專(zhuān)利名稱：環(huán)孢素a和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
環(huán)孢素即環(huán)孢菌素(Cyclosporine),臨床常用的環(huán)孢素A (CyclosporinA, CsA)是由11個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀多肽化合物，為第三代免疫抑制劑，是目前臨床上應(yīng)用于抗器官移植排斥反應(yīng)最為有效的藥物。然而全身應(yīng)用環(huán)孢素制劑生物利用度低且易導(dǎo)致全身免疫力降低，還可以引起嚴(yán)重毒副作用，如高血壓、肝腎毒性、中樞神經(jīng)毒性、淋巴瘤等，故而采用局部應(yīng)用方法直接針對(duì)病灶作用，既減少藥物用量又降低毒副作用。眼部應(yīng)用環(huán)孢素A現(xiàn)已成為治療干眼癥、結(jié)膜炎、降低角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性眼病的重要方法，目前臨床最常使用的是環(huán)孢菌素A滴眼液，其溶劑是蓖麻油或豆油。但由于CsA水溶性差、分子量大，同時(shí)油劑對(duì)眼部具有刺激性，患者順應(yīng)性及藥物生物利用度不高。從另一方面來(lái)看，溶液型滴眼劑同樣由于眼部保護(hù)機(jī)制藥物滯留時(shí)間短，用藥后藥物脈沖式進(jìn)入易形成藥物濃度峰谷現(xiàn)象，眼角膜特殊致密結(jié)構(gòu)限制藥物透過(guò)，以及藥液經(jīng)鼻淚管引流吸收易引起全身不良反應(yīng)等原因使得滴眼液眼部生物利用度低，易引起眼部及全身不良反應(yīng)。目前具有高度親水性及良好組織相容性的納米凝膠(insitu nanogel)，由于制備簡(jiǎn)單、使用方便、可熱壓滅菌，且最重要的是與眼部親和力強(qiáng)、可以增加眼部滯留時(shí)間且減少藥物溢出損失故而提高生物利用度，減少不良反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)而成為眼用制劑研究新方向。CN101244256A、CN101181227A和CN101085341A陸續(xù)公開(kāi)了微/亞微乳原位凝膠、生物粘附性固體脂質(zhì)納米粒原位凝膠和眼植入凝膠的組方。聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)是目前研究較多的溫敏水凝膠，在其最低臨界溶解溫度LCST (約32 34°C )附近能發(fā)生可逆的體積相變。PNIPAAm分子內(nèi)同時(shí)具有親水性的酰胺基和疏水性的異丙基，它們與水存在分子內(nèi)或分子間的相互作用。PNIPAAm的羰基及亞胺基與周?chē)乃肿有纬蓺滏I，并與疏水基團(tuán)的疏水作用形成相對(duì)平衡。低溫時(shí)氫鍵起主要作用，表現(xiàn)為PNIPAAm能溶于水；隨著溫度的升高，部分氫鍵破壞，PNIPAAm分子內(nèi)及大分子間的疏水作用加強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到PNIPAAm的LCST約為32°C之上時(shí)，由溶解狀態(tài)的線團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)樘莸那蛐?，?dǎo)致聚合物析出，溶液變成兩相，反之亦然。把PNIPAAm作藥物載體用于藥物釋放時(shí)，它能夠響應(yīng)環(huán)境溫度的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控制釋放。目前，已有諸多有關(guān)PNIPAAm水凝膠用于藥物的溫控釋放報(bào)道。眼用溫度敏感型原位凝膠以水溶液的形式眼部局部用藥，在眼部通過(guò)離子交聯(lián)，溫度誘導(dǎo)因獨(dú)特的溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變成為親水性三維網(wǎng)狀凝膠，緩慢控制藥物釋放，既節(jié)約成本、保證療效，又減少了相關(guān)毒副作用。目前尚沒(méi)有將環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物制備成眼用制劑的報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物。通過(guò)將羧基引入，將溫度敏感的聚N異丙基丙烯酰胺接枝到透明質(zhì)酸上。該組合物可克服現(xiàn)有環(huán)孢素A制劑存在生物利用度低、嚴(yán)重毒副作用等不足，可制備載藥量高、毒副作用小、穩(wěn)定性好、生物相容性好、儲(chǔ)藏運(yùn)輸制備方便的環(huán)孢素A眼用制劑。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述組合物的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明提供一種環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物HA-g-PNIPAAm的組合物，該組合物由活性成分環(huán)孢素A與兩親性透明質(zhì)酸組成。上述藥物組合物，按所述組合物總重計(jì):環(huán)孢素 A 為 30-45wt %，HA-g-PNIPAAm 為 55_70wt% ；所述的環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物制備方法，包括以下步驟: 將上述HA溶于適當(dāng)溶劑，采用己二酸二酰肼為連接臂，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(EDC)為活化劑進(jìn)行反應(yīng)，得到胺化的透明質(zhì)酸(AHA)，合成路線見(jiàn)圖1。將上述單體N-異丙基丙烯酰胺溶于適當(dāng)溶劑，采用偶氮二異丁腈為催化齊U，3-巰基丙酸為羧基引入劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm-COOH)，合成路線見(jiàn)圖2。將上述的胺化的透明質(zhì)酸和末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺，孵育，混合攪拌24h，得到產(chǎn)物(HA-g-PNIPAAm)，合成路線見(jiàn)圖3。所述的藥物組合物HA-g-PNIPAAm具有兩親性、溫敏性。所述的藥物組合物中透明質(zhì)酸衍生物，透明質(zhì)酸骨架分子量為I X IO4 1X106，胺基與透明質(zhì)酸的羧基形成酰胺鍵，總?cè)〈?6 120%，聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)末端羧基取代于透明質(zhì)酸中間體(AHA)氨基，總?cè)〈菼 59%。所述的環(huán)孢素A與HA-g-PNIPAAm組合物的制備步驟如下:HA-g-PNIPAAm溶于水中，將環(huán)孢素A用藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑溶解后，加入上述溶液中，經(jīng)探頭超聲處理后，透析或蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，以微孔濾膜過(guò)濾，即得組合物。所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于可接受的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。本發(fā)明的有益效果:我們制備所得的環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物中使用了交聯(lián)透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸可保濕和潤(rùn)滑房水濾過(guò)通道及玻璃體等，減少眼內(nèi)體液與組織間的摩擦，保證體液流通、藥物順利進(jìn)入體內(nèi)。與PNIPAAm形成HA-g-PNIPAAm納米凝膠，因分子量和分子體積增大，形成的連續(xù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在水中可溶脹但不再溶解，機(jī)械強(qiáng)度明顯提高，在組織中相對(duì)不易被降解和擴(kuò)散，體內(nèi)存留時(shí)間較長(zhǎng)，有更好的凝膠的物理支撐和阻隔作用，同時(shí)交聯(lián)透明質(zhì)酸具有良好的生物相容性，在體內(nèi)降解產(chǎn)物為機(jī)體固有成分，并不會(huì)改變機(jī)體局部的生理環(huán)境，安全性高，刺激性小。
本發(fā)明與現(xiàn)有環(huán)孢素A制劑相比，具有“高載藥量、高安全性、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單”等優(yōu)點(diǎn)。具體表現(xiàn)在:(I)該藥物組合物載藥效率高達(dá)73.92%，電鏡下顯示納米粒子是規(guī)整的圓球形。(2)該組合物不含蓖麻油、大豆油，具有更好的生物相容性，不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，刺激性小，顯著改善了患者的臨床順應(yīng)性。(3)該組合物可通超聲等作用力制備而成，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。(4)該組合物以凍干粉末形式保存，能夠解決載藥納米粒溶液由于聚集使粒徑增大以及貯存和運(yùn)輸穩(wěn)定性等問(wèn)題。


:圖1:透明質(zhì)酸中間體的合成路線。圖2:末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺的合成路線。圖3:兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的合成路線。圖4:兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的粒徑圖譜。圖5:環(huán)孢素A的體外釋放。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1制備兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)a.制備透明質(zhì)酸中間體AHA精密稱取透明質(zhì)酸HAlOOmg，加入200ml的蒸餾水使HA充分溶解。然后將己二酸二酰肼ADH1.736g加入上述溶液，充分混勻攪拌20分鐘，用0.1mol HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.8。再加20ml乙醇，攪拌30分鐘。加入EDC.HC10.191g，用0.1mol HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，使反應(yīng)PH保持在4.8。2h后反應(yīng)結(jié)束，用0.1mol NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入預(yù)先洗好的透析袋中(截留分子量7KDa)。采用0.1mol NaCl為透析液，透析24h后，采用去離子水為透析液，透析24h后離心15min, 3500rpmo取上層液,過(guò)0.45 μ m微孔濾膜,預(yù)凍24h后_50°C凍干36h，得產(chǎn)物透明質(zhì)酸中間體AHA。b.制備末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH三頸瓶中加入Ig N-異丙基丙烯酰胺單體、0.02g偶氮二異丁腈，緩慢加入30ml乙醇，溶解后加入50 μ L3-巰基丙酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至70°C，繼續(xù)通氮?dú)獠⒉粩鄶嚢琛?4h后反應(yīng)結(jié)束，蒸去溶劑，混合物用丙酮溶解，然后逐滴滴加進(jìn)大量的正己烷中沉淀，過(guò)濾后得產(chǎn)物，40°C真空干燥，制得PNIPAAm-COOH。c.制備兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)將0.1Og透明質(zhì)酸中間體AHA溶解于40ml水中；取末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH0.1Og溶解于去離子水中，再向溶液中加入0.1Og EDC.HC1，4°C下孵育48h。將兩種溶液充分混合均勻，調(diào)節(jié)pH為5.6，混合液在室溫下攪拌24h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入預(yù)先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去離子水透析3天，預(yù)凍后凍干36h，得兩親性透明質(zhì)酸衍生物HA-g-PNIPAAm的凍干品。實(shí)施例2制備環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)采取透析法載藥，藥物為環(huán)孢素CsA。稱取HA-g-PNIPAAm20mg，加雙蒸水2ml，室溫下充分溶脹30min。將6mg環(huán)孢素A溶于藥學(xué)上可接受有機(jī)溶劑后滴加入上述溶液中，通過(guò)探頭超聲30min,藥物與HA-g-PNIPAAm形成納米凝膠。將上述納米凝膠轉(zhuǎn)入預(yù)先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去離子水透析I天，預(yù)凍24h后凍干36h，制得環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物凍干品。上述制備方法中，溶解環(huán)孢素A的可接受的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇 、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚，優(yōu)選乙醇。實(shí)施例3兩親性透明質(zhì)酸衍生物取代度表征
將0.1Og透明質(zhì)酸中間體AHA溶解于40ml水中；分別取末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH0.1Og, 0.20g, 0.30g溶解于去離子水中，再向溶液中加入
0.1OgEDC.HC1，4°C下孵育48h。將兩種溶液充分混合均勻，調(diào)節(jié)pH為5.6，混合液在室溫下攪拌24h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入預(yù)先洗好的透析袋中(截留分子量3500Da)，采用去離子水透析3天，預(yù)凍24h后凍干36h，得兩親性透明質(zhì)酸衍生物HA-g-PNIPAAm的凍干品，_4°C冷藏備用。以公式⑴計(jì)算樣品的取代度(DS)，W為質(zhì)量，麗為分子量，結(jié)果見(jiàn)表I。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)孢素A藥物組合物，其特征在于它是由活性成分環(huán)孢素A與兩親性透明質(zhì)酸衍生物 HA-g-PNIPAAm 所制成的制劑:環(huán)孢素 A 為 5_40wt%，HA-g-PNIPAAm 為 60_95wt%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)孢素A藥物組合物，其特征在于，活性成分環(huán)孢素A與HA-g-PNIPAAm微凝膠通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，按所述組合物總重計(jì):環(huán)孢素A為10_35wt%,HA-g-PNIPAAm 微凝膠為 65_90wt%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)孢素A藥物組合物，其特征在于所述的透明質(zhì)酸衍生物HA-g-PNIPAAm由下列方法制備得到: a.制備透明質(zhì)酸中間體AHA: 將所述透明質(zhì)酸HA溶于適當(dāng)溶劑，采用己二酸二酰肼為連接臂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(EDC)為活化劑進(jìn)行反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸中間體AHA; b.制備末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH: 將所述單體N-異丙基丙烯酰胺溶于適當(dāng)溶劑，采用偶氮二異丁腈為催化劑，3-巰基丙酸為羧基引入劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺PNIPAAm-COOH ； c.兩親性透明質(zhì)酸衍生物(HA-g-PNIPAAm)的制備方法: 將步驟b所得的末端帶羧基的聚N異丙基丙烯酰胺孵育，與步驟a所得透明質(zhì)酸中間體混合，攪拌24h，得到產(chǎn)物HA-g-PNIPAAm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述HA-g-PNIPAAm具有兩親性、溫敏性；步驟a中適當(dāng)溶劑為去離子水，步驟b中適當(dāng)溶劑為乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述兩親性透明質(zhì)酸衍生物，透明質(zhì)酸骨架分子量為1X 104 1X 106,胺基與透明質(zhì)酸的羧基形成酰胺鍵，總?cè)〈?6 120%，聚N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)末端羧基取代于透明質(zhì)酸中間體(AHA)氨基，總?cè)〈菼 59%。
6.一種制備如權(quán)利要求1所述的環(huán)孢素A與HA-g-PNIPAAm組合物的方法，其制備步驟如下: HA-g-PNIPAAm溶于水中，將環(huán)孢素A用藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑溶解后，加入上述溶液中，經(jīng)探頭超聲處理后，透析或蒸發(fā)法除去有機(jī)溶劑，以微孔濾膜過(guò)濾，即得組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于可接受的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于可接受的有機(jī)溶劑為乙醇。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物的組合物及其制備方法。該組合物是環(huán)孢素A和兩親性透明質(zhì)酸衍生物。該組合物具有載藥量高、穩(wěn)定性好、生物相容性好的特點(diǎn)，并可克服環(huán)孢素眼用制劑的生物利用度較低、毒副作用嚴(yán)重等不足。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、使用方便。
文檔編號(hào)A61K47/36GK103191411SQ20131015355
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者周建平, 姚靜, 武毅君 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)