Lycojaponicumin C在治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用,屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用;Lycojaponicumin?C在制備抑制白血病細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,Lycojaponicumin?C在制備誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。Lycojaponicumin?C通過(guò)抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡,來(lái)對(duì)白血病進(jìn)行治療。對(duì)于本發(fā)明涉及的Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開,由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對(duì)于白血病細(xì)胞的抑制活性強(qiáng)得意想不到。
【專利說(shuō)明】Lycojapon i cumi n C在治療白血病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Lycojaponicumin C的用途,尤其涉及Lyco japonicumin C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]急性白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤(rùn)其他器官和組織,同時(shí)使正常造血受抑制,臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤(rùn)癥狀。根據(jù)統(tǒng)計(jì),白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右,是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國(guó)中,歐洲和北美發(fā)病率最高,其死亡率為3.2-7.4/10萬(wàn)人口。尋找能夠防治急性白血病的藥物顯得非常迫切。
[0003]本發(fā)明涉及的化合物L(fēng)ycojaponicumin C是一個(gè)2012年發(fā)表(Wang, X.J.etal., 2012.Lycojaponicumins A-C, Three Alkaloids with an Unprecedented Skeletonfrom Lycopodium japonicum.0rganic Lettersl4 (10),2614-2617.)的新骨架化合物,對(duì)于本發(fā)明涉及的在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開,由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對(duì)于白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)的生物活性強(qiáng)得意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn),同時(shí)用于白血病的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明提供一種Lycojaponicumin C在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用,以增加Lycojaponicumin C在藥物中的應(yīng)用。
[0005]Lycojaponicumin C 在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0006]Lycojaponicumin C通過(guò)抑制白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)凋亡,來(lái)對(duì)白血病進(jìn)行治療。
[0007]所述化合物L(fēng)ycojaponicumin C結(jié)構(gòu)如式(I )所示:
[0008]H3°w
%
N
CH3
式(I)
[0009]本發(fā)明涉及的Lycojaponicumin C在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開,而且由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對(duì)于白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)的生物活性強(qiáng)得意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn),同時(shí)用于白血病的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C的制備方法參見文獻(xiàn)(Wang, X.J.etal.,2012.Lycojaponicumins A-Cj Three Alkaloids with an Unprecedented Skeletonfrom Lycopodium japonicum.0rganicLettersl4(10),2614-2617.)。
[0011]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制,而是由權(quán)利要求加以限定。
[0012]實(shí)施例1:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C片劑的制備:
[0013]取20克化合物L(fēng)ycojaponicumin C,加入制備片劑的常規(guī)輔料180克,混勻,常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。
[0014]實(shí)施例2:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C膠囊劑的制備:
[0015]取20克化合物L(fēng)ycojaponicumin C,加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克,混勻,裝膠囊制成1000片。
[0016]下面通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明其藥物活性。
[0017]試驗(yàn)例:Lyco japonicumin C抑制HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡
[0018]I材料和方法
[0019]1.1材料RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、羅丹明123為Sigma公司產(chǎn)品;Caspase_3, 9分光光度法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0020]1.2細(xì)胞培養(yǎng)人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物研究所,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,青霉素100kU/L,鏈霉素100mg/L,37°C,5%C02,飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0021]L 3人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離
[0022]無(wú)菌采集健康供者靜脈血,肝素抗凝(每毫升全血加0.1ml的200U/ml肝素鈉溶液),PBS等倍稀釋血液,1:4加入人淋巴細(xì)胞分離液,2000rpm離心20min,收集乳白層后用無(wú)血清RPM1-1640培養(yǎng)基1500rpml0min離心洗滌2次,獲得單個(gè)核細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)拒染率大于95%,重懸于10%FCS的RPM1-1640培養(yǎng)基中備用。
[0023]1.4 Lycojaponicumin C 對(duì) HL-60 細(xì)胞和人 PBMC 生長(zhǎng)的影響
[0024]接種HL-60細(xì)胞和人PBMC與96孔板,每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞(IOOul )。37°C、5%C02條件下培養(yǎng) 24h 后,實(shí)驗(yàn)組一次加 0.625、1.25,2.5,5.0,10.0ug/mL 的 Lyco japonicumin C,繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72h后,終止培養(yǎng),設(shè)只加培養(yǎng)液的對(duì)照組,每個(gè)劑量組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h,每孔加入20ul MTT溶液(5g/L),繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄上清液,每孔加入150uL DMS0,震蕩lOmin,選擇570nm波長(zhǎng),在自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,并計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率(Cl)。Cl=(陰性對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/陰性對(duì)照組A值X 100%。
[0025]1.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率
[0026]收集0、2.5、5.0、10.0ug/mL Lycojaponicumin C 處理 48h 的各組細(xì)胞,PBS 洗漆2次,加入預(yù)冷的70%乙醇于-20°C固定24h,離心洗滌后加入200uL PI染液,50ul RNA酶,4°C避光放置20min,1500rpm離心5min。調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/ml~I X IO6個(gè)/ml,上流式細(xì)胞儀分析,激發(fā)光源為氬離子激光,激發(fā)波長(zhǎng)為488nm。
[0027]1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析
[0028]軟件SPSS13.0處理,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。
[0029]2 結(jié)果
[0030]2.1Lycojaponicumin C 對(duì) HL-60 細(xì)胞及 PBMC 生長(zhǎng)的影響
[0031]對(duì)照組HL-60 細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,經(jīng) 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL 的Lycojaponicumin C處理72h后,HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)均不同程度的減慢,并呈濃度依賴性。在相同濃度下,培養(yǎng)72h Lycojaponicumin C對(duì)人PBMC幾乎無(wú)抑制作用,與HL-60細(xì)胞比較有顯著性差異(P〈0.05)(見表1)。
[0032]表1 Lycojaponicumin C 對(duì) HL-60 細(xì)胞增殖的影響(x±s, n=4)
[0033]
Lycojaponicu增值抑制率/%
min C72h 72h (PBMC)
(ug/mL)
0.625丨 4.1 土2.1 0.0 土 0.0AA
1.2529.2 土 3.7** 0.5±0.2AA
2.5048.3 ±5.6*0 1.9 ±0.4“
5.0062.4 ±6.1,3.8±0.7aa
10.073.1±2.7**λ 8.1 ±0.5“
[0034]與24h 比較 *ρ〈0.05**ρ〈0.01 ;與 48h 比較 Λ ρ〈0.05 Δ Δ ρ〈0.01 ;與 72h 比較▲p〈0.05AAp<0.0l
[0035]2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡
[0036]HL-60細(xì)胞與不同濃度的Lycojaponicumin C作用48h后,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果顯示G1期峰前均出現(xiàn)了代表細(xì)胞凋亡的亞二倍體峰,在一定濃度范圍內(nèi)隨著LycojaponicuminC 濃度增升高,HL-60 細(xì)胞凋亡率升高,其中 10.0ug/mL LycojaponicuminC作用48h凋亡率達(dá)到(27.56±4.87)% (表2)。
[0037]表2 Lycojaponicumin C 作用 48h 后對(duì) HL-60 細(xì)胞凋亡率的影響(x± s, n=3)
[0038]
組別劑量凋亡率
I ug/mL)%
陰性對(duì)照O0.52 ±0.11
LycojaponicuminC2.58.53 ± 1.98*
5.015.24 土 1.1 3**
10.023.55±2.87**
[0039]與陰性對(duì)照組比較*ρ〈(λ 05, **p<0.01
[0040]結(jié)論:Lycojaponicumin C能夠抑制白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)凋亡,因此,可以用來(lái)對(duì)白血病進(jìn)行治療。
【權(quán)利要求】
1.Lycojaponicumin C在治療白血病藥物中的應(yīng)用,所述化合物L(fēng)ycojaponicumin C結(jié)構(gòu)如式(I )所示:
【文檔編號(hào)】A61K31/438GK103463064SQ201310435482
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】吳俊華, 黃蓉 申請(qǐng)人:南京廣康協(xié)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司