抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料及其應(yīng)用，通過(guò)如下步驟制備得到：采用光化學(xué)固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過(guò)在光固定電性材料上共接枝TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料；所述帶電荷的電性材料為帶負(fù)電荷的聚丙烯酸（PAAc），電中性的聚乙烯乙二醇（PEG），帶正電的聚丙烯胺（PAAm）。本發(fā)明制備的共固定電性生物材料不僅可以提高人肝細(xì)胞HSC的存活率，而且可以有效抑制HSC細(xì)胞的衰老。
【專利說(shuō)明】抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是人體的重要器官，是人體的物質(zhì)代謝中心，它具有代謝、排毒、循環(huán)調(diào)控等功能。然而，肝癌、急性肝功能衰竭(比如脂肪肝、肝硬化、肝炎)等疾病每年導(dǎo)致大量的死亡，對(duì)人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。由于肝臟是人體獨(dú)一無(wú)二的器官，無(wú)法進(jìn)行自體移植；而異體移植，會(huì)造成組織免疫排斥反應(yīng)，抗排斥治療失敗將意味著前功盡棄；并且受到器官供給來(lái)源的限制，肝供體奇缺，難以滿足臨床的需求。所以尋求一種理想的器官組織替代或修復(fù)用品，是臨床醫(yī)學(xué)和材料研究者們的共同追求，而肝組織工程為這一設(shè)想的實(shí)現(xiàn)提供了可能。
[0003]然而，肝臟是大型的體內(nèi)器官，很難在體外生長(zhǎng)。此外，由于肝細(xì)胞各種各樣的功能以及其對(duì)氧氣的高需求，且良好的介質(zhì)傳遞過(guò)程對(duì)于肝細(xì)胞的存活亦很重要。因而，肝組織工程研究還有許多問(wèn)題等待解決。
[0004]肝組織工程研究主要圍繞種子細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)材料即支架材料以及組織和器官的構(gòu)建與再生展開(kāi)，而肝臟組織工程的發(fā)展在很大程度上依賴于種子細(xì)胞，數(shù)量充足且不會(huì)引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)的種子細(xì)胞是形成新生組織的必要條件。而種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)會(huì)隨著傳代的增加而衰老，即細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)一段時(shí)間會(huì)逐漸老化，喪失其特有的功能，從而難以獲得組織工程所需的大量細(xì)胞。這對(duì)肝組織工程的構(gòu)建產(chǎn)生不利影響，因此，研究延緩和防止種子細(xì)胞老化是人體組織工程中迫切需要解決的問(wèn)題。
[0005]在延緩肝細(xì)胞衰老的生物材料的研究方面，目前還尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中在研究延緩肝細(xì)胞衰老的生物材料方面的不足，提供了三種抗肝細(xì)胞衰老的生物材料的制備方法。
[0007]本發(fā)明同時(shí)提供了上述生物材料的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，通過(guò)如下步驟制備得到:采用光化學(xué)固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過(guò)在光固定電性材料上接枝共固定的TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料；
所述帶電荷的電性材料為帶負(fù)電荷的聚丙烯酸(PAA c )，電中性的聚乙烯乙二醇(PEG),帶正電的聚丙烯胺(PAAm)。
[0009]優(yōu)選的，所述聚合物培養(yǎng)板為聚苯乙烯培養(yǎng)板。
[0010]本發(fā)明在光固定電性材料上接枝共固定的TNF-a和IGF，是通過(guò)在光固定電性材料中同時(shí)加入TNF-a和IGF反應(yīng)獲得，其中TNF_a和IGF的質(zhì)量比例可以為1:2~2:1，優(yōu)選為 1:1。
[0011]將生長(zhǎng)因子TNF-a和IGF與生物材料結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子逐步釋放，從而保證生長(zhǎng)因子的效用能夠得到有效的發(fā)揮；有效地克服了將生長(zhǎng)因子加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系之內(nèi)，生長(zhǎng)因子因具備多向調(diào)節(jié)的功能，而致使大劑量的給藥不易掌控細(xì)胞分化的一個(gè)方向，并且也不能維持其持續(xù)性的不足。肝臟再生的啟動(dòng)與終止均需細(xì)胞因子參與，腫瘤壞死因子(TNF)，能刺激血管壁組成細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移和成熟，還可與肝素類物質(zhì)結(jié)合，而胰島素類生長(zhǎng)因子(IGF)雖不能直接促進(jìn)肝細(xì)胞分裂，但在其它生長(zhǎng)因子協(xié)同下可增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖。
[0012]所述帶負(fù)電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下:
Cl)將3.0-9.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、
0.5-1.5mmol PAAc及0.05-0.15mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在80_150ml去離子水中；
(2)調(diào)節(jié)步驟(1)所得溶液的pH為6-8，2-6°C攪拌24_72h，經(jīng)無(wú)縫纖維素管，用超純水透析，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(3)避光環(huán)境下，將步驟(2)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAc。
[0013]作為一種優(yōu)選方案，采用所述帶負(fù)電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下:
取6.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、1.0mmol PAAc以及0.1mmol 4-疊氮苯胺鹽`酸鹽溶解在IlOml去離子水中；溶液的PH用NAOH或HCL調(diào)成7.0，在4°C攪拌48h之后，反應(yīng)液通過(guò)無(wú)縫的纖維素管(cutoff MW，12000)用超純水透析，直至洗液中的疊氮苯基的含量用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物，單層的聚合物冰凍干燥；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5M J/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應(yīng)的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料 AzPhPAAc。
[0014]所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下:
(1)將80-120mg二氨基PEG和75_85mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過(guò)夜，產(chǎn)物經(jīng)氯仿/脫水乙醚洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(2)避光環(huán)境下，將步驟(1)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPEG ；
所述PEG和N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為100:80-90。
[0015]作為一種優(yōu)選的方案，采用所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下:
將IOOmg 二氨基PEG和81mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過(guò)夜反應(yīng)，獲得產(chǎn)物通過(guò)氯仿/脫水乙醚純化三次，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，照好的板分別放入稀釋的鹽酸(PH=4)中，堿性溶液(PH=IO)中,和超純水中,然后用超聲波完全除去未反應(yīng)的聚合物,洗完之后,板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料AzPhPEG。
[0016]所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下 :
(1)在溶解10-15g二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)的四氫呋喃(THF)溶液40-60 ml中，滴入溶解5-10g羥基琥珀硫亞胺的100-200 ml THF溶液及5_10g 4-疊氮苯甲酸，冰浴攪拌3-5h，反應(yīng)溶液自然回暖室溫，持續(xù)攪拌過(guò)夜，得白色液體；
(2)取步驟(1)所得白色液體過(guò)濾，剩余黃色余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結(jié)晶；
(3)在10-20ml ML，PH為6-8的聚丙烯酰胺水溶液中，冰浴攪拌，加入5-10g 4-疊氮琥珀酰亞胺的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，2-6°C攪拌24-72h，溶液超濾，洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物；
(4)避光環(huán)境下，將步驟(3)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAm。
[0017]優(yōu)選的，二環(huán)己基碳二亞胺的THF溶液中二環(huán)己基碳二亞胺和THF的質(zhì)量比為3:10。
[0018]優(yōu)選的，羥基琥珀硫亞胺的THF溶液，羥基琥珀硫亞胺和THF的質(zhì)量比為7:125，所述4-疊氮苯甲酸的添加量為8-12g。
[0019]作為一種優(yōu)選的方案，采用所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下:
在溶解有13.3gDCCI的50ml THF溶液中，滴入溶解有7.43g羥基琥珀硫亞氨的150mlTHF溶液以及9.57g 4-疊氮苯甲酸，此過(guò)程冰浴攪拌；3h后，反應(yīng)溶液慢慢的回暖室溫，持續(xù)攪拌過(guò)夜；形成的白色液體進(jìn)行過(guò)濾，留下來(lái)的黃色的余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結(jié)晶；再將IOml溶解有30mg PAAm的水溶液，pH為7.0，在冰浴攪拌時(shí)加入20ml溶解有8.4mg 4-疊氮琥珀酰亞胺的DMF溶液，在4°攪拌24h之后，溶液超濾，用5mlDMF/H20溶液洗兩次，然后用5ml的超純水，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物；避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板中(10μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，照好的板分別放入稀釋的鹽酸(PH=4)中，堿性溶液(PH=IO)中,和超純水中,然后用超聲波完全除去未反應(yīng)的聚合物,洗完之后,板用70%的乙醇水溶液消毒，得光固定電性材料AzPhPAAm。
[0020]所述共固定的TNF-a和IGF的制備步驟如下:
(1)配制DMF/PBS溶液，體積比為3-5:1，PH為6.0-8.0 ；
(2)避光環(huán)境下，把胰島素類生長(zhǎng)因子IGF和腫瘤壞死因子TNF-a分別與疊氮苯胺鹽酸鹽按1:80-100的比例，溶解于DMF/PBS溶液，2_6°C冰浴攪拌24_72h ；
(3)將步驟(2)所得溶液2-6°C超濾離心24-72h，轉(zhuǎn)速為3000-5000rpm/min，冷凍干燥，得光固定的TNF-a和IGF。
[0021]作為一種優(yōu)選方案，所述共固定TNF-a和IGF的制備步驟如下:
避光環(huán)境下，取45 μ g IGF與40 μ g TNF-a，分別加入20ml含60 μ g N-琥珀亞酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS (pH7.4，體積比為4:1)溶液中，在4°C (冰浴)的條件下加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器內(nèi)反應(yīng)48h使其充分反應(yīng)。合成結(jié)束后，分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II, IOKNa),在4000rpm/min的轉(zhuǎn)速下,超濾離心6h以純化疊氮苯基衍生物,冷凍干燥備用。使用前，用無(wú)菌的PBS把其配置成Ing/μ I的濃度,分裝至無(wú)菌EP管，用錫紙包裹并寫上標(biāo)簽。
[0022]所述共固定的電性生物材料的制備步驟如下:
(O取三種光固定有電性生物材料的聚合物培養(yǎng)板，避光環(huán)境下，分別加入l_5ng/ul光固定的TNF-a的PBS溶液10_20ul以及l(fā)_5ng/ul光固定的IGF的PBS溶液10_20ul ；
(2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入2-6°C冰箱冷凍干燥；
(3)冷凍干燥后普通的紫 外線照射10-30min；
(4)將照射完紫外線的聚合物培養(yǎng)板用PBS洗滌5-10次，每次20-40min。
[0023]共固定的電性生物材料在抗肝細(xì)胞衰老方面的應(yīng)用。
[0024]所述共固定的電性材料在抗肝細(xì)胞衰老方面的應(yīng)用，所述共固定的電性生物材料，采用光化學(xué)固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料，再通過(guò)在光固定電性材料上接枝共固定的共固定TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射制備得到。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
1、將生長(zhǎng)因子TNF-a和IGF與生物材料結(jié)合，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子逐步釋放，從而保證生長(zhǎng)因子的效用能夠得到有效的發(fā)揮，有效地克服了將生長(zhǎng)因子加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系之內(nèi)，生長(zhǎng)因子因具備多向調(diào)節(jié)的功能，而致使大劑量的給藥不易掌控細(xì)胞分化的一個(gè)方向，并且也不能維持其持續(xù)性的不足；
2、采用光化學(xué)修飾法有效避免了使用其它表面改性方法時(shí)涂層的物理和生物學(xué)性質(zhì)損失、生物材料表面活性和其它表面性能降低的缺陷；
3、采用光化學(xué)修飾法對(duì)聚合物細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行表面修飾，引入各種不同電性的功能基團(tuán)，保證了引入的基團(tuán)在長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中維持穩(wěn)定性；
4、電性生物材料上的抗細(xì)胞衰老研究能夠?yàn)槿S支架上的抗細(xì)胞衰老研究奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)推動(dòng)肝組織工程的發(fā)展具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為光固定生長(zhǎng)因子IGF和TNF-a于三種電性材料上的原子力表征圖；
圖2為PAAc電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)HSC細(xì)胞存活率的影響圖；
圖3為PEG電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)HSC細(xì)胞存活率的影響圖；
圖4為PAAm電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)HSC細(xì)胞存活率的影響圖；
圖5為三種電性材料空白組HSC細(xì)胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測(cè)圖；
圖6為三種電性材料游離組和共固定組HSC細(xì)胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測(cè)檢測(cè)圖；
圖7為三種電性材料空白組HSC細(xì)胞的流式周期檢測(cè)圖；
圖8為三種電性材料游離組和共固定組HSC細(xì)胞的流式周期檢測(cè)圖；
圖9為三種電性材料流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白組的HSC細(xì)胞中Ρ53蛋白表達(dá)量；
圖10為三種電性材料流式細(xì)胞儀檢測(cè)游離組和共固定組的HSC細(xì)胞中Ρ53蛋白表達(dá)量;
圖11為三種電性材料流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白組的HSC細(xì)胞中Rb蛋白表達(dá)量；
圖12為三種電性材料流式細(xì)胞儀檢測(cè)游離組和共固定組的HSC細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)量。
[0027]
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0029]實(shí)施例1光固定電性材料AzPhPAAc-Pst的制備
取6.0mmol 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)、1.0mmol PAAc以及0.1mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在IlOml去離子水中；溶液的PH用NAOH或HCL調(diào)成7.0，在4°C攪拌48h之后，反應(yīng)液通過(guò)無(wú)縫的纖維素管(cutoff MW，12000)用超純水透析，直至洗液中的疊氮苯基的含量用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPAAc，單層的聚合物冰凍干燥。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯(PSt)培養(yǎng)板中(ΙΟμΙ每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5M J/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應(yīng)的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPAAc-Pst。
[0030]實(shí)施例2光固定電性材料AzPhPEG-Pst的制備
將IOOmg 二氨基PEG和81m`g N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過(guò)夜反應(yīng)，獲得產(chǎn)物通過(guò)氯仿/脫水乙醚純化三次，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPEG。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板(PSt板)中(10 μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應(yīng)的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPEG-Pst。
[0031]實(shí)施例3光固定電性材料AzPhPAAm-Pst的制備
在溶解有13.3gDCCI的50ml THF溶液中，滴入溶解有13.3g羥基琥珀硫亞氨的150mlTHF溶液以及9.57g 4-疊氮苯甲酸，此過(guò)程冰浴攪拌；3h后，反應(yīng)溶液慢慢的回暖室溫，持續(xù)攪拌過(guò)夜；形成的白色液體進(jìn)行過(guò)濾，留下來(lái)的黃色的余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結(jié)晶；再將IOml溶解有30mg PAAm的水溶液，pH為7.0，在冰浴攪拌時(shí)加入20ml溶解有8.4mg 4-疊氮琥珀酰亞胺的DMF溶液，在4°攪拌24h之后，溶液超濾，用5mlDMF/H20溶液洗兩次，然后用5ml的超純水，直到洗脫液中的4-疊氮琥珀酰亞胺用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不出，得疊氮苯基修飾的衍生物AzPhPAAm。避光環(huán)境下，將所得衍生物配制成lmg/ml的水溶液，所得溶液放在24孔的聚苯乙烯培養(yǎng)板(PSt板)中(10μ I每孔)，黑暗下室溫空氣干燥，板以IO5MJ/cm2的強(qiáng)度從15cm的距離處照射紫外60秒，將培養(yǎng)板分別置于PH=4的溶液、PH=IO的溶液和超純水中，用超聲波除去未反應(yīng)的聚合物，洗完之后，板用70%的乙醇水溶液消毒，得共固定電性材料AzPhPAAm-Pst。
[0032]實(shí)施例4光固定TNF-a和IGF的制備避光環(huán)境下，取45 μ g IGF與40 μ g TNF-α，分別加入20ml含60 μ g N-琥珀亞酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS (pH7.4，體積比為4:1)溶液中，在4°C (冰浴)的條件下加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器內(nèi)反應(yīng)48h使其充分反應(yīng)。合成結(jié)束后，分別用超濾離心管(MiliporeMolecut II, IOKNa),在4000rpm/min的轉(zhuǎn)速下,超濾離心6h以純化疊氮苯基衍生物,冷凍干燥備用。使用前，用無(wú)菌的PBS把其配置成Ing/μ I的濃度,分裝至無(wú)菌EP管，用錫紙包裹并寫上標(biāo)簽。
[0033]實(shí)施例5共固定生長(zhǎng)因子的電性生物材料AzPhPAAc-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應(yīng)的表征見(jiàn)附圖1中的al。
[0034](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PAAc的PSt板(AzPhPAAc-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0035](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0036](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0037](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min。
[0038]實(shí)施例6共固定生長(zhǎng)因子的電性生物材料AzPhPEG-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應(yīng)的表征見(jiàn)附圖1中的bl。
[0039](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PEG的PSt板(AzPhPEG-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0040](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0041](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0042](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min。
[0043]實(shí)施例7共固定生長(zhǎng)因子的電性生物材料AzPhPAAm-PSt-1GF/TNF-a的制備，其相應(yīng)的表征見(jiàn)圖1中的Cl。
[0044](I)避光環(huán)境下，取光固定電性生物材料PAAm的PSt板(AzPhPAAm-PSt)，分別加入lng/ul光固定腫瘤壞死 因子(TNF-a)的PBS溶液IOul以及l(fā)ng/ul光固定的類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)的PBS溶液IOul。
[0045](2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入4°C冰箱冷凍干燥。
[0046](3)冷凍干燥后普通的紫外線照射20min。
[0047](4)將照射完紫外線的PSt板用PBS洗滌10次，每次30min，。
[0048]實(shí)施例8 PAAc電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備:用PBS㈠溶液分別溶解45 μ g IGF與40 μ g TNF- α，并調(diào)整至lng/μ I的濃度，使用一次性過(guò)濾膜分別進(jìn)行過(guò)濾滅菌，分裝至EP管，待用。
[0049]共固定TNF-a和IGF的PAAc電性材料制備依據(jù)實(shí)施例5的操作步驟。
[0050]用70 %的乙醇溶液對(duì)已共固定生長(zhǎng)因子的PAAc的24孔電性材料板(AzPhPAAc-PSt-1GF/TNF-a)進(jìn)行滅菌(浸泡30min)，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3_4遍。設(shè)置空白組合游離組，空白組為不加生長(zhǎng)因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和lng/μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細(xì)胞懸液，各作12個(gè)平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設(shè)置不同的生長(zhǎng)因子濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析其上細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
[0051]圖2是使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察光固定聚丙烯酸PAAc電性材料上不同的劑量梯度(TNF-a設(shè)定為IOng劑量，IGF的劑量梯度為10ng、30ng、50ng、70ng、90ng)的生長(zhǎng)因子的游離組和共固定組對(duì)HSC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，還設(shè)置了不加生長(zhǎng)因子的CK空白組。分析圖2可知，在PAAc電性材料上接枝共固定的生長(zhǎng)因子后，人肝星狀細(xì)胞HSC的細(xì)胞存活率最高，在此電性材料上加入游離的生長(zhǎng)因子之后，HSC的細(xì)胞存活率次之，而空白組的細(xì)胞存活率最低。在共固定組的五個(gè)劑量梯度中，TFN-a與IGF的劑量分別為IOng和70ng時(shí)，細(xì)胞的存活率最高，而TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和IOng細(xì)胞的存活率僅接其后。由數(shù)據(jù)亦可知，在PAAc電性材料上加入的游離生長(zhǎng)因子的劑量與其上HSC細(xì)胞的存活率成正比。
[0052]實(shí)施例9 PEG電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備參照實(shí)施例8的相關(guān)步驟，共固定TNF_a和IGF的制備依據(jù)實(shí)施例6的操作步驟進(jìn)行。
[0053]共固定TNF-a和IGF的PEG電性材料制備依據(jù)實(shí)施例6的操作步驟。
[0054]用70 %的乙醇溶液對(duì)已共固定生長(zhǎng)因子的PEG的24孔電性材料板(AzPhPEG-PSt-1GF/TNF-a)進(jìn)行滅菌(浸泡30min)，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3_4遍。設(shè)置空白組合游離組，空白組為不加生長(zhǎng)因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和Ing/ μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細(xì)胞懸液，各作12個(gè)平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設(shè)置不同的生長(zhǎng)因子濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析其上細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
[0055]圖3使用的是光固定聚乙烯乙二醇電性材料，由圖可知其上接枝共固定的生長(zhǎng)因子后，人肝星狀細(xì)胞HSC的細(xì)`胞存活率最高，游離組次之，空白組最低。在共固定組的五個(gè)劑量梯度中，TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和IOng時(shí)，細(xì)胞的存活率最高，且共固定組中IGF的劑量按梯度增加時(shí)，HSC細(xì)胞的存活率反而降低。加入游離生長(zhǎng)因子劑量為TNF-a10ng，IGF 30ng時(shí)，HSC細(xì)胞的存活率為游離組的最高值，游離組的其他四個(gè)濃度梯度對(duì)于HSC細(xì)胞的存活率影響不大。
[0056]實(shí)施例10 PAAm電性材料上的生長(zhǎng)因子劑量對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC的影響
游離TNF-a和IGF的制備參照實(shí)施例8的相關(guān)步驟，共固定TNF_a和IGF的制備依據(jù)實(shí)施例7的操作步驟進(jìn)行。
[0057]用70 %的乙醇溶液對(duì)已共固定生長(zhǎng)因子的PAAm的24孔電性材料板(AzPhPAAm-PSt-1GF/TNF-a)進(jìn)行滅菌(浸泡30min)，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3_4遍。設(shè)置空白組合游離組，空白組為不加生長(zhǎng)因子的光固定電性生物材料，游離組為加入lng/μ I游離IGF和Ing/ μ I游離TNF-a各IOul ;每孔都加入Iml含IXlO5 cell/ml的細(xì)胞懸液，各作12個(gè)平行孔，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此外，還設(shè)置不同的生長(zhǎng)因子濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析其上細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
[0058]圖4所用的材料是光固定聚丙烯胺PAAm由圖可知其上接枝共固定的生長(zhǎng)因子后，HSC的細(xì)胞存活率最高，游離組次之，空白組最低。且固定組與游離組、空白組存在顯著性差異。在共固定組中，當(dāng)TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和50ng時(shí)，人肝星狀細(xì)胞HSC的存活率最高。但是TNF-a與IGF均為IOng劑量時(shí)，細(xì)胞存活率與最高值亦十分接近。在共游離組中，當(dāng)TNF-a與IGF的劑量分別為IOng和50ng，HSC的細(xì)胞存活率最高。[0059]實(shí)施例11三種電性生物材料上HSC細(xì)胞的衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測(cè)
β半乳糖苷酶活性檢測(cè)指標(biāo)是檢測(cè)衰老的黃金指標(biāo)，因?yàn)樗ダ霞?xì)胞的典型生化特征為pH依賴的β半乳糖苷酶(β -galactosidase)表達(dá)活性增強(qiáng),顯示陽(yáng)性結(jié)果，顏色為藍(lán)綠色。這種由衰老引起的半乳糖苷酶活性增強(qiáng)的現(xiàn)象被稱為SA- β ~gal (senescence-associated β - galactosidase)。通常，SA-β-gal 在 pH 值為 4時(shí)表達(dá)較高，但在衰老細(xì)胞中，在pH值為6時(shí)，SA-13_gal表達(dá)明顯增強(qiáng)。鑒于不同因素引起的衰老細(xì)胞都呈現(xiàn)SA-β -gal陽(yáng)性特征，現(xiàn)在已經(jīng)把SA-β -gal作為細(xì)胞衰老的一個(gè)重要生物標(biāo)記，成為鑒別衰老細(xì)胞的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
[0060]使用衰老試劑盒β -半乳糖苷酶檢測(cè)人肝星狀細(xì)胞HSC在三種不同電性的生物材料(分別為帶正電荷的聚丙烯酸PAAc、中性電荷的聚乙烯乙二醇PEG以及帶負(fù)電荷的聚丙烯胺PAAm)上空白組的衰老情況，如圖5所示。圖5中所示的空白組HSC細(xì)胞，既不加入腫瘤壞死因子a，亦不加入胰島素類生長(zhǎng)因子。第一排顯示的為聚丙烯酸PAAc電性材料的衰老結(jié)果，第二排顯示的為聚乙烯乙二醇PEG電性材料的衰老結(jié)果，第三排顯示的為聚丙烯胺PAAm電性材料的衰老結(jié)果。
[0061]圖5是加入游離狀態(tài)生長(zhǎng)因子的HSC細(xì)胞衰老情況(如左列所示)以及共固定生長(zhǎng)因子上HSC細(xì)胞的衰老情況(如右列所示)，劑量分別為20ng/well的游離組TNF_a/IGF與20ng/well的共固定TNF_a/IGF，三種電性材料的排列順序同圖5。
[0062]由圖5和圖6的顯微鏡所拍攝的細(xì)胞圖片可知，空白組的三種電性材料都出現(xiàn)了不同程度的衰老情況:其中，接種在帶正電荷的PAAm (聚丙烯胺)電性材料上的細(xì)胞衰老情況最嚴(yán)重；而游離組的半乳糖苷酶染色也出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，但細(xì)胞衰老情況得到部分緩解；固定組的細(xì)胞衰老情況得到最大程度的緩解，幾乎沒(méi)有染成藍(lán)綠色的陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。固定組的帶負(fù)電荷PAAc (聚丙烯酸)電性材料上接種的細(xì)胞幾乎沒(méi)有出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，試劑盒染色沒(méi)有顯示陽(yáng)性結(jié)果；而固定組的PAAm電性材料上的細(xì)胞生長(zhǎng)也較好，相對(duì)于空白組而言，此種電性材料的抑制衰老作用是三種材料中最顯著的。
[0063]實(shí)施例12三種電性生物材料上HSC細(xì)胞的流式周期檢測(cè)
衰老的細(xì)胞的周期阻滯在Gl期，不能進(jìn)入S期，即生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，其周期中S期含量應(yīng)該較高。因而可以通過(guò)檢測(cè)HSC細(xì)胞的流式周期來(lái)評(píng)估本發(fā)明的電性生物材料對(duì)HSC細(xì)胞的抑制衰老的作用。本實(shí)施例中，對(duì)三種電性材料分別依次設(shè)立三個(gè)組別，即空白組、游離組及固定組。空白組是指不加入TNF-a，亦不加入IGF ;游離組是指加入的是游離的生長(zhǎng)因子，其制備按照實(shí)施例9的相關(guān)操作進(jìn)行；共固定組分別按照實(shí)施例5-7的步驟來(lái)制備。
[0064]圖7為流式檢測(cè)接種在不同電性生物材料空白組上HSC細(xì)胞的細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)，圖8為流式檢測(cè)接種在不同電性生物材料游離組和共固定組上HSC細(xì)胞的細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)。結(jié)合圖7和圖8可以看出，三種電性材料的空白組S期含量都很低，其中PEG電性材料僅5.2% ;而三種電性材料的游離組S期含量比空白組高，其中PAAm達(dá)到23.3% ;三種電性材料的固定組S期含量是三組之中最高的，最高值高達(dá)27.3% ;且單獨(dú)分析任何一種電性材料，其空白組、游離組、固定組的S期含量都是依次增加的。因而可以證明，三種電性材料的固定組相對(duì)空白、游離組有著最強(qiáng)的抑制衰老作用。
[0065]實(shí)施例13三種電性生物材料上HSC細(xì)胞內(nèi)P53及Rb蛋白表達(dá)量P53蛋白和Rb蛋白是衰老正相關(guān)蛋白，在人類衰老機(jī)制研究中，人們認(rèn)識(shí)到在人體細(xì)胞遭受損害后，人體會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)急蛋白一P53蛋白，從而抑制癌細(xì)胞產(chǎn)生，防止癌癥，但是與此同時(shí)，卻會(huì)促使衰老細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體衰老。P53蛋白能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期停留于G1/S的節(jié)律點(diǎn)上，以達(dá)成DNA損壞辨識(shí)；若能將細(xì)胞于此節(jié)律點(diǎn)上停留夠久，DNA修護(hù)蛋白將有更充裕的時(shí)間修復(fù)DNA損壞部位，并繼續(xù)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。Rb基因即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因，這種基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可控制驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入分裂過(guò)程的重要基因表達(dá)。
[0066] 圖9是使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種不同電性的生物材料空白組接種的人肝星狀細(xì)胞HSC的P53蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)，圖10是使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種不同電性的生物材料游離組和共固定組接種的人肝星狀細(xì)胞HSC的P53蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)；圖11為使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種不同電性的生物材料空白組接種的人肝星狀細(xì)胞HSC的Rb蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)，圖12為使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種不同電性的生物材料游離組和共固定組接種的人肝星狀細(xì)胞HSC的Rb蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)；空白組、游離組及共固定組根據(jù)生長(zhǎng)因子的加入方式及數(shù)量進(jìn)行具體分組，詳見(jiàn)實(shí)施例13。由圖9-12可以知道，不論是哪種電性材料，無(wú)論是帶何種電荷，其空白組的P53蛋白表達(dá)量以及Rb蛋白表達(dá)量都是很高的，也即三種電性材料的空白組細(xì)胞的衰老情況十分嚴(yán)重；而游離組P53蛋白以及Rb蛋白表達(dá)量相對(duì)空白組有所下降，衰老現(xiàn)象得到一定程度的緩解；三種電性材料的固定組的蛋白表達(dá)量(用熒光值顯示)是三組之中最低的，其中PAAm電性材料的P53蛋白表達(dá)量由空白組的平均熒光值3108降低至固定組的平均熒光值125 6，該電性材料的Rb蛋白表達(dá)量由空白組的平均熒光值141降低至固定組的平均熒光值74 ;同時(shí)由于P53蛋白和Rb蛋白都是衰老正相關(guān)蛋白，可知固定組的細(xì)胞衰老情況得到了最大程度的緩解。
【權(quán)利要求】
1.抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，通過(guò)如下步驟制備得到:采用光化學(xué)固定法在聚合物培養(yǎng)板上接枝帶電荷的電性材料，得光固定電性材料；再通過(guò)在光固定電性材料上共接枝TNF-a和IGF，經(jīng)紫外照射，得共固定的電性生物材料； 所述帶電荷的電性材料為帶負(fù)電荷的聚丙烯酸，電中性的聚乙烯乙二醇或帶正電的聚丙烯胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述聚合物培養(yǎng)板為聚苯乙烯培養(yǎng)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的聚丙烯酸制備光固定電性材料的步驟如下: (1)將3.0-9.0mmol 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、0.5-1.5mmol聚丙烯酸及0.05-0.15mmol 4-疊氮苯胺鹽酸鹽溶解在80_150ml去離子水中； (2)調(diào)節(jié)步驟(1)所得溶液的pH為6.0-8.0，2-6°C攪拌24_72h，經(jīng)超純水透析，得疊氮苯基修飾的衍生物； (3 )避光環(huán)境下，將步驟(2 )所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得所述光固定電性材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述電中性的聚乙烯乙二醇制備光固定電性材料步驟如下: (1)將80-120mg二氨基PEG和75_85mg N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺在氯仿中攪拌過(guò)夜，產(chǎn)物經(jīng)氯仿/脫水乙醚洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物； (2)避光環(huán)境下，將步驟(1)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得所述光固定電性材料； 所述PEG和N-(4-疊氮)琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為100: 80-90。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，采用所述帶正電的聚丙烯胺制備光固定電性材料的步驟如下: (1)在溶解10-15g二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液40-60 ml中，滴入溶解5_10g輕基琥珀硫亞胺的100-200 ml四氫呋喃溶液及5-10g 4-疊氮苯甲酸，冰浴攪拌3_5h，反應(yīng)溶液自然回暖室溫，持續(xù)攪拌過(guò)夜，得白色液體； (2)取步驟(1)所得白色液體過(guò)濾，剩余黃色余渣用異丙基乙醇/異丙基醚中結(jié)晶； (3)在10-20ml, PH為6_8的聚丙烯酰胺水溶液中，冰浴攪拌，加入5-10g 4-疊氮琥珀酰亞胺的二甲基甲酰胺溶液，2-6°C攪拌24-72h，溶液超濾，洗滌，得疊氮苯基修飾的衍生物； (4)避光環(huán)境下，將步驟(3)所得衍生物溶解在水中，所得溶液放在聚合物培養(yǎng)板中，干燥，以IO4-1O6M J/cm2的強(qiáng)度對(duì)距離板10-20cm處紫外照射50-100秒，將培養(yǎng)板進(jìn)行清洗處理后，得光固定電性材料AzPhPAAm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述光固定的TNF-a和IGF的制備步驟如下: (I)配制DMF/PBS溶液，體積比為3-5:1，PH為6.0-8.0 ；(2)避光環(huán)境下，把胰島素類生長(zhǎng)因子IGF和腫瘤壞死因子TNF-a分別與疊氮苯胺鹽酸鹽按1:80-100的比例，溶解于DMF/PBS溶液，2_6°C冰浴攪拌24_72h ； (3)將步驟(2)所得溶液2-6°C超濾離心24-72h，轉(zhuǎn)速為3000-5000rpm/min，冷凍干燥，得光固定的TNF-a和IGF。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述共固定的電性生物材料的制備步驟如下: (O取三種光固定有電性生物材料的聚合物培養(yǎng)板，避光環(huán)境下，分別加入l_5ng/ul光固定的TNF-a的PBS溶液10_20ul以及l(fā)_5ng/ul光固定的IGF的PBS溶液10_20ul ； (2)涂抹均勻，用錫紙包裹，放入2-6°C冰箱冷凍干燥； (3)冷凍干燥后普通的紫外線照射10-30min； (4)將照射完紫外線的聚合物培養(yǎng)板用PBS洗滌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述步驟(I)中溶解二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液，二環(huán)己基碳二亞胺和四氫呋喃的質(zhì)量比為 3:10。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗肝細(xì)胞衰老的共固定電性生物材料，其特征在于，所述步驟(I)中溶解有羥基琥珀硫亞胺的四氫呋喃溶液，羥基琥珀硫亞胺和四氫呋喃的質(zhì)量比為7:125，所述4-疊氮苯甲酸的添加量為8-12g。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述共固定電性生物材料在抗肝細(xì)胞衰老制劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK103524772SQ201310483848
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】關(guān)燕清, 劉俊明, 張琳, 吳麗芳 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)