS充分洗滌接種病毒的細(xì)胞，加入D-氨基葡萄糖孵育30min，棄去D-氨基葡萄糖，將細(xì)胞以0.01mol/L、pH為7.4的PBS充分洗滌，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。連續(xù)培養(yǎng)10天后，收獲病毒液，于-20°C凍融兩次，得到豬圓環(huán)病毒2型病毒液。
[0024]3.病毒液滅活及乳化制成疫苗
[0025]收獲病毒液用甲醛溶液滅活，甲醛溶液終濃度0.1%，37°C滅活24h。滅活后的豬圓環(huán)病毒2型加入常規(guī)油性佐劑，攪拌混勻，制得豬圓環(huán)病毒2型病毒油乳劑滅活疫苗。
[0026]實(shí)驗(yàn)例I微載體含量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0027]細(xì)胞接種密度與微載體含量對細(xì)胞生長的影響密切相關(guān)，其中重要的標(biāo)志是接種時要保證合適的細(xì)胞密度與載體的比例關(guān)系；為了生產(chǎn)高滴度的病毒，需要細(xì)胞密度較高，同時，為了較快和高效的培養(yǎng)細(xì)胞，又要求細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較高。
[0028]在每克微載體接種相同PK15細(xì)胞數(shù)的前提下，考察Cytodexl含量為lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L時PK15細(xì)胞生長情況，用來確定合適的載體用量。
[0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著微載體含量的增加，PK15細(xì)胞密度會有所增加，但PK15細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)卻有所降低。微載體含量為3g/L時，PK15細(xì)胞生長較快，培養(yǎng)時間為5天時，PK15細(xì)胞密度達(dá)到了 1.68X 107g/L，非常顯著的高于其它的微載體的細(xì)胞密度；此外，當(dāng)微載體含量高于3g/L時，PK15細(xì)胞生長的增加速度不顯著。因此，本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)PK15細(xì)胞時，所加入的微載體的含量優(yōu)選為3g/L。
[0030]表1不同微載體含量PK15細(xì)胞生長情況(單位個/mL)[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法，包括:(I)細(xì)胞的培養(yǎng):將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞；接種豬圓環(huán)病毒2型病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液滅活后，乳化，得到豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗；其特征在于:步驟(1)中所述的搖動參數(shù)為擺動角度8°、擺動速度為14rpm。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的細(xì)胞是PK15細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的微載體是Cytodex-1。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:微載體在細(xì)胞培養(yǎng)袋中的含量是3g/L。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:將細(xì)胞按照3X IO5個/mL的接種量接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上。
6.由權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述方法制備得到的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。
7.權(quán)利要求7所述的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗在制備預(yù)防或治療由豬圓環(huán)病毒所導(dǎo)致疾病藥物中的用途。
8.一種預(yù)防或治療由豬圓環(huán)病毒所導(dǎo)致疾病的藥物組合物，其特征在于:含有預(yù)防或治療上有效量的權(quán)利 要求6所述的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。
【文檔編號】A61K39/12GK103520715SQ201310486413
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】喬云龍, 張嬌嬌, 楊艷坤, 李山峰 申請人:黑龍江省百洲生物工程有限公司