一種護肝片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種護肝片的制備方法，由柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得含量有很大提高，服用量減少，本發(fā)明還提供了護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】—種護肝片的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種護肝片的制備方法及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]護肝片記載于藥典，處方為柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g，以上六味，綠豆粉碎成細(xì)粉；柴胡、茵陳、板藍(lán)根加水煎煮二次，每次2小時，濾過，合并濾液，靜置48小時，取上清液，減壓濃縮成相對密度為1.30 (80°C)的清膏，與綠豆粉IOlg混合，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉；五味子粉碎成粗粉，用75%乙醇回流提取三次，第一次3小時，第二次2小時，第三次I小時，合并提取液，靜置24小時，取上清液，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.28 (80°C)，與綠豆粉27g混勻，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉；取豬膽粉，與上述細(xì)粉混勻，制顆粒，干燥，壓制成1000片，包糖衣，即得。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有護肝片在提取制備方面采用超臨界技術(shù)的報道，而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種護肝片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]—種護肝片的制備方法，由柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成:取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0008]上述一種護肝片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述一種護肝片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min。
[0010]上述一種護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，護肝片由柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成:取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間150-180min,得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0011]上述護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，護肝片制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0012]上述護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，護肝片制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時間160min。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)中，護肝片每片0.5g，每次5片，一日3次，采用本發(fā)明制備成的護肝片每片0.5g，但含有的藥材量是原來的2倍，因此每次僅需3片，一日服用3次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。
【具體實施方式】
[0014]以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0015]實施例1[0016]取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥.π?η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0017]實施例2
[0018]取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0019]實施例3
[0020]取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥.π?η，萃取時間160min，得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0021]實施例4:護肝片抑制YAC-1細(xì)胞增殖的實驗研究資料
[0022]I實驗材料
[0023]1.1實驗用細(xì)胞株
[0024]小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞，南京正亮醫(yī)藥科技有限公司實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0025]1.2實驗藥物
[0026]研究藥物:本發(fā)明護肝片:按實施例3方法制備。
[0027]藥液儲液:稱取IOOmg護肝片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾,500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0028]1.3實驗試劑[0029]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號:2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號:2010242);Str 印 tomycin Su I fat e( AMRE SCO公司批號:2010382);無水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號:080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ; PBS (實驗室自配)；1.4實驗器材
[0030]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號:SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號:SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0031]2實驗方法
[0032]I) YAC-1 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個/ml。
[0033]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
[0034]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入護肝片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0035]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0036]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0037]6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0038]7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:
[0039]細(xì)胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0040]3統(tǒng)計處理
[0041]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0042]4實驗結(jié)果
[0043]MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對YAC-1細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。
[0044]表1護肝片對YAC-1細(xì)胞增殖抑制影響研究P^iSD)
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種護肝片的制備方法，由柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，加入淀粉，70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種護肝片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種護肝片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于護肝片由柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成:取柴胡250g、茵陳250g、板藍(lán)根250g、五味子300g、豬膽粉20g、綠豆128g加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l-3ml/g生藥.min,萃取時間150_180min,得超臨界萃取物,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片，制成500片，每片重0.5g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于護肝片制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種護肝片在制備抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于護肝片制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min。
【文檔編號】A61P35/00GK103494933SQ201310463685
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:南京正亮醫(yī)藥科技有限公司