一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，包括：功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物的制備、表面功能化修飾及表征；功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA的制備；功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA的基因轉(zhuǎn)染效率的研究。本發(fā)明制備的載體用于基因轉(zhuǎn)染具有易操作，轉(zhuǎn)染條件簡單，轉(zhuǎn)染效率高，特異性強等優(yōu)點，在癌癥基因治療等方面有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子納米載體靶向基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別涉及一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療在治療各種遺傳疾病和后天性疾病中有很大的應(yīng)用如景。現(xiàn)在，許多正在進(jìn)行的針對癌癥，遺傳疾病和其它方面疾病的臨床試驗，都考慮將基因治療作為一種新穎的藥用策略。然而，目前在基因治療中的一個主要的障礙就是缺乏安全有效的轉(zhuǎn)移和表達(dá)載體，將遺傳物質(zhì)傳遞到生物體所需的位置。
[0003]外部基因可以借助病毒和病毒載體傳遞到生物體內(nèi)。失活的病毒外殼或感染系統(tǒng)由于其高效的基因傳遞效率，已經(jīng)被應(yīng)用到各種基因療法的臨床測試上，但是將其作為基因運載工具卻對身體有著嚴(yán)重的安全隱患。病毒載體的主要缺點包括大規(guī)模生產(chǎn)上的限制，分裂細(xì)胞上的限制，免疫原性和由于插入突變導(dǎo)致的致腫瘤性，這些都制約其未來的應(yīng)用。
[0004]另一方面，非病毒載體被作為研究的對象，發(fā)現(xiàn)其具有低細(xì)胞毒性，無免疫原性，容易操作和基因裝載量大等特點。非病毒的基因傳遞系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、環(huán)糊精和納米管，這些材料都可以有效的克服固有病毒載體所存在的問題。
[0005]在目前報道的所有不同的載體中，樹狀大分子作為非常有潛力的研究對象，可將之應(yīng)用于開發(fā)安全、高效的適合基因傳遞載體。聚酰胺-胺(poly (amidoamine), PAMAMMi狀大分子是有著精確的構(gòu)架和單分散性的核殼納米結(jié)構(gòu)，表面豐富的陽離子不僅能通過共價鍵修飾各種靶向或者藥物分子，還能與裸DNA通過靜電相互作用，形成理想的納米粒子。而其獨特的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)可以包裹目標(biāo)分子，有選擇性地結(jié)合客體分子，十分適合于作為金屬納米顆粒的載體。在一些癌細(xì)胞中，比如人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87MG細(xì)胞)的細(xì)胞膜表面具有整合素α V β 3，能夠?qū)Ｒ恍缘淖R別環(huán)狀的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸氨基酸序列肽(RGD)并與之結(jié)合。因此，在聚酰胺-胺樹狀大分子表面修飾RGD，聚乙二醇(PEG)，并包裹納米金顆粒，有望·制備出一種聚乙二醇化的RGD修飾的包裹金納米顆粒的聚酰胺-胺樹狀大分子，實現(xiàn)其對基因的負(fù)載及靶向運輸。
[0006]檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:以聚乙二醇化的RGD修飾的包裹金納米顆粒的聚酰胺-胺樹狀大分子為載體，用于靶向基因轉(zhuǎn)染的方法，尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，該方法具有易操作，轉(zhuǎn)染條件簡單，轉(zhuǎn)染效率高，特異性強等優(yōu)點，在癌癥治療等方面有良好的應(yīng)用前景。
[0008]本發(fā)明的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，包括:
[0009](I)分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液、N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)2_4h，得到活化的mPEG-COOH ;然后將活化的mPEG-COOH加入到第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12-30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2-mPEG20 ;其中EDC和NHS與mPEG-COOH的摩爾比為1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1 ;
[0010](2)將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2-mPEG2(l加入到氯金酸HAuCl4.4H20溶液中，攪拌反應(yīng)20-30min，再加入硼氫化鈉NaBH4溶液，攪拌2_4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs ;其中HAuCl4.4H20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4.4H20的摩爾比為5:1;
[0011](3)將端基分別為氨基和羧基的聚乙二醇NH2-PEg-COOH溶液加入到6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯6-MAL溶液中，攪拌反應(yīng)6-8h，得到MAL-PEG-C00H溶液；然后加入巰基端環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽RGD-SH溶液，攪拌反應(yīng)10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液；然后再分別加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD-PEG-C00H ;然后將活化的RGD-PEG-C00H加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12_30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10 ;然后按步驟(I)中的過程，得到活化的mPEG-C00H，加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10中，反應(yīng)12_30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 ;其中 NH2-PEG-C00H、6_MAL、RGD-SH 的摩爾比為 1:1:1，EDC 和 NHS 與 mPEG-COOH 的摩爾比為 1.8:1，EDC 和 NHS 與 RGD-PEG-C00H 的摩爾比為 1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1 ;
[0012](4)將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10中加入HAuCl4.4Η20溶液攪拌15-30min，再加入NaBH4溶液，攪拌2_4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs ;其中 HAuCl4.4Η20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4`.4Η20的摩爾比為5:1;
[0013](5)將步驟(I) (2) (3) (4)所得的溶液進(jìn)行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs, G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs ;分別將 G5.NH2, G5.NH2_mPEG20，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20}DENPs，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 給它們命名為 Κ0, ΚΙ, Κ2, Κ3, Κ4 ；
[0014](6)按照相應(yīng)的Ν/Ρ比，取Κ1，Κ2，Κ3，Κ4用無菌水稀釋，并用無菌水稀釋質(zhì)粒，然后混合均勻，37°C孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA ;其中N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比，數(shù)值范圍為 1:1-5 ;
[0015](7)將U87MG細(xì)胞種于24孔板上，于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換成無血清的培養(yǎng)基，加入步驟(6)所得的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA,混合均勻，在培養(yǎng)箱中孵育4h，然后將培養(yǎng)基換成有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測基因轉(zhuǎn)染效率。
[0016]所述步驟(I)中mPEG-COOH溶液的濃度為11.6mmol/mL, EDC和NHS溶液的濃度為20.88mmol/mL，第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL，溶液溶劑均為二甲基亞砜DMSO。[0017]所述步驟(2)中HAuCl4水溶液濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為10mg/mL。
[0018]所述步驟(3)中NH2-PEg-COOH 溶液、6-MAL 溶液、RGD-SH 溶液、mPEG-COOH 溶液的濃度均為5.8mmol/mL, EDC和NHS溶液的濃度為10.44mmol/mL,第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL，溶劑均為DMS0。
[0019]所述步驟(4)中HAuCl4.4H20溶液的濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為IOmg/mL，溶劑均為水。
[0020]所述步驟(5)中透析為透析袋截留分子量為14000，用去離子水透析2-3d，每天3次，每次2L去離子水。
[0021]所述步驟(6)中質(zhì)粒為帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒或帶有增強的綠色熒光蛋白EGFP基因的質(zhì)粒。
[0022]所述步驟(7)中無血清的培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)液；有血清的培養(yǎng)基為10%FBS的MEM
培養(yǎng)基。
[0023]所述步驟(7)中轉(zhuǎn)染后表達(dá)時間為24_48h。
[0024]細(xì)胞毒性試驗的具體步驟:
[0025]將U87MG細(xì)胞種于96孔板上，于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)基，加入含K1，K2, K3, K4 終濃度分別為 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5%C02培養(yǎng)24h，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加入DMS0，搖床振蕩15-30min ;在酶標(biāo)儀下測試吸光值。
.[0026]所述的MTT濃度為5.0mg/mlo
[0027]所述吸光值測試參數(shù)為:測試波長570nm，參比波長630nm。
[0028]本發(fā)明以功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物為靶向基因載體，以人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞作為靶細(xì)胞，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。
[0029]本發(fā)明中使用1.8倍量EDC與NHS活化mPEG-COOH和RGD-PEG-C00H的羧基，增強與樹狀大分子反應(yīng)的活性，活化的mPEG-COOH和RGD-PEG-C00H在快速攪拌的情況下，以均勻的速度加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝PEG的均一性，而PEG又可以增加材料在體內(nèi)的生物相容性。
[0030]本發(fā)明中加氯金酸溶液時，采用逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，使氯金酸分子和樹狀大分子充分混合；在加NaBH4的時候，快速的加入，以保證樹狀大分子空腔內(nèi)的AuC14_離子能快速的被還原為金納米顆粒。
[0031]本發(fā)明通過核磁共振(1H NMR)對修飾在樹狀大分子表面的PEG和RGD的數(shù)量進(jìn)行了表征；紫外可見光譜(UV-Vis)對載體中的金納米顆粒的存在進(jìn)行了表征；透射電子顯微鏡(TEM)對載體中的金納米顆粒的分布和大小進(jìn)行了表征；凝膠阻滯實驗以及表面電勢和粒徑的測定對載體/pDNA復(fù)合物進(jìn)細(xì)胞的能力進(jìn)行了表征；MTT法測定了載體對細(xì)胞的毒性；熒光素酶表達(dá)實驗和綠色熒光蛋白表達(dá)實驗對載體的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了測定；自由RGD阻斷實驗對載體的靶向轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了表征。
[0032]本發(fā)明制備的基因載體能夠明顯的提高pDNA對人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力，因此發(fā)明制備的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物能夠作為基因載體用于癌細(xì)胞的靶向基因傳輸。
[0033]核磁共振(1H NMR)、紫外可見光譜(UV-Vis)、透射電鏡圖(TEM)、凝膠阻滯實驗、表面電勢和粒徑、細(xì)胞毒性試驗、熒光素酶表達(dá)實驗、綠色熒光蛋白表達(dá)實驗和自由RGD阻斷實驗的實驗結(jié)果分別如下:
[0034](I)1H NMR 測試結(jié)果
[0035]1H NMR圖譜用于表征PEG和RGD對樹狀大分子表面的修飾。參見說明書附圖1a:在化學(xué)位移3.5ppm處有個質(zhì)子峰，它是PEG分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰，根據(jù)積分面積可以求出每個Kl和K2表面連接了 19.9個PEG分子；參見說明書附圖1b:在化學(xué)位移3.5和7.2ppm處分別有個質(zhì)子峰，它是PEG和RGD分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰，根據(jù)積分面積可以求出每個K3和K4表面接了 9.2個RGD，19.2個PEG。
[0036](2) UV-Vis 測試結(jié)果
[0037]UV-Vis用于表征載體中的金納米顆粒。參見說明書附圖2:本發(fā)明中制備得到的K2和K4表面等離子體共振(SPR)峰位于510nm。這表明本發(fā)明中制備得到了金納米顆粒。
[0038](3) TEM 結(jié)果
[0039]TEM圖用于表征載體中金納米顆粒的形貌和直徑大小。參見說明書附圖3:制備的K2和K4形狀接近球形，單分散性好，平均直徑分別只有只有2.1nm和1.9nm。
[0040](4)凝膠阻滯實驗測試結(jié)果
[0041 ] 凝膠阻滯實驗用于表征載體對pDNA的包裹能力，參見說明書附圖4:K1，K2，K3，K4均可以在較低Ν/Ρ (Ν/Ρ=0.5)下與pDNA很好復(fù)合，將pDNA完全阻滯，說明這四種載體均具有很好的PDNA包裹能力。
[0042](5)粒徑和表面電勢測試結(jié)果
`[0043]粒徑和表面電勢測試用于表征載體/pDNA復(fù)合物進(jìn)細(xì)胞的能力，參見說明書附圖5:載體/pDNA復(fù)合物的大小在合適轉(zhuǎn)染的尺寸范圍內(nèi)。修飾了 RGD的K3/pDNA復(fù)合物，K4/pDNA復(fù)合物的粒徑較沒有修飾RGD的Kl/pDNA復(fù)合物，K3/pDNA復(fù)合物的粒徑小，而他們的復(fù)合物電勢則相差不大，都在適合轉(zhuǎn)染的電勢范圍內(nèi)。
[0044](6)細(xì)胞毒性試驗結(jié)果
[0045]細(xì)胞毒性試驗用于表征載體對細(xì)胞的毒性，參見說明書附圖6:隨著濃度的增大毒性不斷的上升，但即使在高濃度下(3000nM)，經(jīng)材料處理過的細(xì)胞活力都在80%以上，這表明在合適的濃度范圍內(nèi)，載體材料沒有細(xì)胞毒性，為轉(zhuǎn)染提供有利條件。相反，未經(jīng)任何修飾的氨基封端的G5.NH2 (KO)則在高濃度時具有明顯的細(xì)胞毒性。
[0046]( 7 )熒光素酶表達(dá)實驗結(jié)果
[0047]熒光素酶表達(dá)實驗用于表征載體的基因轉(zhuǎn)染能力，以帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒并以具有表達(dá)ανβ3整合素的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗四種材料對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，參見說明書附圖7:四種材料的轉(zhuǎn)染效率均與Ν/Ρ有關(guān)，在相同N/P下，載體的轉(zhuǎn)染效率為Κ4>Κ2>Κ3>Κ1，而在Ν/Ρ=2.5時，材料的轉(zhuǎn)染效率最高。表明修飾了RGD的材料比沒有修飾RGD的材料轉(zhuǎn)染效率高，而包裹了金納米顆粒的材料比沒有包裹金納米顆粒的材料轉(zhuǎn)染效率高。
[0048](8)綠色突光蛋白表達(dá)實驗結(jié)果
[0049]綠色熒光蛋白表達(dá)實驗用于表征載體的基因轉(zhuǎn)染能力，以帶有增強型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒并以具有表達(dá)ανβ3整合素的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗四種材料對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，參見說明書附圖8:對于U87MG細(xì)胞，在Ν/Ρ=2.5時，綠色熒光信號表達(dá)的強弱為K4>K2>K3>K1。這也表明修飾了 RGD的材料比沒有修飾RGD的材料基因轉(zhuǎn)染效率高，而包裹了金納米顆粒的材料比沒有包裹金納米顆粒的材料基因轉(zhuǎn)染效率高。
[0050](9)自由RGD阻斷實驗結(jié)果
[0051]自由RGD阻斷實驗用于表征載體的靶向轉(zhuǎn)染能力，以帶有cy3標(biāo)記的增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(cy3-pEGFP)并以在添加RDG-SH的培養(yǎng)基生長的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型來檢測兩種材料K3和K4對表達(dá)α ν β 3整合素被屏蔽后的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖9:對于在添加自由RGD-SH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的U87MG細(xì)胞(表達(dá)低α ν β 3整合素)，在Ν/Ρ=2.5時，復(fù)合物在U87MG細(xì)胞中的熒光強度顯著性的高于其在U87MG細(xì)胞(未經(jīng)自由RDG-SH屏蔽)中的熒光強度，這表明修飾了 RGD的材料Κ3和Κ4具有顯著的癌細(xì)胞靶向性。
[0052]有益.效果
[0053](I)本發(fā)明制備的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物具有良好的基因轉(zhuǎn)染效果，為癌癥基因治療的進(jìn)一步開發(fā)打下了基礎(chǔ)；
[0054](2)本發(fā)明制備的RGD功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物對人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有靶向作用，可用于基因的靶向輸送；
[0055](3)本發(fā)明具有易操作，轉(zhuǎn)染條件簡單，轉(zhuǎn)染效率高，特異性強等優(yōu)點，在癌癥治療等方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1為本發(fā)明制備的Kl Ca)和K3 (b)的核磁共振氫譜圖；
.[0057]圖2為本發(fā)明制備的K2 Ca)和K4 (b)的紫外吸收光譜圖；
[0058]圖3為本發(fā)明制備的K2 Ca)和K4 (b)的TEM圖和粒徑分布直方圖；
[0059]圖4為本發(fā)明制備的Kl，K2，K3，K4的凝膠阻滯實驗電泳圖譜；
[0060]圖5為本發(fā)明制備的Kl，K2，K3，K4與pDNA復(fù)合物的粒徑(a)和電勢(b)圖；
[0061]圖6為本發(fā)明制備的Kl，K2，K3，K4對U87MG細(xì)胞毒性比較圖；
[0062]圖7為本發(fā)明制備的Kl，K2，K3，K4在不同N/P下對U87MG細(xì)胞的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率比較圖；
[0063]圖8為本發(fā)明制備的Kl，K2，K3，K4在N/P=2.5時，對U87MG細(xì)胞的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的激光掃描共焦顯微鏡圖；
[0064]圖9為本發(fā)明制備的K3和K4和兩種材料在N/P=2.5時，U87MG細(xì)胞的低ανβ3整合素表達(dá)(RGD+)和高α νβ 3整合素表達(dá)(RGD-)對載體/pDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率比較圖；
[0065]圖10為功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物的制備原理示意圖。
【具體實施方式】
[0066]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。[0067]實施例1
[0068]稱取mPEG-C00H23.16mg,溶于 5mL DMSO0 稱取 4.0mg EDC 和 2.4mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG_C00H溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2) 15.06mg,溶于5mL DMSO中。將上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d。得到樣品Kl:G5.NH2-mPEG20 溶液。
[0069]在上述溶液中逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合攪拌30min，然后快速的加入27.4 μ L的10mg/mL的NaBH4溶液，反應(yīng)3h。得到樣品K2:
[0070]{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs。
[0071]稱取Nh2-PEG-COOhI L 58mg，溶于5mL DMS0。邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL DMSO溶液的干重為 1.785mg 的 6-MAL，反應(yīng) 8h，得到了 MAL-PEG-C00H 溶液。將 ImL RGD-SH 的 DMSO溶液(4mg/mL)，逐滴加入到上述的MAL-PEG-C00H溶液中，反應(yīng)12h，得到RGD-PEG-C00H溶液。稱取4.0mg EDC和2.4mg NHS，分別溶于ImL DMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加RGD-PEG-C00H溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2)15.06mg,溶于5mL DMSO中。將上述活化好的RGD-PEG-C00H溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d，得到G5.NH2-(PEG-RGD) 1(|。稱取mPEG-COOHll.58mg,溶于5mL DMSO。稱取2.0mg EDC和1.2mg NHS，分別溶于ImLDMSO中，先后將EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)3h。將上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2-(PEG-RGD)10溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d。得到樣品K3:G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液。
[0072]在上述溶液中逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合攪拌30min，然后快速的加入27.4 μ L的10mg/mL的NaBH4溶液，反應(yīng)3h。得到樣品K4:`[0073]{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 溶液。
[0074]反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物G5.NH2-mPEG2。，{(Au0) 25_G5.NH2IPEG2J DENPs，
[0075]G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析三天(2LX3，共三天)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理,得到干燥的 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2_mPEG2。} DENPs (K2)，
[0076]G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs(K4)。
[0077]1HNMR表征結(jié)果如說明書附圖1所示，圖a:在化學(xué)位移3.5ppm處有個質(zhì)子峰，它是PEG分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰，根據(jù)積分面積可以求出每個Kl和K2表面連接了 19.9個PEG分子；圖b:在化學(xué)位移3.5和7.2ppm處分別有個質(zhì)子峰，它是PEG和RGD分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰，根據(jù)積分面積可以求出每個K3和K4表面接了 9.2個RGD，19.2個PEG。UV-vis 結(jié)果如說明書附圖 2 所示，{(Au°)25-G5.NH2-mPEG2Q}DENPs(K2)和{(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)表面等離子體共振(SPR)峰位于520nm，這表明本發(fā)明中制備得到了金納米顆粒。TEM結(jié)果如說明書附圖3所示，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20}DENPs (K2)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)的形狀接近球形并且單分散性較好，平均直徑分別在2.1nm和1.9nm。
[0078]實施例2[0079]根據(jù)實施例1 的方法制備的 G5.NH2-mPEG2Q (Kl)，{(Au°)25_G5.NH2IPEG2JDENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)與pDNA形成復(fù)合物，并進(jìn)行凝膠阻滯實驗。配制8孔含有溴化乙錠(lmg/mL)的瓊脂糖凝膠(1.0%w/v),室溫放置待瓊脂糖凝膠凝固。按照不同N/P比0.125，0.25,0.5,1,2,5, pDNA量為14 8/孔，配制載體如0嫩復(fù)合物，孵育30111，并以裸？0嫩為對照。然后將對應(yīng)的載體/pDNA復(fù)合物分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，電壓80V，時間30min。使用凝膠成像儀對PDNA在凝膠中的遷移進(jìn)行分析。結(jié)果如說明書附圖4所示。結(jié)果表明，G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)均可以在較低 Ν/Ρ (Ν/Ρ=0.5)下與 DNA 很好復(fù)合，將DNA阻滯。
[0080]實施例3
[0081]根據(jù)實施例1 的方法制備的 G5.NH2-mPEG2。(Kl)，{(Au°)25_G5.NH2IPEG2JDENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)分別與5yg pDNA (N/P=l，2.5，5)復(fù)合后，終體積固定在100 μ L，室溫下孵育，室溫下孵育20min，然然后加入ImL的PBS。采用馬爾文激光粒度儀(Malvern，MK,633nm激光)對其粒徑和表面電勢進(jìn)行了表征，結(jié)果如說明書附圖5所示。結(jié)果表明，隨著N/P的增加，復(fù)合物的尺寸呈現(xiàn)減小的趨勢。相同N/P(l:l，2.5:1，5:1)下，G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10} DENPs (K4) /pDNA復(fù)合物尺寸分別較 G5.NH2-mPEG20 (Kl)和{(Au°)25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2) /pDNA 復(fù)合物的尺寸更小。表明 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)的壓縮能力分別比 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)更強，即壓縮能力Κ3>Κ1，Κ4>Κ2。說明RGD的修飾有利于納米載體對pDNA負(fù)載。另外，Zeta電勢測試結(jié)果表明，四種載體的電勢都在15mV以下，這非常有利于復(fù)合物與細(xì)胞間進(jìn)行靜電相互作用，易于細(xì)胞吸附和內(nèi)吞，也就有利于載體對目的基因的傳遞。
[0082]實施例4
[0083]以具有α ν β 3整合素表達(dá)的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗實施例1制備的材料的細(xì)胞毒性。以8χ103/孔的密度將U87MG細(xì)胞種于96孔板中，培養(yǎng)于含有10%FBS的100 μ L MEM培養(yǎng)液中，37 °C，5% 二氧化碳濃度下培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)基換成濃度分別為 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的含 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25_G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)的細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，隨后加入20 μ LMTT(5.0mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。去除孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L DMS0，搖床振蕩30min，用多功能酶標(biāo)儀測試吸光值，測試波長570nm，參比波長630nm。結(jié)果如說明書附圖6所示。結(jié)果表明，四種材料的毒性都比G5.NH2的毒性低。隨著材料濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，但在高濃度下，四種材料的細(xì)胞毒性為G5.NH2-mPEG20 (Kl)>{ (Au0)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs (K2) >G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3) > {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs(K4)。
[0084]實施例5
[0085]以具有α v β 3整合素表達(dá)的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗實施例1制備的材料作為載體對癌細(xì)胞的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。以5xl04/孔的密度將U87MG細(xì)胞種于24孔板中，培養(yǎng)于含有10%FBS的500 μ L MEM培養(yǎng)液中，37 V，5% 二氧化碳濃度下培養(yǎng)24h。隨后將培養(yǎng)基換成不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液中，加入一定濃度的G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) /pDNA 復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng) 4h。然后更換含10%FBS的新鮮MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。將細(xì)胞裂解，并通過Promega公司的luciferase assay來檢測熒光素酶活性，結(jié)果見說明書附圖7。測試結(jié)果顯示:四種材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P有關(guān)，在N/P=2.5時，材料的轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率為{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) > {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2) >G5.NH2-(PEG-RGD) 1(l-mPEG1(l (K3) >G5.NH2-mPEG2(l (Kl)；且在 Ν/Ρ=2.5 時，與 G5.NH2 (KO)相比較，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)三者都具有顯著性差異，這說明RGD修飾的材料對癌細(xì)胞具有特異性的靶向效果，而包裹了金納米顆粒的材料使細(xì)胞對復(fù)合物攝入的更多。
[0086]實施例6
[0087]以帶有增強型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒并以具有ανβ3整合素表達(dá)的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗材料作為載體對癌細(xì)胞的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。復(fù)合物的制備方法如實施例5所示。目的基因用的是增強型綠色熒光蛋白基因。在轉(zhuǎn)染24h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見說明書附圖8。通過前面的熒光素酶基因表達(dá)實驗，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效果最佳的N/P比為2.5，因此，我們選取了這個N/P比進(jìn)行了綠色熒光蛋白表達(dá)實驗的比較。從圖中我們也可以看出，對于U87MG 細(xì)胞，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10} DENPs (K4)和{(Au0) 25_G5.NH2_mPEG20}DENPs (K2)可以更好地將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞具有較強的綠色熒光信號表達(dá)；而G5.NH2- (PEG-RGD) 10 -mPEG10 (K3)和 G5.NH2-mPEG20 (Kl)對 EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率較低，細(xì)胞的綠色熒光信號較弱。這個結(jié)果和熒光素酶基因表達(dá)實驗保持高度一致。
[0088]實施例7
[0089]以帶有cy3標(biāo)記的增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(Cy3_pEGFP)并以在添加RDG-SH的培養(yǎng)基生長的人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞為模型來檢測兩種材料 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)對RGD受體被屏蔽后的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。將自由RGD-SH (5 μ Μ)加到含有U87MG細(xì)胞的培養(yǎng)液中，作用0.5-lh，再加入一定濃度的G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) /cy3_pEGFP 復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng) 4h，隨后通過流式細(xì)胞儀檢測復(fù)合物的熒光強度，結(jié)果見說明書附圖9。測試結(jié)果顯示:在N/P=2.5時，復(fù)合物在U87MG細(xì)胞的低表達(dá)ανβ3整合素(RGD+)的熒光強度顯著性的低于其在U87MG細(xì)胞的高表達(dá)ανβ3整合素(RGD-)的熒光強度，這表明修飾了 RGD的材料G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)具有顯著的靶向特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，包括: (O分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液、N-羥基琥珀酰亞胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)2_4h，得到活化的mPEG-COOH ;然后將活化的mPEG-COOH加入到第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12-30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2-mPEG20 ;其中EDC和NHS與mPEG-COOH的摩爾比為1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1 ; (2)將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2-mPEG20加入到氯金酸HAuCl4.4H20溶液中，攪拌反應(yīng)20-30min，再加入硼氫化鈉NaBH4溶液，攪拌2_4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs ;其中HAuCl4.4H20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4.4H20的摩爾比為5:1; (3)將端基分別為氨基和羧基的聚乙二醇NH2-PEg-COOH溶液加入到6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯6-MAL溶液中，攪拌反應(yīng)6-8h，得到MAL-PEG-C00H溶液；然后加入巰基端環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽RGD-SH溶液，攪拌反應(yīng)10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液；然后再分別加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD-PEG-C00H ;然后將活化的RGD-P EG-C00H加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，反應(yīng)12_30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10 ;然后按步驟(I)中的過程，得到活化的mPEG-COOH，加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10中，反應(yīng)12_30h，得到功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 ;其中 NH2-PEG-C00H、6_MAL、RGD-SH 的摩爾比為 1:1:1，EDC 和 NHS 與 RGD-PEG-C00H 的摩爾比為 1.8:1，EDC 和 NHS 與 mPEG-COOH 的摩爾比為 1.8:1，mPEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為20:1 ; (4 )將上述功能化聚酰胺-胺樹狀大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10中加入HAuCl4.4Η20溶液攪拌15-30min，再加入NaBH4溶液，攪拌2_4h，得到包裹納米金顆粒的功能化聚酰胺胺樹狀大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs ;其中 HAuCl4.4Η20與樹狀大分子的摩爾比為25:1，NaBH4與HAuCl4.4Η20的摩爾比為5:1; (5)將步驟(I)(2) (3) (4)所得的溶液進(jìn)行透析、冷凍干燥處理，得到干燥的G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs, G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs ;分別將 G5.NH2, G5.NH2_mPEG20，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20}DENPs，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 給它們命名為 Κ0, ΚΙ, Κ2, Κ3, Κ4 ； (6)按照相應(yīng)的Ν/Ρ比，取Κ1，Κ2，Κ3，Κ4用無菌水稀釋，并用無菌水稀釋質(zhì)粒，然后混合均勻，37°C孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA ;其中N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比，數(shù)值范圍為1:1-5 ； (7)將U87MG細(xì)胞種于24孔板上，于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換成無血清的培養(yǎng)基，加入步驟(6)所得的功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物/pDNA,混合均勻，在培養(yǎng)箱中孵育4h，然后將培養(yǎng)基換成有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測基因轉(zhuǎn)染效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(I)中mPEG-COOH溶液的濃度為11.6mmol/mL，EDC和NHS溶液的濃度為20.88mmol/mL,第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL，溶液溶劑均為二甲基亞砜DMSO。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(2)中HAuCl4水溶液濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為 lOmg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(3)中NH2-PEg-COOH溶液、6-MAL溶液、RGD-SH溶液、mPEG-COOH溶液的濃度均為5.8mmol/mL, EDC和NHS溶液的濃度為10.44mmol/mL,第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0.58mmol/mL，溶劑均為DMS0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(4)中HAuCl4.4Η20溶液的濃度為30mg/mL，NaBH4溶液的濃度為10mg/mL，溶劑均為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(5)中透析為透析袋截留分子量為14000，用去離子水透析2-3d，每天3次，每次2L去離子水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(6)中質(zhì)粒為帶有熒光素酶基因的質(zhì)?；驇в性鰪姷木G色熒光蛋白EGFP基因的質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(7)中無血清的培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)液；有血清的培養(yǎng)基為10%FBS的MEM培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述 的一種功能化聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米復(fù)合物用于基因轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述步驟(7)中轉(zhuǎn)染后表達(dá)時間為24-48h。
【文檔編號】A61K47/34GK103435815SQ201310291576
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】史向陽, 孔令丹 申請人:東華大學(xué)