丹參二萜醌有效部位及其逆流色譜制備方法和癌癥治療應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中醫(yī)藥【技術領域】，涉及一種丹參二萜醌有效部位及其逆流色譜制備方法和癌癥治療應用。它解決了現(xiàn)有技術提取難度較大，品質(zhì)難以控制，有效部位提取率不高等技術問題。制備方法包括：A、提?。阂缘樵希捎贸R界流體萃取法或溶劑提取法對丹參提取，得到丹參總二萜醌；B、分離：將上述丹參總二萜醌進行高速逆流色譜半制備分離，收集富含隱丹參酮的流分，減壓回收逆流色譜溶劑，干燥，得到丹參二萜醌有效部位。其優(yōu)點在于：丹參二萜醌有效部位生理活性強，含有多個在生物醫(yī)藥領域具有廣闊應用前景的邁克爾反應受體分子。有效部位，多個成分之間具有“多組分、多靶點”的協(xié)同作用，能夠一定程度上代表丹參藥材的功效。
【專利說明】丹參二萜醌有效部位及其逆流色譜制備方法和癌癥治療應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中醫(yī)藥【技術領域】，涉及丹參，尤其是涉及一種丹參二萜醌有效部位及其逆流色譜制備方法和癌癥治療應用。
【背景技術】
[0002]丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根及根莖,具有活血、化瘀、益氣等功效。丹參性味平和，毒副作用小，為臨床常用大宗中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載:“丹參，味苦、微寒。主心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣”。丹參脂溶性成分的應用可追溯到南北朝時期。中醫(yī)典籍記載，丹參用苦酒與豬脂提取，所得即為“赤羔”，主治瘡瘍癰腫?！俺喔帷奔礊榈⒖偠契惓煞?，該類成分以丹參酮II A、隱丹參酮等為代表，臨床主要用于心、腦血管疾病的治療。近年來研究表明:丹參二萜醌對多種人源腫瘤細胞亦具有抑制作用，并且能誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。丹參二萜醌多具有α、β、Y、δ不飽和酮結構單元，為一類結構新穎的邁克爾反應受體分子，在生物醫(yī)藥領域具有良好的應用前景。隱丹參酮是一種高效、特異的STAT3抑制劑(Cancer Research, 2009)。丹參二職醌“多組分、多祀點”協(xié)同應對肝癌等復雜疾病，體現(xiàn)了中醫(yī)藥協(xié)同的特色與優(yōu)勢。
[0003]目前，在丹參二氧化碳超臨界流體萃取法上，文獻“均勻設計法優(yōu)化超臨界CO2超臨界流體萃取丹參中丹參酮工藝的研究”(何雁；均勻設計法優(yōu)化超臨界CO2超臨界流體萃取丹參中丹參酮工藝的研究；中國中藥雜志；2006年第31卷24期)公開了丹參二氧化碳超臨界流體萃取的工藝，包括以萃取物中3種丹參酮總成分的含量為指標，考察丹參超臨界流體萃取的工藝條件。超臨界流體萃取法對于丹參二萜醌類脂溶性成分的提取具有一定的優(yōu)勢，但文獻將三種具體的丹參酮作為首選的考察指標，而非以總二萜醌為指標，可能會使總二萜醌的得率受到一定的影響，存在一定的技術缺陷。
`[0004]目前，在丹參二萜醌溶劑提取方面，文獻“硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離純化丹參中丹參酮”(藍天鳳；硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離純化丹參中丹參酮；中草藥；2011年第42卷3期)公開了丹參的提取方法，包括丹參粉碎成粗粉，用石油醚、甲醇滲漉提取，收集甲醇提取液，濃縮后等體積氯仿萃取，得到丹參酮粗提物。該提取方法能高效地提取出總丹參酮，雖然丹參總二萜醌極性較小，但石油醚滲漉時，仍會造成丹參二萜醌的損失；甲醇提取，毒性亦較大，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)，存在一定的技術缺陷。
[0005]目前，在丹參二萜醌高速逆流色譜分離上，文獻“高速逆流色譜分離制備丹參脂溶性成分”(屈焱；高速逆流色譜分離制備丹參脂溶性成分；化學工業(yè)與工程；2007年第24卷I期)公開了 5種丹參酮單體的高速逆流色譜分離、純化方法，包括以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，優(yōu)化了逆流色譜的色譜條件及操作方法。雖然該方法所用的溶劑系統(tǒng)對分離丹參二萜醌具有一定的優(yōu)勢，但該方法主要目的是分離單體，為了得到高純度的單體，會損失分離效率，故建立的方法，轉(zhuǎn)速只有800r/min,—次進樣量不超過150mg,流速只有4mL/min,且分離時間需要380min,存在一定的技術缺陷。
[0006]文獻“硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離純化丹參中丹參酮”(藍天鳳；硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法分離純化丹參中丹參酮；中草藥；2011年第42卷3期)公開了 6種丹參酮單體的高速逆流色譜分離方法，該方法雖然分離得到了 6個高純度的丹參二萜醌單體，但純化方法用到了硅膠柱層析，會造成一定的環(huán)境污染；另外該方法效率亦較低，流速為2mL/min,轉(zhuǎn)速為850r/min, —次進樣量只有80mg,存在一定的技術缺陷。
[0007]文獻“一種綠色環(huán)保的丹參酮II A及隱丹參酮的高速逆流色譜純化方法研究”(MinZhang,Svetlana Ignatovabj Ping Hue, Qionglin Liangdj Yiming Wangdj Guoan Luoj FrankWu June, Ian Sutherland ；Development of a strategy and process parameters for agreen process in counter-current chromatography:Purification of tanshinone IIAand cryptotanshinone from Salvia miltiorrhiza Bunge as a case study ；Journal ofChromatography A ；2011 ; 1218:6031-6037)公開了一種丹參酮II A及隱丹參酮的高速逆流色譜純化方法，該方法能分離純化得到兩種高純度的丹參酮單體，得率較高，但該方法必須分兩步進行，即先用逆流色譜粗分離，再細分單體，較繁瑣，且第一步粗分離中，用到了二氯甲烷，二氯甲烷工業(yè)化大生產(chǎn)會對生產(chǎn)人員產(chǎn)生一定的肝損傷，存在一定的技術缺陷。
[0008]文獻“通過高速逆流色譜從丹參中提取、半制備分離丹參酮”(AilingSun，Yongqing Zhang，Aifeng Li，Zhaoling Meng，Renmin Liu ；Extraction andpreparative purification of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge byhigh-speed counter-current chromatography ；Journal of Chromatography B ；2011 ；879:1899-1904)公開了七種丹參二萜醌單體的逆流色譜制備方法，該法能同時分離得到七種高純度丹參二萜醌單體，由于該法主要目標仍然是分離、純化丹參二萜醌單體，故其流速只能調(diào)到2mL/min,轉(zhuǎn)速為900r/min,分離400mg丹參總二職醌約需550min,效率較低，且隱丹參酮的得率只有6.6%，存在一定的技術缺陷。
[0009]文獻“隱丹參酮通過阻斷STAT3 二聚體的形成抑制D145人前列腺癌細胞”(Dae-Seop Shin,Hye-Nan Kim, Ki Deok Shin,Young Ju Yoon, Seung-Jun Kim, DongCho Han, and Byoung-Mog Kwon ；Cryptotanshinone Inhibits Constitutive SignalTransducer and Activator of Transcription3Function through Blocking theDimerization in DU145Prostate Cancer Cells ；Cancer Res ;2009 ;69: (I):193-202)公開了隱丹參酮具有顯著抑制人前列腺癌細胞增殖的作用，且證明隱丹參酮為高效STAT3抑制劑，但隱丹參酮單體的生物活性不能代表丹參二萜醌有效部位的活性?！岸嘟M分，多靶點”協(xié)同，是中醫(yī)藥的優(yōu)勢與特色。丹參二萜醌有效部位在多個二萜醌單體協(xié)同應對復雜疾病，如癌癥方面，具有一定的優(yōu)勢，故從協(xié)同的角度講，隱丹參酮單獨應用，具有一定的缺陷。
[0010]經(jīng)檢索專利文獻，中國專利文獻公開了一種本發(fā)明涉及丹參有效部位標準提取物丹參酚酮、其制備方法以及包含所述丹參提取物的藥物組合物及其在制備防治心腦缺血性疾病的藥物中的應用[申請?zhí)?200610113897.4]。丹參酚酮的制備方法主要包括以下步驟:用二氧化碳超臨界提取技術提取丹參酮類化合物，再用水煎煮提取水溶性丹酚酸類并以乙酸乙酯純化，然后將獲得的兩種固體粉末按提取率及含量折算后進行混合。該方法使丹參酚酮同時富含丹參脂溶及水溶兩類主要心腦血管活性成分且相對比例適當、丹參酚類和丹參酮類活性成分的轉(zhuǎn)移率及其在制劑中的含量大幅度提高，從而可確保丹參酚酮可作為丹參的標準提取物，該標準提取物能代表丹參主要功效和作用并能保證其高的作用強度和更好的臨床療效。然而，上述方案仍然存在著提取難度較大，品質(zhì)難以控制，有效部位提取率不高，生理活性較低，且提取物質(zhì)量難以保障等技術問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，適于工業(yè)化大生產(chǎn)的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供一種易于分離、純化得到性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控、生理活性強，含有多個在生物醫(yī)藥領域具有廣闊應用前景的邁克爾反應受體分子，多個成分之間具有“多組分、多靶點”的協(xié)同作用的丹參二萜醌有效部位。
[0013]本發(fā)明再有一目的是提供一種質(zhì)量可控、劑量小、使用方便、對癌癥具有明顯抑制作用的丹參二萜醌有效部位作為治療癌癥藥物的應用。
[0014]為達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術方案:本丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，本制備方法包括下述步驟:
[0015]A、提取:以丹參為原料，采用超臨界流體萃取法或溶劑提取法對丹參提取，得到丹
參總二萜醌；
[0016]B、分離:將上述丹參總二萜醌進行高速逆流色譜半制備分離，收集富含隱丹參酮的流分，減壓回收逆流色譜溶劑，干燥，得到丹參二萜醌有效部位。
[0017]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，在上述的步驟A中，所述的丹參為中藥丹參的根和/或根莖，且所述的丹參經(jīng)打粉、過篩后，備用。丹參為大宗藥材，價廉易得。
[0018]在上述的丹參二萜醌有效 部位逆流色譜制備方法中，所述的超臨界流體萃取法溶媒為二氧化碳，夾帶劑為無水乙醇，夾帶劑體積分數(shù)為8~15%。二氧化碳超臨界流體萃取法對丹參總二萜醌具有較高的提取效率，夾帶劑的加入，使得極性較大的二萜醌亦有較高的提取得率；該方法提取溫度較低，不會對熱敏性成分造成破壞。
[0019]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，所述的超臨界流體萃取法，丹參經(jīng)打粉后過10目篩，用二氧化碳超臨界流體萃取，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為55°C，萃取2h，每小時加500mL無水乙醇作為夾帶劑，分離釜溫度為35°C。
[0020]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，所述的溶劑提取法選用重量為丹參重量6~10倍量且質(zhì)量濃度為95%的乙醇溶液，在常溫下滲漉提取，提取液濃縮，加水混懸，用等體積的有機萃取溶劑萃取。
[0021]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，所述的有機萃取溶劑包括石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一種。溶劑提取法在常溫下操作，能避免熱敏性丹參二萜醌的損失；所述提取溶劑優(yōu)先選用95%乙醇，該溶劑能將脂溶性的丹參二萜醌高效率地提取出來，且能避免其它水溶性雜質(zhì)影響后續(xù)逆流色譜的分離；所述萃取溶劑包括石油醚，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯；優(yōu)先選用二氯甲烷，二氯甲烷對丹參總二萜醌具有較好的溶解能力，且能避免其它雜質(zhì)被萃取出來，影響后續(xù)逆流色譜的分離。
[0022]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，所述的逆流色譜溶劑包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；或者所述的逆流色譜溶劑包括石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述逆流色譜溶劑的下相為流動相，采用反相色譜模式。能夠分離丹參二萜醌的逆流色譜溶劑系統(tǒng)有多種，本發(fā)明采用的溶劑系統(tǒng)，上相及下相在轉(zhuǎn)速較高，如1500r/min時，不會乳化，對高效分離非常有利；丹參二萜醌極性較小，所選溶劑系統(tǒng)的上相對丹參二萜醌具有較強的保留性能，故能提高分離效能；所述溶劑系統(tǒng)，除甲醇外，毒性均較小，且價廉，能降低生產(chǎn)成本。逆流色譜法流分洗脫出管路較集中，故本發(fā)明在有紅色流分洗脫出管路時，立即開始收集流分，4mL收集一個流分；進樣量較大時，紫外檢測器檢識存在一定的誤差，故經(jīng)薄層及液相色譜檢識摸索，富含隱丹參酮的流分主要集中在6~11管。
[0023]在上述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法中，所述的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為12:8:13:7 ;所述的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為12:8:13:7。
[0024]根據(jù)上述丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法制得的丹參二萜醌有效部位，其特征在于，所述的丹參二萜醌有效部位的隱丹參酮面積歸一化法含量為65~75%，余量為其他丹參二萜醌類成分。
[0025]根據(jù)上述丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法制得的丹參二萜醌有效部位作為治療癌癥藥物的應用。更具體地說，丹參二萜醌有效部位對人肝癌、人肺癌、人胃癌、人結腸癌、人骨髓瘤、人乳腺癌等十三種人源腫瘤細胞株，具有一定的抑制作用。以CCK-8法，對高速逆流色譜法分離純化得到的丹參二萜醌有效部位，進行了抑制人源腫瘤細胞株增殖活性的篩選，結果顯示，本發(fā)明制備的丹參二萜醌有效部位對人肝癌、人肺癌、人胃癌、人結腸癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九種人源腫瘤細胞株具有一定的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC5tl約為:4.37~29.0y g/mL。上述細胞株可采用市售產(chǎn)品，如可采用美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(American type culture collection)的各種細胞株。
[0026]與現(xiàn)有的技術相比，本丹參二萜醌有效部位及其逆流色譜制備方法和癌癥治療應用的優(yōu)點在于:丹參二萜醌有效部位生理活性強，含有多個在生物醫(yī)藥領域具有廣闊應用前景的邁克爾反應受體分子。有效部位，多個成分之間具有“多組分、多靶點”的協(xié)同作用，能夠一定程度上代表丹參藥材的`功效，并且具有質(zhì)量可控、劑量小、使用方便等優(yōu)點，有別于傳統(tǒng)中藥“粗、大、黑”的落后的應用形式。首次利用半制備型高速逆流色譜法，分離、純化得到了富含隱丹參酮的有效部位。使用的溶劑廉價易得，且毒性較低。高速逆流色譜與硅膠柱層析、大孔吸附樹脂等分離、純化方法相比，更適合進行工業(yè)化生產(chǎn)，屬于綠色節(jié)能，環(huán)境友好型純化方法。本發(fā)明丹參二萜醌有效部位的制備方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為丹參總二萜醌超高效液相色譜圖。
[0028]圖2為隱丹參酮、丹參酮IIA混標超高效液相色譜圖。
[0029]圖3為丹參二萜醌有效部位超高效液相色譜圖。
[0030]圖4為隱丹參酮對照品超高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0031]實施例1:
[0032]本丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法包括下述步驟:A、提取:以丹參為原料，采用超臨界流體萃取法對丹參提取，得到丹參總二萜醌；B、分離:將上述丹參總二萜醌進行高速逆流色譜半制備分離，收集富含隱丹參酮的流分，減壓回收逆流色譜溶劑，干燥，得到丹參二萜醌有效部位。
[0033]丹參為中藥丹參的根和/或根莖，且所述的丹參經(jīng)打粉、過篩后，備用；具體而言為過10目篩。超臨界流體萃取法溶媒為二氧化碳，夾帶劑為無水乙醇，夾帶劑體積分數(shù)為8~15%，且優(yōu)選的夾帶劑體積分數(shù)為10%。二氧化碳超臨界流體萃取法對丹參總二萜醌具有較高的提取效率，夾帶劑的加入，使得極性較大的二萜醌亦有較高的提取得率；該方法提取溫度較低，不會對熱敏性成分造成破壞。具體而言，超臨界流體萃取法，丹參經(jīng)打粉后過10目篩，用二氧化碳超臨界流體萃取，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為55°C，萃取2h，每小時加500mL無水乙醇作為夾帶劑，分離釜溫度為35°C。
[0034]逆流色譜溶劑包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述逆流色譜溶劑的下相為流動相，采用反相色譜模式；并且正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為12:8:13:7。具體而言，丹參總二萜醌用上相及下相溶解，采用反相色譜模式，流動相上行法，進行逆流色譜半制備分離，通過薄層層析及液相色譜檢識，收集富含隱丹參酮的流分，減壓回收溶劑，干燥，得到丹參二萜醌有效部位。如:丹參總二萜醌用6mL上相及6mL下相溶解，一次進樣量為500mg,樣品用0.45 μ m微孔濾膜過濾,備用；固定相充滿管路后,調(diào)流速至1200~1500r/min,直接進樣,再用流動相開始洗脫,流動相流速為5~7mL/min ;紅色流分流出管路后,立即開始收集流分，4mL收集一個流分，取6~11管，合并流分，減壓回收溶劑，干燥，即得到丹參二職醌有效部位。
[0035]顯然，能夠分離丹參二萜醌的逆流色譜溶劑系統(tǒng)有多種，本實施例采用的溶劑系統(tǒng)，上相及下相在轉(zhuǎn)速較高，如1500r/min時，不會乳化，對高效分離非常有利；丹參二萜醌極性較小，所選溶劑系統(tǒng)的上相對丹參二萜醌具有較強的保留性能，故能提高分離效能；所述溶劑系統(tǒng)，除甲醇外，毒性均較小，且價廉，能降低生產(chǎn)成本。逆流色譜法流分洗脫出管路較集中，故本發(fā)明在有紅色流分洗脫出管路時，立即開始收集流分，4mL收集一個流分；進樣量較大時，紫外檢測器檢識存在一定的誤差，故經(jīng)薄層及液相色譜檢識摸索，富含隱丹參酮的流分主要集中在6~11管。丹參二萜醌有效部位的隱丹參酮面積歸一化法含量為65~75%，余量為其他丹參二萜醌類成分，故該有效部位是富含隱丹參酮的丹參二萜醌有效組分群。
[0036]圖1為丹參總二萜醌超高效液相色譜圖。圖2為隱丹參酮、丹參酮IIA混標超高效液相色譜圖。其中，色譜條件:流動相，圖1采用0.1%甲酸水，圖2采用乙腈，梯度洗脫，O ~19min, 25 ~60% ;圖 2 中 19 ~20min, 60 ~25% ；圖 2 中流速:0.3mL/min,進樣量 I μ L,檢測波長，270nm。圖3為丹參二萜醌有效部位超高效液相色譜圖。圖4為隱丹參酮對照品超高效液相色譜圖。色譜條件:流動相，圖3采用0.1%甲酸水，圖4采用乙腈，梯度洗脫，
O~19min, 25 ~60% ;圖 4 中 19 ~20min, 60 ~25% ；圖 4 中流速:0.3mL/min,進樣量 I μ L,檢測波長，270nm。
[0037]詳細制備過程如下:
[0038]①取IOkg干燥的丹參飲片，打粉，過10目篩，投入裝置中，進行二氧化碳超臨界流體萃取，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為55°C，萃取2h，每小時加入500mL無水乙醇，分離釜溫度為35°C，得到的提取液(主要為提取物的無水乙醇溶液)，在50°C以下減壓蒸干，得到約31.2g紅色膏狀物。
[0039]②所得到的丹參總二萜醌約500mg，精密稱定，用6mL上相及6mL下相溶解，用
0.45 μ m微孔濾膜過濾，備用；按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比為12: 8: 13: 7配制一定體積的溶劑，充分振搖，靜置過夜，分取上相及下相，使用前超聲脫氣5min ;將上相首先泵入逆流色譜儀，流速:15mL/min,轉(zhuǎn)速300r/min ;泵入約350mL上相后,將轉(zhuǎn)速調(diào)至1300r/min,進樣,開始用流動相洗脫，流速為6mL/min,待紅色流分流出管路后，開始收集流分，4mL收集一管，取6~11管，合并流分，減壓回收溶劑，干燥，即得到丹參二萜醌有效部位。按此方法，反復進行逆流色譜分離純化，共得到約2.7g丹參二萜醌有效部位。
[0040]取制備的丹參總二萜醌約12.5mg，精密稱定，加甲醇溶解定容至25mL的容量瓶中，過0.22 μ m的微孔濾膜，備用；取隱丹參酮及丹參酮IIA的對照品適量，精密稱定，配成10 μ g/mL隱丹參酮、50 μ g/mL丹參酮IIA的混合對照品溶液，備用；取制備的丹參二萜醌有效部位適量，加甲醇溶解，制成lmg/mL的供試液，過0.22 μ m的微孔濾膜，備用；取隱丹參酮適量，加甲醇溶解，制成lmg/mL的對照品溶液，備用；取上述對照品溶液及樣品供試液，進行Waters Acquity UPLC/TUV超高效液相色譜分析,液相色譜條件:流速:0.3mL/min,檢測波長:270nm,洗脫體系:乙腈-0.1%甲酸水,洗脫條件:0~19min, 25~60%乙腈，19~20min，60~25%乙腈，進樣量I μ L。
[0041]丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法制得的丹參二萜醌有效部位作為治療癌癥藥物的應用。更具體地說，丹參二萜醌有效部位對人肝癌、人肺癌、人胃癌、人結腸癌、人骨髓瘤、人乳腺癌等十三種人源腫瘤細胞株，具有一定的抑制作用。以CCK-8法，對高速逆流色譜法分離純化得到的丹參二萜醌有效部位，進行了抑制人源腫瘤細胞株增殖活性的篩選，結果顯示，本發(fā)明制備的丹參二萜醌有效部位對人肝癌、人肺癌、人胃癌、人結腸癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九種人源腫瘤細胞株具有一定的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC5tl約為:4.37~29.0 μ g/mL。上述細胞株可采用市售產(chǎn)品，如可采用美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC(American type culture collection)的各種細胞株。
`[0042]丹參二萜醌有效部位體外抗腫瘤實驗:
[0043]取對數(shù)生長期的人源腫瘤細胞株，消化計數(shù)后，按6~9X IO3個細胞/100 μ L/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，用不同濃度的丹參二萜醌有效部位處理，每孔設三個復孔。藥物與腫瘤細胞孵育24h后，加CCK-8，37°C繼續(xù)孵育Ih后，終止培養(yǎng)，用移液槍輕輕吸掉培養(yǎng)液，加入DMS0( 150 μ L/孔)，振搖均勻后，用酶標儀在450nm處測定每個孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均數(shù)，將各測試孔的OD值減去本底OD值。腫瘤細胞的抑制率:
[0044]抑制率=(1-給藥孔平均光密度值/對照組平均光密度值)X 100%。根據(jù)抑制率計算藥物對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl), IC5tl用82798-1C50軟件計算。實驗重復3次，IC50 取 mean 土 SD。
[0045]分別對人肝癌、人肺癌、人胃癌、人結腸癌、人骨髓瘤、人乳腺癌，九種人源腫瘤細胞株進行試驗，上述細胞株購自ATCC,具體結果如表1所示。表1的結果顯示,丹參二職醌有效部位體外對九種人源腫瘤細胞株均具有一定的抑制作用。
[0046]表1:丹參二萜醌有效部位對人源腫瘤細胞株的半數(shù)抑制濃度IC5tl值(mean土SD, n=3)
【權利要求】
1.一種丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，本制備方法包括下述步驟:A、提取:以丹參為原料，采用超臨界流體萃取法或溶劑提取法對丹參提取，得到丹參總二萜醌； B、分離:將上述丹參總二萜醌進行高速逆流色譜半制備分離，收集富含隱丹參酮的流分，減壓回收逆流色譜溶劑，干燥，得到丹參二萜醌有效部位。
2.根據(jù)權利要求1所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，在上述的步驟A中，所述的丹參為中藥丹參的根和/或根莖，且所述的丹參經(jīng)打粉、過篩后，備用。
3.根據(jù)權利要求2所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的超臨界流體萃取法溶媒為二氧化碳，夾帶劑為無水乙醇，夾帶劑體積分數(shù)為8~15%。
4.根據(jù)權利要求3所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的超臨界流體萃取法，丹參經(jīng)打粉后過10目篩，用二氧化碳超臨界流體萃取，萃取壓力為25MPa，萃取溫度為55°C，萃取2h，每小時加500mL無水乙醇作為夾帶劑，分離釜溫度為35。。。
5.根據(jù)權利要求2所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法選用重量為丹參重量6~10倍量且質(zhì)量濃度為95%的乙醇溶液，在常溫下滲漉提取，提取液濃縮，加水混懸，用等體積的有機萃取溶劑萃取。
6.根據(jù)權利要求5所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的有機萃取溶劑包括石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的任意一種。
7.根據(jù)權利要求1或2或3或4或5或6所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的逆流色譜溶劑包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水；或者所述的逆流色譜溶劑包括石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水；其中上述逆流色譜溶劑的下相為流動相，采用反相色譜模式。
8.根據(jù)權利要求7所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法，其特征在于，所述的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為12:8:13:7 ;所述的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為12:8:13:7。
9.根據(jù)權利要求1-8中任意一項所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法制得的丹參二萜醌有效部位，其特征在于，所述的丹參二萜醌有效部位的隱丹參酮面積歸一化法含量為65~75%，余量為其他丹參二萜醌類成分。
10.根據(jù)權利要求1-8中任意一項所述的丹參二萜醌有效部位逆流色譜制備方法制得的丹參二萜醌有效部位作為治療癌癥藥物的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103479723SQ201310366663
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權日:2013年8月21日
【發(fā)明者】張光霽, 陳喆, 楊波, 沈煒, 申力 申請人:浙江中醫(yī)藥大學