一種靶向eps8與egfr結(jié)合的短肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽及其應(yīng)用，所述短肽的序列為：N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-C’。所述短肽能夠有效抑制EPS8陽性腫瘤的增殖，能夠用于制備治療EPS8陽性腫瘤的藥物，具有開發(fā)為抗腫瘤肽類藥物的巨大潛力。
【專利說明】—種靶向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物化學(xué)、多肽生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種靶向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體通路底物8 (Epidermal Growth Factor Receptor pathwaysubstrate N0.8, EPS8)是多種受體型和非受體型酪氨酸激酶的磷酸化底物，由Fazioli等在對小鼠纖維母細(xì)胞NIH3T3表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)通路的研究中首次發(fā)現(xiàn)。近年研究顯示，EPS8在多種實體瘤(如宮頸癌、結(jié)直腸癌、垂體瘤、口腔鱗癌、胰腺導(dǎo)管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌及惡性膠質(zhì)瘤等)及血液系統(tǒng)腫瘤(如多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等)的組織及細(xì)胞中表達(dá)異常升高，而在正常組織表達(dá)很低或無表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示，EPS8通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過參與細(xì)胞偽足的形成及與肌動蛋白的相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通過影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性與患者的預(yù)后相關(guān)(Li Y*, Xue T, He Y, Du J.Noveloncoprotein EPS8: a new target for anticancer therapy [J].Future Oncology, 20130ct ；9(10): 1587-94.)。因此,EPS8已成為為腫瘤監(jiān)測與治療的新祀點，為腫瘤祀向治療開辟新的道路。 [0003]作用于EGFR不同結(jié)構(gòu)域的抑制劑，如作用于胞外區(qū)的Herceptin(赫賽汀，曲妥珠單抗)和作用于激酶區(qū)的GefitiniM易瑞沙，吉非替尼)，其臨床應(yīng)用雖然取得了令人鼓舞的療效，但普遍存在特異性差、易耐藥、副作用差等缺點，研發(fā)更為安全有效、特異性強的抗腫瘤藥物是臨床上的迫切需求。然而，有別于其他生長因子受體，EGFR的近膜區(qū)扮演著“激活”而非“自我抑制”激酶區(qū)的作用(Jura N et al.Mechanism foractivation of the EGF receptor catalytic domain by thejuxtamembrane segment[J].Cell, 2009，137 (7): 1293-1307.)，作用于近膜區(qū)的抑制劑特異性強、選擇性好，這為研制惡性腫瘤疾病提供新的藥物治療靶向。肽類抑制劑相對上述小分子抑制劑來講，具有活性高、用藥劑量小、毒副作用低、代謝終產(chǎn)物為氨基酸等多種優(yōu)點，成為近年來腫瘤靶向治療研究執(zhí)占。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種靶向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽及其應(yīng)用。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種祀向 EPS8 與 EGFR 結(jié)合的短妝，其序列為:N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-Cj。
[0007]優(yōu)選地，所述短肽的C’末端賴氨酸的羧基被酰胺化，即其序列為N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-NH2-C?。
[0008]優(yōu)選地，所述短肽阻斷體內(nèi)EPS8與其受體的相互作用。[0009]一種用于治療EPS8陽性腫瘤的藥物，所述藥物的活性成分為上述的短肽。
[0010]優(yōu)選地，所述藥物還包含藥用輔料。
[0011]優(yōu)選地，所述藥物的制劑形式為注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。
[0012]上述的短肽在制備治療EPS8陽性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0013]所述EPS8陽性腫瘤為宮頸癌、結(jié)直腸癌、垂體瘤、口腔鱗癌、胰腺導(dǎo)管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
[0014]發(fā)明人通過計算機輔助藥物設(shè)計(Computer Aided Drug Design, CADD)技術(shù),設(shè)計出一種靶向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽，命名為P01，發(fā)現(xiàn)其完全對接于EGFR近膜區(qū)(圖1，L664-1682)。因此，發(fā)明人合成了短肽P01，通過MTS法檢測短肽POl對EPS8高表達(dá)人急性髓系白血病細(xì)胞株KGl α和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖抑制活性，并初步獲得了 KGl α細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的抑制活性曲線(圖5、6)。然后，通過對短肽POl進(jìn)行FITC標(biāo)記，利用熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察短肽POl穿膜效果，確認(rèn)其成功跨膜進(jìn)入靶細(xì)胞(圖 7、8)。
[0015]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0016](I)短肽POl能夠有效抑制EPS8陽性腫瘤的增殖，具有開發(fā)為抗腫瘤肽類藥物的巨大潛力；
[0017](2)短肽POl靶向EPS8，作用于EGFR的近膜區(qū)，特異性強、選擇性好；
[0018](3)短肽POl作為肽類抑制劑，相對于小分子抑制劑來講，具有活性高、用藥劑量小、毒副作用低、代謝終產(chǎn)物為氨基酸等多種優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明短肽POl與EGFR的分子對接的構(gòu)象示意圖。其中，箭頭A指示部分為EGFR構(gòu)象，箭頭B指示部分為本發(fā)明短肽POl構(gòu)象。
[0020]圖2為本發(fā)明短肽POl與EGFR的分子對接的三維結(jié)構(gòu)示意圖。其中，箭頭A指示部分為EGFR，箭頭B指示部分為短肽POl。
[0021 ] 圖3為本發(fā)明短肽PO I的HPLC譜圖。
[0022]圖4為本發(fā)明短肽PO I的MS譜圖。
[0023]圖5為本發(fā)明實施例2中短肽POl對EPS8高表達(dá)的人急性髓系白血病細(xì)胞株KGla細(xì)胞增殖抑制活性曲線。
[0024]圖6為本發(fā)明實施例3中短肽POl對EPS8高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖抑制活性曲線。
[0025]圖7為本發(fā)明實施例5中FITC標(biāo)記的短肽POl在熒光倒置顯微鏡下觀察穿膜效果圖。其中，(A)488nm波長處；(B)488nm波長處和白光處疊加圖像；(C)白光處。
[0026]圖8為本發(fā)明實施例6中FITC標(biāo)記的短肽POl在激光共聚焦顯微鏡下于340nm、515nm、488nm波長處觀察穿膜效果圖及疊加圖像。其中，A、B和C三組圖分別是不同視野下的圖像?！揪唧w實施方式】
[0027]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。這些實施例只是為了說明目的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中使用實驗方法、試劑等為現(xiàn)有技術(shù)，在此不
再一一贅述。
[0028]實施例1肽的合成
[0029]通過計算機輔助藥物設(shè)計(Computer Aided Drug Design, CADD)技術(shù),設(shè)計出一種靶向EPS8且與EGFR結(jié)合的短肽，命名為POl。所述POl的序列如SEQ ID NO:1所示，即其序列為 N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-C’。通過構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)，POl完全對接于EGFR近膜區(qū)(圖1和圖2，L664-1682)，符合文獻(xiàn)報道EPS8與EGFR相互作用主要由受體近膜區(qū)的6個酸性Glu和配體首尾堿性Arg、Lys、His間的靜電作用介導(dǎo)(FazioliFet al.Eps8，a substrate for the epidermal growth factor receptor kinase, enhancesEGF-dependent mitogenic signals [J].EMBO J，1993，12 (10): 3799-3808.)。
[0030]短肽POl委托中肽生化有限公司采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案進(jìn)行合成，并酰胺化羧基端以保護(hù) Lys,酸胺化后的序列為 N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys-NH2-C’。采用反相高效液相色譜(HPLC)法對短肽POl進(jìn)行純化和純度分析，質(zhì)譜(MS)法對短肽POl進(jìn)行鑒定和分子量測定。由圖3中的HPLC譜圖可知，短肽POl純度為98.9% ;由圖4中的MS譜圖可知，短肽POl分子量為2858.5，與理論值相符。
[0031]所得短肽POl用二甲基亞砜(DMSO)溶解制成儲備液，置溫度_70°C保存，使用前用磷酸鹽緩沖液(PBS) 稀釋。
[0032]實施例2短肽POl對EPS8高表達(dá)的人急性髓系白血病細(xì)胞株KGl α細(xì)胞增殖抑制活性
[0033]選擇EPS8高表達(dá)的人急性髓系白血病細(xì)胞株KGl α (人急性髓系白血病細(xì)胞株KGl α購自美國菌種保藏中心ATCC)，將細(xì)胞以10000個/孔接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μ L，培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基；8h后，加入終濃度分別為O、100、300、500μ g/ml的短肽P01。設(shè)定KGl α細(xì)胞與短肽POl共孵育時間分別為24h、48h、72h，MTS法測定490nm波長處OD值，計算抑制率。
[0034]抑制率計算公式:KG1 α細(xì)胞存活率=[(0D實驗組_0D空白組)]/[ (0D陰性組_0D空白組)]X100%。對KGla細(xì)胞增殖的抑制活性數(shù)據(jù)見圖5:24h時，IC5tl為888.5 μ g/mL(95%Cl:810.4μ g/mL ~974.1 μ g/mL) ；48h 時，IC50 為 413.9 μ g/mL (95 % Cl:389.3μ g/mL ~444.0 μ g/mL) ;72h 時，IC50 為 335.6 μ g/mL (95% Cl:316.1 μ g/mL ~356.2 μ g/mL)。
[0035]由上述結(jié)果可知，短肽POl在335.6 μ g/mL作用72h時對KGl α細(xì)胞就有較好的抑制細(xì)胞增殖活性，具有較好的研發(fā)為治療EPS8陽性腫瘤的藥物的前景。
[0036]實施例3短肽POl對EPS8高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖抑制活性
[0037]選擇EPS8高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF_7(人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自美國菌種保藏中心ATCC)，將細(xì)胞以10000個/孔接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μ L，培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基；8h后，加入終濃度分別為O、100、300、500 μ g/ml的短肽POl。設(shè)定MCF-7細(xì)胞與短肽POl共孵育時間分別為24h、48h、72h，MTS法測定490nm波長處OD值，計算抑制率。
[0038]抑制率計算公式:MCF_7細(xì)胞存活率=[(0D實驗組_0D空白組)]/ [ (0D陰性組_0D空白組)]X 100%。對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性數(shù)據(jù)見圖6:24h時，IC50為594.2 μ g/mL(95%Cl:572.5 μ g/mL ~616.8 μ g/mL) ；48h 時，IC50 為 374.9 μ g/mL (95 % Cl:352.9 μ g/mL ~398.3 μ g/mL) ；72h 時，IC50 為 304.7 μ g/mL (95% Cl:294.7 μ g/mL ~315.1 μ g/mL)。
[0039]由上述結(jié)果可知，短肽POl在304.7 μ g/mL作用72h時對MCF-7細(xì)胞就有較好的抑制細(xì)胞增殖活性，具有較好的研發(fā)為治療EPS8陽性腫瘤的藥物的前景。
[0040]實施例4短肽POl的用途及用于治療EPS8陽性腫瘤的藥物
[0041]本發(fā)明還提供了短肽在制備治療EPS8陽性腫瘤的藥物中的應(yīng)用及用于治療EPS8陽性腫瘤的藥物。所述治療EPS8陽性腫瘤的藥物以短肽POl為活性成分。本發(fā)明中所述藥物還包括藥用輔料。所述藥用輔料指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如:緩釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土 ；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、聚乙二醇等。另外，所述藥物中還可以加入其它輔劑，如香味劑、甜味劑等。所述藥物可以的劑型包括但不限于注射劑片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。
[0042]本發(fā)明中所述的“EPS8陽性腫瘤”包括但不限于宮頸癌、結(jié)直腸癌、垂體瘤、口腔鱗癌、胰腺導(dǎo)管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
[0043]實施例5熒光倒置顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記短肽POl的穿膜效果
[0044]將KGla靶細(xì)胞以2 X IO5個/孔接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔lmL，培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全 培養(yǎng)基；8h后，加入終濃度為20001^/1111^仲11'(:標(biāo)記短肽？01。24h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記短肽POl的穿膜效果，確認(rèn)其成功跨膜進(jìn)入細(xì)胞(圖7)。對比熒光倒置顯微鏡下488nm波長處、白光處及488nm波長處和白光處疊加圖像，發(fā)現(xiàn)視野下絕大多數(shù)靶細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)，證明該FITC標(biāo)記短肽POl成功穿膜進(jìn)入細(xì)胞，靶向抑制KGl α細(xì)胞的增殖活性，具有較好的研發(fā)為治療EPS8陽性腫瘤的藥物的前景。
[0045]實施例6激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記短肽POl的穿膜效果
[0046]將KGl α靶細(xì)胞以2 X IO5個/孔接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔lmL，培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基；8h后，加入終濃度為2000 μ g/mL的FITC標(biāo)記的短肽POl。分別采用DAPI (與細(xì)胞核DNA結(jié)合、340nm波長處產(chǎn)生藍(lán)色熒光)和羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)(與細(xì)胞骨架微絲蛋白結(jié)合、515nm波長處產(chǎn)生紅色熒光)對靶細(xì)胞進(jìn)行染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記短肽POl (488nm波長處產(chǎn)生綠色熒光)，24h后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察(圖8)。結(jié)果顯示，340nm波長處可見細(xì)胞核內(nèi)較強片狀藍(lán)色熒光，清晰地顯示出細(xì)胞核輪廓；515nm波長處可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)密集細(xì)長的紅色熒光沿細(xì)胞突起交叉分布，為細(xì)胞骨架被羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色所產(chǎn)生的熒光；488nm波長處可見細(xì)胞質(zhì)區(qū)密集分布的點狀綠色熒光；疊加(Overlay)熒光顯示,細(xì)胞核基質(zhì)中可見較細(xì)胞質(zhì)中少而弱的綠色點狀熒光，且核內(nèi)綠色熒光分布不均。上述結(jié)果表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記短肽POl既具有穿透細(xì)胞膜的能力，也具有一定穿透細(xì)胞核膜的能力。
[0047]基于上述實驗結(jié)果，可得出以下結(jié)論:本申請設(shè)計并合成靶向EPS8與EGFR結(jié)合短肽POl，通過MTS法檢測短肽POl對EPS8高表達(dá)人急性髓系白血病細(xì)胞株KGl α和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖抑制活性，IC50分別為335.6 μ g/mL(72h)和304.7 μ g/mL(72h)，具有較好的研發(fā)為治療EPS8陽性腫瘤疾病肽類抑制劑的前景。然后，對短肽POl進(jìn)行FITC標(biāo)記，利用熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察短肽穿膜效果。由于EPS8廣泛表達(dá)于不同時期不同類型的腫瘤組織中，且在正常組織細(xì)胞中低表達(dá)或無表達(dá)，因此，本申請靶向EPS8與EGFR結(jié)合短肽可以作為活性成分，和藥學(xué)上可接受的載體組成組合物，通過阻斷體內(nèi)EPS8與其受體相互作用，在治療與體內(nèi)EPS8陽性腫瘤疾病方面的應(yīng)用前景鼓舞人心，具有開發(fā)為抗腫瘤肽類藥物的巨大潛力。
[0048] 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種祀向EPS8與EGFR結(jié)合的短肽,其特征在于,其序列為:N’-Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-Cj。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短肽，其特征在于，所述短肽的C’末端賴氨酸的羧基被酰胺化，即其序列為 N’ -Arg-Lys-Lys-Asn-Lys-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-LyS-NH2-C?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的短肽，其特征在于，所述短肽阻斷體內(nèi)EPS8與其受體的相互作用。
4.一種用于治療EPS8陽性腫瘤的藥物，其特征在于，所述藥物的活性成分為權(quán)利要求1或2所述的短肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包含藥用輔料。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述藥物的制劑形式為注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、控釋或緩釋劑或納米制劑。
7.權(quán)利要求1或2所述的短肽在制備治療EPS8陽性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述EPS8陽性腫瘤為宮頸癌、結(jié)直腸癌、垂體瘤、口腔 鱗癌、胰腺導(dǎo)管癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、混合系白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
【文檔編號】A61K38/08GK103992382SQ201410203873
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】李玉華, 薛同圓 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)