一種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物及其制備方法。本發(fā)明采用生物技術(shù)手段降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性，通過采用生物技術(shù)手段干預(yù)細胞自噬調(diào)控納米材料的體內(nèi)外毒性，減少納米材料的不良副作用，從而提高納米材料應(yīng)用的安全性。本發(fā)明具體提供了自噬干預(yù)手段包括但不限于自噬干預(yù)藥物（化合物/多肽）、自噬相關(guān)基因、自噬相關(guān)信號通路蛋白阻斷劑與納米材料組合而成的復(fù)合物。
【專利說明】一種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及調(diào)控納米遞藥材料體內(nèi)外毒性的方法，具體涉及一種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性的藥物復(fù)合物及其制備方法和用途，更具體地講，是提供一種利用生物技術(shù)手段干預(yù)細胞自噬進行調(diào)控納米遞藥材料的體內(nèi)外毒性。

【背景技術(shù)】
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[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了有關(guān)納米材料主要包括納米顆粒、納米線、納米薄膜、納米管和納米固體材料等，由于這類材料尺寸處于原子簇和宏觀物體交界的交匯區(qū)域，納米醫(yī)藥材料具有普通宏觀材料所不具備的物理化學(xué)特性，因而廣泛應(yīng)用于藥物遞送、疾病診斷、組織工程、治療藥物開發(fā)等領(lǐng)域(McCarthy JR, WeisslederR.Multifunct1nal magnetic nanoparticles for targeted imaging and therapy.Adv Drug Deliv Rev2008;60:1241-1251.Petros RA，DeSimone JM.Strategies inthe design of nanoparticles for therapeutic applicat1ns.Nat Rev DrugDisCOV2010;9:615-627.)。作為理想的藥物遞送材料，納米醫(yī)藥材料被廣泛用于病毒感染、腫瘤治療等研究中(Mukerjee A, Ranjan APj Vishwanatha JK.Combinatorialnanoparticles for cancer diagnosis and therapy.Curr Med Chem2012;19:3714-3721.Wang Bj Navath RS，Menjoge AR,Balakrishnan B，Bellair R，Dai H，RomeroRjet al.1nhibit1n of bacterial growth and intramn1tic infect1n ina guinea pig model of chor1amn1nitis using PAMAM dendrimers.1nt JPharm2010;395:298-308.)。
[0003]實踐顯示，盡管納米醫(yī)藥材料在藥物遞送領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，但其仍存在一定的安全性問題。因此納米遞藥材料在分子、細胞、器官及生物個體水平引發(fā)的特殊生物學(xué)效應(yīng)被廣泛研究，如研究發(fā)現(xiàn)碳納米管在生物體內(nèi)可產(chǎn)生R0S，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、線粒體損傷及細胞形態(tài)改變(Lanone S，Andujar P, KermanizadehA, Boczkowski J.Determinants of carbon nanotube toxicity.Adv Drug DelivRev.2013 ;do1:10.1016/j.addr.2013.07.019.);聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)對肺表皮細胞具有細胞毒性，可引起線粒體功能損傷，誘發(fā)強烈的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細胞因子的釋放(Grabowski N，Hillaireau H, Vergnaud J，Santiago LA, Kerdine-Romer S，PallardyM，Tsapis N，F(xiàn)attal E Toxicity of surface-modified PLGA nanoparticles towardlung alveolar epithelial cells.1nt J Pharm.2013;454(2):686-94.);聚乙烯亞胺(PEI)陽離子納米顆粒對人正常支氣管表皮細胞具有細胞毒性(Zhang H，Xia T, MengH，Xue M，George S，Ji Zj Wang X，Liu Rj Wang M，F(xiàn)rance B，Rallo Rj Damoiseaux R，CohenYj Bradley KA，Zink JIj Nel AE Differential express1n of syndecan-lmediatescat1nic nanoparticle toxicity in undifferentiated versus differentiated normalhuman bronchial epithelial cells.ACS Nan0.201126; 5:2756-69.);樹枝狀大分子聚合物可引起急性肺損傷，導(dǎo)致血液斑塊形成，影響血小板的功能(Li C，Liu H, Sun Y, WangH，Guo F，Rao S，Deng Jj et al.PAMAM nanoparticles promote acute lung injury byinducing autophagic cell death through the Akt-TSC2_mT0R signaling pathway.J Mol Cell B1l2009;1:37-45.Jones CF，Campbell RA, Brooks AE，Assemi S，TadjikiSj Thiagarajan G，Mulcock C，et al.Cat1nic PAMAM dendrimers aggressively initiateblood clot format1n.ACS Nano2012;6:9900-9910.Jones CF，Campbell RA, FranksZj Gibson CCj Thiagarajan G，Vieira-de-Abreu A，Sukavaneshvar S，et al.Cat1nicPAMAM dendrimers disrupt key platelet funct1ns.Mol Pharm2012;9:1599-1611.)。為了保證納米醫(yī)藥材料在準確投遞藥物的同時減少其對正常器官組織的不良作用，目前多采用化學(xué)修飾手段將納米遞藥材料與具有靶向性的多肽、化合物等結(jié)合，使納米遞藥材料具有專一靶向性。研究人員發(fā)現(xiàn)膽堿衍生物修飾的多枝狀左旋聚賴氨酸納米材料可實現(xiàn)腦革巴向基因藥物遞送(Li J, Zhou L, Ye D, Huang S，Shao K, Huang R, Han L, etal.Choline-derivate-modified nanoparticles for brain-targetinggene delivery.Adv Mater2011 ;23:4516-4520.);基質(zhì)金屬蛋白酶2可剪切肽、酸激活受體特異性肽配體修飾后的納米遞藥材料均可有效實現(xiàn)腫瘤祀向(Huang S，Shao K, Liu Y, Kuang Y, LiJj An S，Guo Y，et al.Tumor-targeting and microenvironment-responsive smartnanoparticles for combinat1n therapy of antiang1genesis and apoptosis.ACSNano2013; 7:2860-2871.Han L，Guo Y，Ma H，He X，Kuang Y，Zhang N，Lim E，et al.AcidActive Receptor-Specific Peptide Ligand for In Vivo Tumor-Targeted Delivery.Small2013.do1: 10.1002/smll.201300279.);此外，豆蔻酸修飾后的聚乙烯亞胺/DNA納米材料可用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向基因治療，RGDyK修飾的脂質(zhì)體也可用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向分子治療(Li Jj Gu B，Meng Qj Yan Zj Gao H，Chen X，Yang X，et al.The use of myristicacid as a ligand of polyethylenimine/DNA nanoparticles for targeted genetherapy of gl1blastoma.Nanotechnology2011;22:435101.Li C，Shen Jj Wei Xj XieC，Lu W.Targeted delivery of a novel palmitylated D—peptide for antigl1blastomamolecular therapy.J Drug Target2012; 20:264-271.) □然而，納米遞藥材料引發(fā)特殊生物學(xué)效應(yīng)的機制目前仍不清楚，作用機制的不明確給納米遞藥材料的大規(guī)模走向市場安全應(yīng)用帶來了巨大的挑戰(zhàn)。
[0004]近年來大量研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與納米遞藥材料的不良反應(yīng)密切相關(guān)。已有的前瞻性初步研究發(fā)現(xiàn)多種納米遞藥材料都能誘導(dǎo)細胞自噬，但目前僅局限于現(xiàn)象的研究，對于深入的分子機理研究了解較少(Man N，Yu Lj Yu SHj Wen LP.Rare earth oxidenanocrystals as a new class of autophagy inducers.Autophagy.2010;6:310-1.Hussain Sj Garantz1tis S.1nterplay between apoptotic and autophagy pathwaysafter exposure to cerium d1xide nanoparticles in human monocytes.Autophagy.2013do1:10.4161/aut0.22266.)。
[0005]細胞自噬(autophagy)是原核和真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程，負責(zé)講解細胞內(nèi)長壽蛋白及損傷的細胞器等，是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段(Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease.Cell2008; 132:27-42.) 0細胞自噬的主要特征是雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，其發(fā)生與mTORCl的抑制，自噬相關(guān)蛋白(Atgs)的表達及相關(guān)信號通路的激活密切相關(guān)(Corradetti MN, GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamycin:do all roads pass throughmT0R?0ncogene2006;25:6347-6360.He C, Kl1nsky DJ.Regulat1n mechanisms andsignaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet 2009;43:67-93.)? 細胞自曬(autophagy)又叫II型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物體內(nèi)常見的“自我消化”(cellular degradat1n)的現(xiàn)象，能分解細胞內(nèi)受損或多余的細胞器和蛋白產(chǎn)生核苷酸，氨基酸等小分子物質(zhì)供細胞合成新的蛋白質(zhì)，并能維持細胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。近年來隨著分子生物學(xué)及基因技術(shù)的發(fā)展和對細胞自噬的深入認識，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。根據(jù)細胞內(nèi)底物運送到溶酶體腔內(nèi)方式的不同，哺乳動物細胞自卩遼可分為三種方式:大自曬(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)。主要概述的大自卩遼(以下簡稱自曬)與腫瘤發(fā)展及治療關(guān)系最為密切(Sridhar S, Botbol Y, Macian F，et al.Autophagyand disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.)。自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過程。該過程大致能分為4個階段:1.在饑餓、缺氧、藥物干擾等某些因素的刺激下，自噬泡的雙層膜結(jié)構(gòu)開始逐漸形成并包圍在被降解物的周圍。2.自噬泡完全成型并將要被降解的物質(zhì)完全隔離于細胞質(zhì)。3.自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。4.自噬溶酶體最終被溶酶體中的水解酶溶解，降解產(chǎn)物可以在細胞內(nèi)再循環(huán)利用。(Martinez-Borra J, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.)。自卩遼能對細胞對外部環(huán)境改變及各種刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。細胞在生長條件下能發(fā)生較低水平的自噬，稱基礎(chǔ)自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饑餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調(diào)。如在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內(nèi)壞死細胞器產(chǎn)生氨基酸等供細胞合成新的蛋白質(zhì)，維持細胞的存活(①Piacentini M, D’ElettoM，F(xiàn)alasca Lj et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death andsurvival.Adv Enzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KLj ShajahanAN，Clarke R.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert RevAnticancer Ther.2011; 11 (8): 1283-94.；(3) Wirawan Ej Vanden Berghe T，Lippens S，etal.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22(I):43-61.)0
[0006]研究還顯示，自噬能降解折疊錯誤的蛋白質(zhì)、損傷的細胞器等，延緩機體衰老的發(fā)生。集體衰老相關(guān)疾病一神經(jīng)退行性疾病可以被歸類為蛋白構(gòu)象錯誤疾病，一般是由于大量折疊錯誤的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)堆積從而引發(fā)細胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤都與細胞自噬密切相關(guān)(① Martinez-Borra Jj Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedB1l.2012;738:169-84.;② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③ Mendelsohn AR, Larrick JW.Rapamycinas an antiaging therapeutic?:targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1nRes.2011:14(4):437-41.)。
[0007]細胞自噬在生物體的發(fā)育和分化過程中起了重要作用。據(jù)報道，自噬基因缺失或者突變的線蟲生長發(fā)育缺陷、衰老加速并縮短壽命；并且自噬也參與果蠅變態(tài)的發(fā)生。此外自曬在哺乳動物成年個體組織器官發(fā)育和分化中也起了重要作用(Mizushima N, KomatsuΜ.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.)。
[0008]此外作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導(dǎo)致細胞死亡。(Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts and apparentartefacts.Cell Death Differ.2012;19(I):87-95.)。
[0009]細胞在一些特定的條件下，由于一系列因素的影響導(dǎo)致了各類基因突變從而導(dǎo)致的細胞各類遺傳性狀及功能改變。這類改變可能將具有正常功能和特性的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至蜒杆?、抗凋亡等惡性特征的細胞即癌細胞。研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和自噬的關(guān)系極為密切。
[0010]一般來說，由于細胞自噬有利于細胞的存活，因此無論在正常細胞或是腫瘤細胞中，自噬都普遍被保留下來，并且在一般情況下都維持著基礎(chǔ)自噬。但是自噬究竟是抑制還是促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展目前尚沒有定論。自噬初期可以作為腫瘤發(fā)生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導(dǎo)致原癌細胞持續(xù)增殖。大多數(shù)腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自曬缺乏可引起自曬底物p62積聚，通過NF-κ B信號途徑引起腫瘤形成(TrocoliA,Djavaher1-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF- κ Bsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.)。然而在腫瘤生長到一定程度時，尤其是當(dāng)腫瘤內(nèi)還沒有形成足夠的血管為其擴增提供營養(yǎng)時，腫瘤細胞也可以通過自噬來克服營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h，HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這也說明了在營養(yǎng)缺乏等條件下自卩遼也是腫瘤細胞的一種自我保護的機制(Baldwin AS.Regulat1n of celldeath and autophagy by IKK and NF-κ B:critical mechanisms in immune funct1nand cancer.Tmmunol Rev.2012;246(I):327-45.) ?
[0011]越來越多的證據(jù)表明，細胞自噬影響很多關(guān)鍵的細胞過程，如程序性細胞死亡、細胞增殖、炎癥反應(yīng)和固有免疫功能等，因此，細胞自噬可能在納米遞藥材料的安全應(yīng)用中起決定性作用。研究發(fā)現(xiàn)富勒烯能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS并誘導(dǎo)細胞自噬，可促進化療藥物阿霉素和順鉬殺傷腫瘤細胞的能力(Zhang Q, Yang W，Man N, Zheng F，Shen Y, Sun Κ, LiY, et al.Autophagy-mediated chemosensitizat1n in cancer cells by fullereneC60nanocrystal.Autophagy2009; 5:1107-1117.);此外,基因運輸載體陽離子脂質(zhì)體，納米膠束等納米遞藥材料均能誘導(dǎo)細胞自曬，其具體機制仍有待進一步研究(Man N, ChenY,Zheng F，Zhou W，Wen LP.1nduct1n of genuine autophagy by cat1nic lipids inmammalian cells.Autophagy2010;6:449-454.Halamoda Kenzaoui B, Chapuis BernasconiC, Guney-Ayra S, Juillerat-Jeanneret L.1nduct1n of oxidative stress, lysosomeactivat1n and autophagy by nanoparticles in human brain-derived endothelialcells.B1chem J2012;441:813-821.)。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0012]本發(fā)明的目的是一種調(diào)控納米遞藥材料體內(nèi)外毒性的方法，具體涉及通過制備細胞自噬干預(yù)藥物與納米遞藥材料的復(fù)合物，實現(xiàn)通過干預(yù)細胞自噬降低納米材料體內(nèi)外毒性，減少納米材料的副作用和不良反應(yīng)，提高納米材料應(yīng)用的安全性。尤其涉及一種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物及其制備方法。
[0013]本發(fā)明提供了通過自噬干預(yù)手段與納米材料聯(lián)合作用，制得降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，所述自噬干預(yù)手段包括但不限于自噬干預(yù)藥物(化合物/多肽)、自噬相關(guān)基因、自噬相關(guān)信號通路蛋白阻斷劑與納米材料組合而成的復(fù)合物。
[0014]更具體的，本發(fā)明的種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物組合物由納米材料與細胞自噬干預(yù)藥物組成。
[0015]本發(fā)明中，所述納米遞藥材料包括但不局限于樹枝狀大分子(PAMAMDendrimers)，聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA)，碳納米管，聚乙烯亞胺(PEI )，量子點。
[0016]本發(fā)明中，所述細胞自噬干預(yù)藥物包括但不限于3-甲基腺嘌呤、氯喹、羥基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮、巴伐洛霉素Al等細胞自噬抑制劑、雷帕霉素、海藻糖等細胞自噬激活劑，自噬相關(guān)基因的siRNA，shRNA。
[0017]本發(fā)明中，所述復(fù)合物的形成方法包括但不限于藥物與納米材料之間離子相互作用、化學(xué)鍵形成反應(yīng)、物理結(jié)合和生物反應(yīng)。
[0018]本發(fā)明中，所述復(fù)合物以選自以下一組中的形式進行配方:具體包括但不限于固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體、納米微球等。
[0019]本發(fā)明中，所述復(fù)合物中的組成成分序貫使用能減輕納米材料的體內(nèi)和體外毒性,增強納米材料的安全性。
[0020]在本發(fā)明的實施例中，公開了一種細胞自噬干預(yù)藥物如氯喹與納米遞藥材料如樹枝狀大分子形成復(fù)合物或序貫使用的方法。正常的BALB/C雌鼠通過腹腔注射樹枝狀大分子(PAMAM dendrimers)可引起納米材料中毒反應(yīng),具體表現(xiàn)為體重急劇減輕,肝功能損傷，細胞自噬水平提高。采用細胞自噬抑制劑干預(yù)樹枝狀大分子誘導(dǎo)的細胞自噬，可明顯減輕樹枝狀大分子對正常BALB/C雌鼠的毒性及肝損傷。
[0021]本發(fā)明還提供了細胞自噬干預(yù)藥物與納米遞藥材料復(fù)合物的用途，具體為:包括但不限于藥物遞送、醫(yī)學(xué)影像、疾病診斷、腫瘤治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞生長抑制。
[0023]圖2、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞發(fā)生細胞凋亡。
[0024]圖3、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞線粒體膜電位降低。
[0025]圖4、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞細胞自噬體形成。
[0026]圖5、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞自噬相關(guān)熒光產(chǎn)生。
[0027]圖6、PAMAM樹枝狀大分子引起人正常肝細胞LC3-1I表達量增加。
[0028]圖7、3-甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0029]圖8、3-甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達減少。
[0030]圖9、氯喹抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0031]圖10、氯喹抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達增加。
[0032]圖11、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0033]圖12、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達增加。
[0034]圖13、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物體重降低。
[0035]圖14、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物肝重降低。
[0036]圖15、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物肝損傷。
[0037]圖16、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝臟關(guān)鍵酶指標(biāo)異常。
[0038]圖17、抑制細胞自噬可明顯削弱量子點引起的腎細胞生長抑制。
[0039]圖18、抑制細胞自噬可明顯削弱PAMAM引起的神經(jīng)細胞的生長抑制。

【具體實施方式】
[0040]以下結(jié)合附圖并通過具體實施例進一步說明但不限定本發(fā)明。
[0041]實施例1、樹枝狀大分子對人肝細胞具有細胞毒性
[0042]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用不同濃度的PAMAMdendriemrs (12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，以未處理的細胞為陰性對照采用MTT法測定相對細胞活力，實驗結(jié)果如圖1所示；采用Annexin V/PI對細胞進行染色,采用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測，實驗結(jié)果如圖2所示；采用JC-1對下次報進行染色，采用流式細胞儀對線粒體膜電位的崩塌情況進行檢測，實驗結(jié)果如圖3所示。
[0043]實施例2、樹枝狀大分子誘導(dǎo)人肝細胞發(fā)生細胞自噬
[0044]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理24h后，進行石蠟包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察細胞亞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，給藥組細胞內(nèi)有大量的典型的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，而對照組則未發(fā)現(xiàn)。
[0045]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理24h后，采用Cyto-1D細胞自噬檢測熒光染料進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖5所示，給藥組細胞和雷帕霉素作用組細胞可觀察到明顯的綠色熒光，而對照組綠色熒光強度很弱。
[0046]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2細胞用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理不同時間后，將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2細胞經(jīng)過樹枝狀大分子處理不同時間或不同濃度處理后，通過Western Blot的檢測，實驗結(jié)果如圖6所示,與對照組相t匕，給予樹枝狀大分子細胞的LC3 II的表達水平增強。
[0047]實施例3、3_甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0048]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入3-甲基腺嘌呤處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結(jié)果如圖7所示，3-甲基腺嘌呤預(yù)處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結(jié)果如圖8所示。實施例4、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0049]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入3-甲基腺嘌呤處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結(jié)果如圖9所示，3-甲基腺嘌呤預(yù)處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結(jié)果如圖10所示。
[0050]實施例5、抑制活性氧可削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0051]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入NAC處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結(jié)果如圖11所示，NAC預(yù)處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結(jié)果如圖12所示。
[0052]實施例6、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝損傷
[0053]BALB/C雌鼠分為4組，分別為對照組，PAMAM處理組(100mg/kg )，氯喹處理組(50mg/kg),聯(lián)合用藥組(PAMAM100mg/kg+CQ50mg/kg)。每天記錄體重變化，實驗結(jié)果如圖13所示；實驗10天后，處死小鼠，記錄肝重變化，實驗結(jié)果如圖14所示；將各組肝組織進行切片并HE染色觀察，實驗結(jié)果如圖15所示。
[0054]實施例7、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝臟關(guān)鍵酶指標(biāo)異常
[0055]將各實驗組動物肝臟研磨，采用酶標(biāo)儀測定各組實驗動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、甘油三酯、總膽固醇含量的變化，實驗結(jié)果如圖16所示。
[0056]實施例8、抑制細胞自噬削弱量子點引起的腎細胞生長抑制
[0057]人正常腎細胞用40nM的量子點處理不同時間，給藥前3h加入3_甲基腺嘌呤、氯喹或氯化銨處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結(jié)果如圖17所示，抑制細胞自噬可顯著削弱量子點引起的腎細胞生長抑制。
[0058]實施例9、抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的神經(jīng)細胞生長抑制
[0059]人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U118米用100 μ g/ml PAMAM dendrimers G5處理24h,給藥前3小時加入4μ M氯喹處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結(jié)果如圖18所示，抑制細胞自噬能顯著削弱PAMAM引起的神經(jīng)細胞的生長抑制。
[0060]以上實施例僅起說明的作用。不能也不應(yīng)將它們視為對本發(fā)明范圍或精神的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對于本發(fā)明的目的而言，可使用其他變化或替代形式。而本發(fā)明的目的僅由本說明書和所附權(quán)利要求書定義。
【權(quán)利要求】
1.一種降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，該藥物復(fù)合物由納米遞藥材料與細胞自噬干預(yù)藥物組成藥物復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述納米遞藥材料選自樹枝狀大分子(PAMAM Dendrimers),聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA),碳納米管，聚乙烯亞胺(PEI)或量子點。
3.如權(quán)利要求1所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述細胞自噬干預(yù)藥物選自細胞自噬抑制劑、細胞自噬激活劑或自噬相關(guān)基因。
4.如權(quán)利要求3所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述細胞自噬抑制劑選自3-甲基腺嘌呤、氯喹、羥基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮或巴伐洛霉素Al。
5.如權(quán)利要求3所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述細胞自噬激活劑選自雷帕霉素或海藻糖。
6.如權(quán)利要求3所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述自噬相關(guān)基因是siRNA或shRNA。
7.如權(quán)利要求1所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物由一種或多種自噬干預(yù)藥物與一種或多種所述的納米材料組成。
8.如權(quán)利要求7所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物的組成方法為藥物與納米材料之間離子相互作用、化學(xué)鍵形成反應(yīng)、物理結(jié)合或生物反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求1所述的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物選自以下一組中的形式進行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體或納米微球。
10.權(quán)利要求1的降低納米遞藥材料體內(nèi)外毒性藥物復(fù)合物在制備藥物遞送、醫(yī)學(xué)影像、疾病診斷或腫瘤治療制劑中的用途。
11.如權(quán)利要求10的用途，其特征在于，所述的藥物復(fù)合物的組分序貫使用。
【文檔編號】A61K48/00GK104511017SQ201310460943
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】鞠佃文, 李玉彬, 曾賢, 錢曉璐, 王紹飛, 王子玉, 范佳君, 孫筠, 宋平, 馮美卿 申請人:復(fù)旦大學(xué)