利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥制備領域，特別涉及利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用。本發(fā)明以OVX大鼠簡歷骨質(zhì)疏松模型，用兩種GLP-1受體激動劑藥物利拉魯肽和Exendin-4連續(xù)8周經(jīng)行皮下注射，以觀察GLP-1類藥物長期作用對骨質(zhì)疏松大鼠的影響。本發(fā)明的結果證明了，對于經(jīng)典的骨質(zhì)疏松模型OVX大鼠，GLP-1受體激動劑利拉魯肽和Exendin-4可以改善其骨質(zhì)疏松狀態(tài)，利拉魯肽可以用于骨質(zhì)疏松治療藥物的制備。
【專利說明】利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥制備領域，特別涉及利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]糖尿病作為綜合性的代謝性疾病，隨著病程的日益進展會逐漸累及多個臟器，并發(fā)多種慢性疾病，如糖尿病腎病、糖尿病心血管疾病、糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病視網(wǎng)膜病變等。骨骼除了對人體起到支撐和保護作用外，更因為其處于一種骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，因而成為人體最大的代謝器官。骨質(zhì)疏松是累及絕經(jīng)后婦女和老年人的一種常見慢性疾病，而糖尿病也是中老年人群中的高發(fā)性疾病，糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折嚴重影響糖尿病患者的預后和生活質(zhì)量。因此，如果一種糖尿病治療藥物在降糖的同時若也能夠兼顧到改善骨質(zhì)量，將會在臨床應用中有更為顯著的意義。
[0003]GLP-1受體激動劑是一類新型的降糖藥物，目前在臨床應用較多的主要有利拉魯肽和Exendin-4，它們以一種葡萄糖依賴的方式促進胰島素的分泌。此外，GLP-1受體激動劑還可以通過直接作用于肝臟、脂肪和肌肉組織產(chǎn)生類胰島素樣的作用。細胞研究也證實，除了胰島β細胞和α細胞外，甲狀腺C細胞、成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞等影響骨代謝的細胞上也存在GLP-1受體。GLP-1受體激動劑的廣泛作用及其受體的在上述細胞中的表達使研究者們開始越來越多的關注這種新型降糖藥物對骨的影響。
[0004]Yamada研究小組發(fā)現(xiàn)GLP-1受體敲除的小鼠表現(xiàn)為皮質(zhì)骨密度降低，骨脆性增加，破骨細胞數(shù)量增加以及骨吸收加強。另有Nuche-Berenguer小組分別通過STZ刺激誘導形成的2型糖尿病大鼠(STZ-T2D大鼠)、果糖誘導形成的胰島素抵抗大鼠(IR大鼠)和高脂喂養(yǎng)的肥胖大鼠模型證實3天連續(xù)泵入GLP-1和Exendin-4可以改善大鼠的骨損傷。但是，較少研究報道GLP-1受體激動劑對骨質(zhì)疏松模型OVX大鼠的作用。
[0005]本發(fā)明通過構建OVX大鼠模型，研究GLP-1受體激動劑對骨代謝的直接作用，同時在細胞層面上探討該類藥物對原代骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞系分化的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是通過研究GLP-1受體激動劑對OVX大鼠骨質(zhì)量的影響，提供一種GLP-1受體激動劑利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用。
[0007]本發(fā)明以OVX大鼠簡歷骨質(zhì)疏松模型，用兩種GLP-1受體激動劑藥物利拉魯肽和Exendin-4連續(xù)8周經(jīng)行皮下注射，以觀察GLP-1類藥物長期作用對骨質(zhì)疏松大鼠的影響。利拉魯肽是一種人GLP-1同源類似物，通過對第26位346位氨基酸的替代和化學修飾，使其皮下注射后半衰期長達13小時，能夠在9-14小時內(nèi)維持很高的藥物濃度，因此一天內(nèi)僅需注射一次。Exendin-4是從巨蜥唾液中提取出的GLP-1類似物，能夠與GLP-1受體結合，產(chǎn)生類似于GLP-1的降糖作用。Exendin-4由于結構的不同而對GLP-1降解酶DPP-4不敏感，因此半衰期明顯延長，已獲美國FDA批準成為一種新型降糖藥。我們的實驗設計共分四組，假手術組、OVX組、OVX后給予利拉魯肽處理組和OVX后給予Exendin-4處理組。[0008]實驗選用8周齡的雌性Wistar大鼠隨機分配入組后進行雙側卵巢切除術和假手術，術后3個月骨質(zhì)疏松狀態(tài)基本形成，行活體micro-CT檢測驗證相較于假手術組，卵巢切除后的大鼠其股骨和椎體的骨皮質(zhì)變薄，骨密度下降，松質(zhì)骨微細結構出現(xiàn)明顯的紊舌L各參數(shù)均有下降。在驗證骨質(zhì)疏松模型已形成后，我們分別給予實驗組相應的藥物處理，在連續(xù)8周進行皮下注射利拉魯肽、Exendin-4或生理鹽水后對各組大鼠腰椎行離體micro-CT檢測。通二維圖像和三維立體重建后的參數(shù)分析結果顯示，OVX大鼠給予利拉魯肽和Exendin-4處理后，相比于OVX對照組，BV/TV和骨小梁厚度(Tb.Th)明顯提高，BS/TV和骨小梁間隙(Tb.Sp)明顯下降。
[0009]本發(fā)明的結果證明了，對于經(jīng)典的骨質(zhì)疏松模型OVX大鼠，GLP-1受體激動劑利拉魯肽和Exendin-4可以改善其骨質(zhì)疏松狀態(tài)，利拉魯肽可以用于骨質(zhì)疏松治療藥物的制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為兩月齡Wistar雌性大鼠卵巢切除3個月后假手術(SHAM)組和卵巢切除(OVX)組大鼠腰椎及股骨的活體Micro-CT檢測結果。A-C圖:分別為大鼠腰椎側面、第五腰椎矢狀面和股骨CT掃描圖；D圖:骨體積分數(shù)(Bone Volume/Total Volume)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness)、骨小梁間隙(Trabecular Spacing)、皮質(zhì)骨厚度(CorticalThickness)和骨小梁模型指數(shù)(Trabecular Patern Factor)結果柱狀圖。*代表Ρ〈0.05。
[0011]圖2為大鼠BMSCs流式檢測結果。上排顯示BMSC的表面標記物⑶90陽性率為96.5%，⑶44陽性率為92.7%;下排顯示造血干細胞的表面標記物⑶34陽性率僅為0.281%，淋巴細胞的表面標記物⑶45陽性率僅為0.328%，內(nèi)皮細胞的表面標記物⑶31陽性率僅為
0.227%。紅色曲線區(qū)域代表陰性對照IgGl，其他顏色曲線區(qū)域代表相應標記物抗體。
[0012]圖3為利拉魯肽對大鼠BMSC成骨分化的影響。A圖:上排顯示7天堿性磷酸酶染色情況，下排顯示21天茜素紅礦化結節(jié)染色情況，左側為對照組，右側為利拉魯肽組；B-D圖:成骨標志基因Runx2、ALP和Col-1在O天、3天、7天、14天和21天的表達情況，GAPDH作為內(nèi)參基因進行校正。E =NaOH溶解茜素紅礦化結節(jié)后進行的定量分析結果。*代表P〈0.05，**代表 Ρ〈0.01。
[0013]圖4為利拉魯肽對大鼠BMSC成脂分化的影響。A圖:大鼠BMSC成脂誘導第14天進行油紅O染色結果；Β圖:油紅O染色提取定量分析結果；C:real-timePCR檢測兩組細胞成脂誘導第14天PPARy的表達情況，GAPDH作為內(nèi)參基因進行校正。**代表P〈0.01。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明:
[0015]模型構建
[0016]32只6周齡未交配雌性Wistar購于上海斯萊克動物實驗中心，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗中心屏障環(huán)境中，受上海交通大學醫(yī)學院動物中心倫理委員會監(jiān)管。實驗大鼠每兩只喂養(yǎng)于塑料籠盒中，給予標準飲食和正常飲水，標準飼料中鈣含量0.9%，磷含量0.7%。屏障環(huán)境控制在溫度20~25°C，相對濕度50-60%，12小時光照循環(huán)(8am---8pm)。[0017]Wistar大鼠6周齡進入屏障環(huán)境后使其適應2周，于大鼠8周齡時開始實驗處理。32只大鼠隨機分配入假手術(SHAM)組，雙側卵巢切除(OVX)組，雙側卵巢切除加利拉魯肽干預(0VX+L)組和雙側卵巢切除加Exendin-4干預(0VX+E)組。卵巢切除手術完成后給予實驗大鼠3個月時間形成骨質(zhì)疏松狀態(tài),并在藥物干預前行活體顯微CT (in-vivo microCT)掃描以驗證模型動物的骨質(zhì)疏松狀態(tài)。藥物干預時間為8周，0VX+L組每只大鼠每日皮下注射利拉魯肽0.6U/kg, 0VX+E每只大鼠每日皮下注射Exendin-420ug/kg, OVX組每只大鼠每日皮下注射等體積生理鹽水。 [0018]雙側卵巢切除手術
[0019]各組實驗大鼠用5%水合氯醛腹腔注射麻醉(8ml/lkg)后背側向上固定于無菌手術臺上，待大鼠呼吸心跳平穩(wěn)后行卵巢手術切除。手術切口位于肋弓下I~2cm，脊柱兩側各Icm處，切口處脫毛面積2~3cm2，70%酒精消毒。OVX組大鼠開腹后沿輸卵管找到卵巢，以無菌手術線結扎輸卵管血管后切除末端結締組織包裹的卵巢，之后行雙層間斷縫合關閉腹腔。SHAM組大鼠切除與卵巢約相同體積的脂肪組織后縫合。整個手術過程遵循無菌操作原作，手術器械均高壓蒸汽消毒滅菌，大鼠術后肌肉注射青霉素20U/(kg)抗感染。
[0020]活體顯微CT 掃描(In-vivo micro CT)
[0021 ] SHAM組8只大鼠及OVX組、0VX+L組、0VX+E組隨機抽取3只共9只卵巢切除大鼠行活體micro CT掃描。實驗大鼠吸收入2.5%的異氟烷和氧混合氣體麻醉后固定于操作板中，期間持續(xù)進行氣體麻醉。本實驗所用顯微CT為the Inveon?CT scanner(Siemens, German),該儀器最小分辨率可達8.89 μ mx8.89 μ m χ8.89 μ m。選擇掃描參數(shù)如下:電壓80kv,電流500 μ A, 360度旋轉，360steps,每轉I度拍照I次,曝光時間:200ms, sumframe:3,每一個位置曝光 3 次，總共曝光時間為 600ms, binng2, system magnification:low, effective pixel size:50 μ m0以dsf2,校準好的HU值重建圖像。定量分析使用系統(tǒng)自帶的 Explore MicroView version2.2+Adance Bone Analysis (0E Health CareC0.) InveonTM Research Workplace with Trabecular Bone Analysis Tool 軟件。分析參數(shù)包括:骨密度(BMD)、骨體積分數(shù)(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thichness, Tb.Th.)、骨小梁間隔(trabecular separation, Tb.Sp.)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N.)、皮質(zhì)骨厚度(mean thickness)、皮質(zhì)骨模式系數(shù)(trabecular pattern factor)。
[0022]細胞實驗
[0023]流式細胞分析
[0024]I)加入Iml PBS重懸細胞,輕輕吹散細胞,用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。
[0025]2)進行換算，取含8X 106細胞數(shù)量的細胞懸液，離心800rpm，4分鐘。加入800微升PBS重懸細胞，輕輕吹散細胞，分別將200微升細胞懸液加入流式管中。
[0026]3)分別加入相應的熒光抗體，并設置空白對照。
[0027]4) 4攝氏度避光孵育30分鐘。
[0028]5) 4攝氏度離心，速度1500rpm，離心時間7分鐘，吸掉上清，200微升固定液重懸細胞。
[0029]6)流式細胞儀檢測。
[0030]大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和成骨、成脂誘導培養(yǎng)[0031]I)配制含10%FBS，1%抗生素的a -MEM培養(yǎng)液，置于37°C水浴鍋中預熱20min ；
[0032]2) 4周雄性Wistar大鼠兩只，斷頸處死，70%酒精浸泡15分鐘；
[0033]3)無菌超凈臺中分離雙側股骨和脛骨，剔除周圍肌肉及結締組織；
[0034]4)去除長骨兩端，用注射器抽取已配制好的培養(yǎng)液，反復沖洗骨髓腔多次，直至髓腔變白，留取沖洗液；
[0035]5)將得到的骨髓沖洗液離心，1000g，4min，移棄上清，重懸下層細胞沉淀，將細胞懸液種植入培養(yǎng)皿中，記為PO代。8字搖勻后放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
[0036]6)24小時后待細胞基本貼壁后首次換液:移棄培養(yǎng)液后用PBS清洗，之后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；
[0037]7)3天后再次換液，以后每2-3天換液一次，約一周后細胞集落已較大，集落之間無空白區(qū)域；去掉原培養(yǎng)液，0.25%Trypsin-EDTA消化后以1:2比例傳代。
[0038]8)取P3生長狀態(tài)良好的細胞，誘導前進行流式細胞分析實驗以驗證細胞純度。成骨誘導的細胞按3X103/cm2接種于六孔板，約70-80%匯合時，加入成骨誘導液，實驗組同時加入lOnmol/L利拉魯肽，每2_3天換液一次，分別于誘導第7d、14d、21d收取細胞RNA。成脂誘導的細胞按2X104/cm2鋪板，細胞完全匯合會繼續(xù)生長1_2天后在加入成脂誘導液，實驗組同時加入lOnmol/L利拉魯肽。3天后換為成脂誘導維持液，I天后再次換為成脂誘導液，如此進行三個循環(huán) ，使用維持液培養(yǎng)至14天，收取細胞。
[0039]實驗結果
[0040]去卵巢大鼠活體Micro CT檢測結果
[0041]2月齡雌性Wistar大鼠隨機分配入假手術(SHAM)組和卵巢切除(OVX)組，兩組大鼠手術完成后給予3個月的時間，待OVX組骨質(zhì)疏松狀態(tài)基本形成后對兩組大鼠進行活體Micro CT檢測以驗證造模成功。結果顯示，與SHAM組相比較，OVX大鼠相同部位的椎體，其周圍骨皮質(zhì)變薄，髓腔質(zhì)地疏松，呈現(xiàn)中空狀態(tài)(圖1A、B)，股骨干骺端骨小梁數(shù)量明顯減少，陰影減弱，骨髓腔面積增大，股骨皮質(zhì)厚度變薄(圖1C)。通過對影像結果的數(shù)據(jù)分析可以得到OVX大鼠骨體積分數(shù)(Bone Volume/Total Volume)、骨小梁厚度(TrabecularThickness)、和皮質(zhì)骨厚度(Cortical Thichness)均顯著下降,骨小梁間隙明顯增加。骨小梁模型指數(shù)(Trabecular Pattern Factor)提示骨小梁結構的改變,該指標由小變大提示骨小梁的結構由板狀結構向桿狀結構轉變，而板狀結構比桿狀結構能夠承受更大的骨應力，因此當骨小梁模型指數(shù)變大時代表骨質(zhì)量的下降。由圖1D可以看到OVX大鼠骨小梁模型指數(shù)明顯變大。
[0042]GLP-1受體長效激動劑利拉魯肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨、成脂分化的影響
[0043]取4周齡雄性Wistar大鼠的雙側股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁的方法獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，隨著傳代次數(shù)增加其純度逐漸增加。由于骨髓中不僅含有間充質(zhì)干細胞，同時還有大量造血干細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞等，我們進而通過流式細胞實驗對骨髓間充質(zhì)干細胞的純度進行鑒定。由圖3可以看到，BMSC的表面標記⑶90和⑶44為陽性，而造血干細胞的表面標記⑶34、淋巴細胞的表面標記⑶45以及內(nèi)皮細胞的表面標記⑶31均為陰性。
[0044]取P4代的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞，以3 X 103/cm2密度接種于6孔板，待細胞融合至80%加入成骨誘導液進行誘導，實驗組同時加入lOnmol/L利拉魯肽進行刺激。分別在O天、3天、7天、14天和21天五個時間點收集細胞RNA,通過real_timePCR檢測實驗組和對照組成骨標志基因的表達情況，同時在7天進行堿性磷酸酶染色，21天進行茜素紅礦化結節(jié)染色。由圖3可以看到，利拉魯肽在早期階段有促進成骨分化的作用，成骨誘導第7天的堿性磷酸酶染色，利拉魯肽組明顯強于對照組(圖3A)，成骨標志基因Runx2、ALP和Col-1的表達也是利拉魯肽組高于對照組(圖3B-D)，但隨著誘導時間延長，利拉魯肽促進成骨的作用逐漸減弱，第14天和21天各基因的表達水平在利拉魯肽組和對照組之間差異性消失，21天的茜素紅礦化結節(jié)染色也顯示兩組間無明顯差異(圖3A、E)。
[0045]另取P4代大鼠BMSCs進行成脂誘導，通過向培養(yǎng)液中添加各種成脂誘導劑以啟動成脂分化過程中的關鍵基因PPARy。實驗組同時加入lOnmol/L利拉魯肽。實驗以三天誘導一天維持的方式連續(xù)進行三輪成脂誘導刺激后于第14天對細胞進行油紅染色。由圖4可以看到，利拉魯肽顯著抑制大鼠BMSCs的脂肪分化，14天時對照組大部分基質(zhì)干細胞已經(jīng)分化成熟為脂肪細胞，形成大量脂滴，而利拉魯肽組中只有少量細胞出現(xiàn)脂肪分化，且脂滴較小(圖4A)。油紅O染 色提取定量分析結果也表明對照組脂肪分化程度明顯高于利拉魯肽組(圖4C)。Real-time PCR亦檢測到利拉魯肽抑制了脂肪分化的關鍵基因PPAR Y (圖4B)。
【權利要求】
1. 利拉魯肽在骨質(zhì)疏松治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61P19/10GK103536907SQ201310304186
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權日:2013年7月18日
【發(fā)明者】寧光, 陸楠, 劉建民, 趙紅燕, 趙琳 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院