專利名稱：Mta1來(lái)源的抗腫瘤ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽，尤其是涉及MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，本發(fā)明還涉及該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多種原因及其產(chǎn)物的復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，侵入淋巴管、血管及周?chē)M織，誘導(dǎo)血管形成，逃避宿主細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)和在轉(zhuǎn)移部位生長(zhǎng)。因此，了解腫瘤轉(zhuǎn)移所涉及的基因和基因產(chǎn)物是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱題。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白I(MTAl)是1994年Toh等人在人的乳腺癌細(xì)胞中鑒定發(fā)現(xiàn)的。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)它在多種轉(zhuǎn)移性腫瘤中過(guò)表達(dá)，如乳腺癌、胃腸癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，并且其在腫瘤組織中的表達(dá)水平與其轉(zhuǎn)移或浸潤(rùn)潛能有明顯的關(guān)系。這些研究結(jié)果表明MTAl是一個(gè)非常好的腫瘤相關(guān)抗原，是腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。近年來(lái)大多數(shù)研究者將目光集中在MTA家族成員尤其是MTAl在多種人類腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況、分子功能等方面，Li Kai等人在MTAl的抗前列腺癌血管生成方面取得了一定的研究成果。目前尚未見(jiàn)針對(duì)MTAl的HLA-1類限制性CTL表位肽的報(bào)道。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)在腫瘤中發(fā)揮的重要作用越來(lái)越受到重視。如何有效激發(fā)CTL介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤效能，已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤治療性多肽疫苗研制領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。既往研究發(fā)現(xiàn)，引起CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)的，并非完整的腫瘤抗原分子，而是抗原來(lái)源的特異性CTL表位(Epitope)?？乖f呈細(xì)胞攝取腫瘤抗原后,通過(guò)蛋白水解作用將其加工成為8 10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段，即CTL表位，進(jìn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的主要組織相容性復(fù)合體I (MHC-1)類分子結(jié)合形成多肽-MHC復(fù)合物(P印tide-MHC complex, pMHC)，并最終將pMHC遞呈到細(xì)胞表面供CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell rec印tor，TCR)識(shí)別，從而活化CTL細(xì)胞，引發(fā)CTL免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)腫瘤細(xì)胞SW620具有一定殺傷力的MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，同時(shí)本發(fā)明還提供了該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser-Leu 分子量為 1019.51。本發(fā)明還包括上述肽在制備高表達(dá)該抗原的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法初步鑒定出腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原的表位肽。鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原MTAl的腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、多表位疫苗等的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。


圖1-5是本發(fā)明表位肽的質(zhì)譜分析圖。圖6是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞SW620 (MTAl-陽(yáng)性，HLA-A2陽(yáng)性)的殺傷作用。圖7-11是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-Y的能力。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述·的MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為
P22:Tyr-Leu-1Ie-Arg-Arg-1Ie-Glu-Glu-Leu或 P57:Ala-Leu-Ala-Asp-Lys-His-Ala-Thr-Leu或 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser_Leu或 P129:Thr-Leu-Leu-Asn-Glu-Thr-Glu-Ser_Leu或 P173:Tyr-Gln-Ala-Asp-1le-Thr-Asp-Leu_Leu0本發(fā)明主要采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITH1、BIMAS、NetCTL 1.2和IEDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MTAl蛋白抗原的HLA_A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。篩選獲得上述表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。各肽質(zhì)譜鑒定圖見(jiàn)圖1-5。上述表位肽的合成及制備:采用固相合成法?；玖鞒倘缦?首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹(shù)脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參見(jiàn):①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.賈庫(kù)布克著，劉克良等譯，肽:化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年)
本發(fā)明表位肽的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè):抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細(xì)胞介素2(IL-2，P^rotech公司)和人β 2微球蛋白誘導(dǎo)分化CTL細(xì)胞，進(jìn)一步在體外LDH和ELISP0T實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下:
UPBMCs的分離與誘導(dǎo):(1)以40ml PBSCPH 7.2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ；(2)離心管中加入4ml Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司);(3)加8ml步驟(I)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4)20°C離心(2000rmpX20min); (5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs) ;(6)吸出的白膜層用PBS (pH 7.2)離心洗滌兩次；(7)用24孔板鋪板，細(xì)胞的濃度為I X 10 6/ml，每孔Iml ;
(8)第二天每孔加入3 UgAP2微球蛋白和10 μ g表位肽，同時(shí)設(shè)立PBS組(以PBS替代表位肽)作為陰性對(duì)照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液，于七天后進(jìn)行第二輪荷肽(即每孔補(bǔ)加50u IL-2U0 UgAP2微球蛋白和10 μ g表位肽/PBS)，十四天后進(jìn)行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應(yīng)細(xì)胞CTL，然后進(jìn)行LDH實(shí)驗(yàn)和ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)待測(cè)肽的作用。2、LDH 檢測(cè):使用 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Promega公司)進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒活性。步驟如下(詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)):
I)設(shè)立檢測(cè)板(100 μ I/孔)
Cl)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組:以腫瘤細(xì)胞EC-9706 (ATCC公司)作為靶細(xì)胞(最優(yōu)靶細(xì)胞數(shù):5000)按不同效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效應(yīng)細(xì)胞CTL ；
(2)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組；
(3)設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組；
(4)設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組；
(5)設(shè)立體積校正對(duì)照組；
(6)設(shè)立背景對(duì)照組。2)細(xì)胞裂解及收獲上清
(1)37 °C、5%C02 孵育檢測(cè)板(5h );
(2)靶細(xì)胞最大釋放組和體積校正對(duì)照組中加入裂解液，每100μ I培養(yǎng)基中加入10 μ I裂解液(10Χ)，收獲上清前45min加入裂解液；
(3)250g離心4min,收獲上清。3) LDH 檢測(cè)
(1)轉(zhuǎn)移50μ I上清至另一孔板；
(2)50μI/孔迅速添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30min ；
(3)添加50μ I終止溶液;
(4)將孔中含有的氣泡去除，一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)490nm吸收值0D。細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式如下:
殺傷率(％) =[ (0D實(shí)驗(yàn)組-OD效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組-ODk細(xì)胞自發(fā)釋放組)/( ODft細(xì)胞最大釋放組-ODk細(xì)胞自發(fā)釋
M)] X 100%
(注:所有實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組的吸收值均應(yīng)減去背景平均吸收值；靶細(xì)胞最大釋放組吸收值應(yīng)減去體積校正對(duì)照組的平均吸收值) 結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖6可知，表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞SW620(HLA-A*0201-陽(yáng)性，MTAl-陽(yáng)性)均顯示出一定的殺傷率。3、ELISPOT實(shí)驗(yàn):具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:(1)封閉:取出所需板條，用含5% FCS RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)基封閉，200 μ L /孔，室溫下(25°C)靜置5 10 min后將其扣出(FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng))；(2)細(xì)胞上板:誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞(I X IO5/孔)，荷肽的T2A2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(I X IO5/孔)鋪板。100 μ L/孔。細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(加入細(xì)胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板)；.正對(duì)照:細(xì)胞濃度為I X IO5/孔、加入10 μ L ΡΗΑ，該濃度能有效刺激IFN-Y的分泌；.背景負(fù)對(duì)照:加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基；(3)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入CO2培養(yǎng)箱，37 °C培養(yǎng)18h ； (4)裂解細(xì)胞:傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，200 μ L/孔加入冰冷的去離子水，4 1:冰浴反應(yīng)10 min(低滲法裂解細(xì)胞)；(5)洗滌:傾倒孔內(nèi)的液體，IX的Washing Buff er，200 μ L/孔，洗滌5 7次，每次停留30 60 S，最后一次，在吸水紙上扣干；(6)加入檢測(cè)抗體孵育:每孔加入100 μ L稀釋好的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，37°C孵育Ih ; (7)洗滌:傾倒孔內(nèi)的液體，I X的Washing Buffer, 200 μ L/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為3(T60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(8)酶聯(lián)親和素孵育:將稀釋好的酶聯(lián)親和素工作液加入到實(shí)驗(yàn)孔，100 μ L/孔，37 °C孵育Ih; (9)洗滌:傾倒孔內(nèi)的液體，IX的Washing Buffer，200uL/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為30 60 S，最后一次，在吸水紙上扣干；(10)顯色:解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 UL的顯色液，室溫靜置15-45min (在20 -25° C，顯色25min較合適)，注意避光；(11)終止顯色:傾倒孔內(nèi)液體，揭開(kāi)板底座，以去離子水洗滌3飛遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干；用ELISPOT圖象分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔形成的斑點(diǎn)數(shù)。體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:候選肽P22、P57、P109、P129、P173均能夠在6名健康供者的外周血中誘導(dǎo)獲得CTL，且獲得的CTL經(jīng)刺激后分泌較高量的IFN-Y (如圖7-11)。本發(fā)明鑒定出的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原的表位肽為研制基于抗原MTAl的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、多表位疫苗等的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。`
權(quán)利要求
1.一種MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，其特征在于:所述九肽的氨基酸序列為 P109:Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser-Leu。
2.權(quán)利要求1所述的MTAl來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽在制備高表達(dá)該抗原的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種MTA1來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，包括九肽，所述九肽的氨基酸序列為P109Phe-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Ser-Leu。本發(fā)明還包括上述肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法初步鑒定出腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原的表位肽。鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原MTA1的腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、多表位疫苗等的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103145801SQ20131011295
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者祁元明, 吳亞紅, 高艷鋒, 陳飛, 孫萌, 韓艷林, 時(shí)冉冉, 陳艷平 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)