專利名稱：抗瘢痕和組織纖維化寡聚雙鏈核苷酸藥物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種抗瘢痕和組織纖維化治療用的誘騙寡聚核苷酸，更具體而言，涉及一種能夠同時與轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1 (Activator protein-1,ΑΡ-l)和Smad2/3特異結(jié)合并抑制這兩個轉(zhuǎn)錄因子活性的誘騙寡聚核苷酸。本發(fā)明還涉及這種寡聚核苷酸的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病理性瘢痕是創(chuàng)面過度修復(fù)和組織纖維化的結(jié)果，不僅影響美觀，且可導(dǎo)致組織和器官不同程度的功能障礙，甚至是某些疾病治療失敗的主要原因，如抗青光眼濾過術(shù)后，濾過泡瘢痕的形成是導(dǎo)致抗青光眼手術(shù)失敗的主要原因。輸卵管阻塞再通術(shù)后瘢痕形成、腹腔術(shù)后形成腸粘連致腸梗阻，以及因炎性等刺激因素所致的腎纖維化和肝纖維化等疾病的發(fā)生均與組織過度修復(fù)和纖維化相關(guān)。因此，針對受創(chuàng)后組織過度修復(fù)和組織纖維化的形成機制，設(shè)計、研發(fā)并制備治療病理性瘢痕和組織纖維化疾病的藥物成為本領(lǐng)域的研究熱點之一。目前用于治療病理性瘢痕 和組織纖維化的主要措施包括以下幾個方面:(I)細胞因子抑制劑:如TGF-β 2的單克隆抗體、TGF-β 2受體阻滯劑、核心蛋白多糖(Decorin)、TGF-β 2反義寡核苷酸(OGN)、IL-1受體阻斷劑、整合素抗體等；(2)抑制成纖維細胞的增殖與遷移:如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、絲裂霉素c(MMC)、伊洛馬司他(ilomastat)、蘇拉明(Suramin)、光動力療法、β射線局部照射、Ρ21基因轉(zhuǎn)染等方法；(3)抑制早期炎癥的發(fā)生:包括皮質(zhì)類固醇及非激素類消炎藥兩類；(4)抑制膠原合成與收縮:如β氨基丙腈(β APN)、D青霉胺等；(5)增加細胞外基質(zhì)的降解:如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激酶、肝素等；(6) —些中藥制劑抑制成纖維細胞的增殖:如丹參、苦參堿、川芎和積雪苷等。上述抗瘢痕和組織纖維化藥物對過渡性瘢痕形成和組織纖維化的治療具有一定的療效，但也存在一些無法回避的問題，如5-氟尿嘧啶和絲裂霉素是很強的細胞有絲分裂抑制劑，毒副作用較大，可造成傷口不愈合等一些嚴重并發(fā)癥；而針對TGF-β 2的抑制劑是抗瘢痕和纖維化的研究熱點，雖然其也可減輕瘢痕的形成和組織纖維化，但也存在明顯不足，首先，其不能抑制TGF- β I和TGF- β 3介導(dǎo)的瘢痕化和纖維化作用；其次，我們知道瘢痕形成和纖維化是多個細胞因子綜合作用的結(jié)果，阻斷單一細胞因子的生物學效應(yīng)并不能達到徹底減少瘢痕形成和纖維化的目的；此外，如針對膠原等細胞外基質(zhì)的合成與降解的藥物，由于其不能消除細胞外基質(zhì)合成的始動因素，以及阻滯成纖維細胞的增殖效應(yīng)，其抗瘢痕和纖維化的作用也就受到了限制。綜上所述，為了預(yù)防病理性瘢痕的形成和組織纖維化，必須以病理性瘢痕形成和組織纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為突破口，尋找特異高效的抗瘢痕和纖維化藥物。傷口愈合是一個錯綜復(fù)雜的生物學過程，包括炎癥產(chǎn)生、細胞增生、纖維組織增生和組織重塑(瘢痕形成)四個階段。細胞因子在傷口愈合過程中占有非常重要的作用，參與傷口愈合的全過程，眾多的細胞因子(TGF-β、H)GF、EGF、bFGF、IL-UTNF等)形成網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控成纖維細胞等各種效應(yīng)細胞的增生和代謝活動，維持膠原等細胞外基質(zhì)沉積與降解之間的動態(tài)平衡，并對表皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和凋亡活動進行有秩序地調(diào)節(jié)。正性和負性的細胞因子在調(diào)節(jié)傷口愈合的過程中保持平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，則會出現(xiàn)增生性瘢痕或不愈合等病理性愈合。如，伴有過渡炎癥反應(yīng)的傷口，由于IL-l、IL-6等炎癥因子大量分泌，造成細胞因子之間的平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。TGF- β (transforming growth factor- β , TGF- β )是組織纖維化、創(chuàng)傷修復(fù)及瘢痕形成的關(guān)鍵調(diào)控分子之一。研究表明，活化的TGF-β可通過與細胞膜上具有絲/蘇氨酸激酶活性的TGF- β I型和II型受體結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物，后誘導(dǎo)I型受體磷酸化。磷酸化的I型受體特異性地識別并磷酸化激活TGF-β信號通路的胞內(nèi)信號分子-Smad蛋白家族中的受體調(diào)節(jié)型 Smads (Receptor-regulated Smads, R-Smads)(包括 Smad2 和 Smad3),活化的R-Smads與Co-Smad (即Smad4)結(jié)合成為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,并進入細胞核內(nèi)，直接與祀基因啟動子或增強子內(nèi)的一個回紋結(jié)構(gòu)DNA序列(5' -GTCTAGAC-3')順式作用元件，即Smad結(jié)合元件(Smad-binding element, SBE)特異性結(jié)合,調(diào)節(jié)TGF-β反應(yīng)性祀基因的轉(zhuǎn)錄和表達。已證實，許多參與傷 口愈合和瘢痕形成的基因，如纖溶酶原激活劑抑制物-1 (PA1-1)、血小板源性生長因子(TOGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖維結(jié)合素、I型和III型膠原等基因的增強子或啟動子內(nèi)，均含有SBE反應(yīng)元件。Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物可直接上調(diào)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達。另外，Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物還可通過與AP-1 (c-Fos和c_Jun)、FAST/FoxH、ATF2、VDR等DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合，與這些轉(zhuǎn)錄因子的信號通路發(fā)生交互作用(Cross-talk)，以間接方式，調(diào)節(jié)TGF-β反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄和表達，且這種間接方式是TGF-β信號通路的主要調(diào)節(jié)方式。研究發(fā)現(xiàn)，Smad3的抑制劑柚皮素(Naringenin)可明顯減弱TGF-β誘導(dǎo)的鼠肝星形細胞合成I型膠原、纖維連接蛋白和PA1-1等細胞外基質(zhì)的能力。此外，Smad3基因缺失小鼠肺泡纖維明顯減少，肺泡腔呈現(xiàn)進行性擴大，且將TGF-β I轉(zhuǎn)染入肺組織也不能誘導(dǎo)肺的纖維化。另外，值得注意的是，TGF-β信號通路除了通過Smad信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還可通過絲裂素蛋白活化激酶信號途徑(MAPK)介導(dǎo)，活化AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的表達?；罨鞍?1 (activator protein-l, AP-1)是一類由Fos蛋白和Jun蛋白同源或異源二聚體組成的轉(zhuǎn)錄因子，能以許多基因啟動子或增強子內(nèi)順式作用元件AP-1位點(5' -TGAGTGA-3')，即佛波酯反應(yīng)元件結(jié)合，參與介導(dǎo)多種與炎癥、細胞增殖、組織纖維化和細胞外基質(zhì)沉積等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。在傷口愈合的過程中，許多細胞因子(TGF- β、PDGF, EGF、bFGF、IL-1、TNF 等)都能通過 MAPK 信號通路激活 AP-1，活化的 AP-1進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的表達。目前已證實，參與傷口愈合和瘢痕形成的許多基因，如TGF-β、IL-1 β、IL-8、ICAM-1、絲狀分裂控制蛋白_1 (MCP-1)、細胞周期素D1、纖維連接蛋白、層粘連蛋白B、I型膠原、金屬蛋白酶組織抑制物-1 (TIMP-1)等基因的啟動子或增強子內(nèi)均含有AP-1位點，其可調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達。抑制AP-1的信號通路，可明顯減少增生性瘢痕的形成和組織纖維化。綜上所述，Smad信號通路和AP-1信號通路是兩條與傷口愈合、瘢痕形成和組織纖維化關(guān)系最為密切的信號通路。Smad信號通路主要參與TGF-β誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，還可上調(diào)Ap-1的JunB亞基轉(zhuǎn)錄和表達，以及與c-Fos和c-Jun亞基結(jié)合，協(xié)助AP-1誘導(dǎo)與傷口愈合和瘢痕形成相關(guān)基因的表達。而AP-1信號通路則是許多刺激因素的共同信使傳導(dǎo)分子，不僅介導(dǎo)傷口愈合早期的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達，還是傷口愈合和瘢痕形成相關(guān)基因的調(diào)控者。此外，AP-1是傷口愈合和瘢痕形成過程中信號放大效應(yīng)的始動者，其可被TGF-β活化，而活化的AP-1又可上調(diào)TGF-β的表達，由此放大傷口愈合的信號?？傊?，Smad和AP-1兩條信號通路相互協(xié)調(diào)，共同參與介導(dǎo)了傷口愈合和瘢痕的形成。而如果單獨抑制Smad信號通路，可誘發(fā)持續(xù)性的過度炎癥反應(yīng)，影響靶向TGF-β抗瘢痕和抗組織纖維化的療效，這也是TGF-β拮抗劑療效欠佳的原因之一。由此，我們認為，如能同時成功抑制這兩條信號通路，將能有效抑制傷口愈合過程中病理性瘢痕的形成和組織纖維化。目前，同時針對這兩條信號通路的抑制劑國內(nèi)外均未見報道。從Smads和AP-1的活化途徑不難看出，Smads和AP-1與靶基因啟動子或增強子內(nèi)的DNA順式作用元件結(jié)合是特異性的，只有直接干預(yù)Smads和AP-1與DNA順式作用元件相結(jié)合，才能達到真正意義上的特異性控制瘢痕的形成和組織纖維化，有效阻滯增生性瘢痕形成和組織纖維化過程中的信號放大效應(yīng)和成纖維細胞的過度增殖，減少細胞外基質(zhì)的過度合成，同時加強細胞外基質(zhì)的降解速度。而對Smads和AP-1活化的上下游途徑進行干預(yù)則難以達到這一目的。此外，在尋找阻斷Smads和AP-1的活化策略時，應(yīng)把握“適度抑制”原則，而不是“完全封閉/永久阻斷”。故研制特異性的Smads和AP-1抑制劑(而不是阻斷齊U)將為最終獲得高效 、低副作用的理想抗瘢痕藥物提供可能。而應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子“誘騙”策略可達到同時拮抗Smads和AP-1活化的目的，且這一策略是實現(xiàn)這一理想治療病理性瘢痕形成和組織纖維化的最佳選擇之一。自1996年第一個經(jīng)美國FDA批準的轉(zhuǎn)錄因子E2F “誘騙”策略(decoy strategy)用于治療血管旁路移植術(shù)后新生內(nèi)膜增生(neointimal hyperplasia in vein bypassgrafts)病人以來，許多研究已經(jīng)報道了該策略作為體內(nèi)基因治療的效果。其基本原理是:合成與順式作用元件相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(被稱為誘騙ODNs)，轉(zhuǎn)染入細胞，競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達。由于該策略具有以下優(yōu)點:(I)潛在的藥物靶點(轉(zhuǎn)錄因子)；(2)誘騙ODNs的合成相對簡單且可靶向特異的組織；(3)不必弄清轉(zhuǎn)錄因子靶分子的精確分子結(jié)構(gòu)；(4)誘騙ODNs可阻斷與同一順式作用元件結(jié)合的多種轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，且也可阻斷同一轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的多個靶基因的表達，其作用能力比反義ODNs更強。因此國外眾多學者一致認為該策略可作為治療某些人類疾病一種有效的手段。目前，有關(guān)單獨靶向Smad或者AP-1的“誘騙”策略，已應(yīng)用于探討Smad和AP-1在癌癥、心血管和腎臟等相關(guān)疾病中的作用機制，以及對這些疾病的治療性研究，體外實驗和動物試驗結(jié)果已顯示出確切而誘人的結(jié)果。這與該策略具有拮抗Smad或AP-1活性的特異性、競爭抑制性(不是完全阻斷)、使用時間及劑量的可控性等特性有關(guān)。為此，我們以介導(dǎo)瘢痕形成和組織纖維化的關(guān)鍵調(diào)控分子Smads和AP-1為靶點，應(yīng)用核轉(zhuǎn)錄因子的誘騙策略，設(shè)計并合成可同時與Smad和AP-1結(jié)合，并具有同時抑制兩種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的雙功能誘騙寡核苷酸，同時證實此寡核苷酸能高效抑制成纖維細胞的增殖，膠原的合成，有效阻止瘢痕的形成和組織纖維化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗瘢痕和組織纖維化的核酸藥物。
本發(fā)明所述藥物包含既能與AP-1高親和結(jié)合的AP-1順式作用元件，又能與Smad高親和結(jié)合的Smad順式作用元件的雙鏈誘騙寡核苷酸。其中，所述雙鏈誘騙寡核苷酸包括能與Smad高親和結(jié)合的經(jīng)典核心序列AGCCAGACA和ATGCAGACA，以及能與AP-1高親和結(jié)合的經(jīng)典核心系列TGACTCA和TTACCTCA，或其功能等價物。優(yōu)選的核酸，序列如下=AFODNl:序列I和序列2組成的雙鏈寡核苷酸；AF0DN2 序列3和序列4組成的雙鏈寡核苷酸；AF0DN3:序列5和序列6組成的雙鏈寡核苷酸；AF0DN4:序列7和序列8組成的雙鏈寡核苷酸。本發(fā)明是一系列序列特異的誘騙核酸，可特異性結(jié)合Smad和AP-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本發(fā)明的藥物通過下調(diào)Smad和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制成纖維細胞的過度增殖，以及細胞外膠原等基質(zhì)的分泌，達到治療病理性瘢痕和組織纖維化的目的。為此，本發(fā)明另一個目的在于，本發(fā)明的核酸在制備抗AP-1和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥物中的應(yīng)用。所述抗AP-1和Smad轉(zhuǎn)錄活性的藥物是治療AP-1和Smad異常表達或活化引起的瘢痕化和組織纖 維化相關(guān)疾病的藥物；所述藥物是治療纖維化疾病、異常傷口愈合、異常骨生成、免疫/炎癥相關(guān)疾病或抗青光眼濾過性手術(shù)后抗愈合的藥物。本發(fā)明的目的可通過以下措施來達到:抗瘢痕和組織纖維化藥物的設(shè)計是將轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的序列作為藥物誘騙核酸的核心序列，核心序列以不同組合形式組成雙鏈寡聚核苷酸，同時適當增加核心序列的側(cè)翼長度，使其易形成空間結(jié)構(gòu)，以加強藥物的穩(wěn)定性及與靶因子的親和力。 藥物AFODNl、AF0DN2、AF0DN3和AF0DN4是為調(diào)控AP-1和Smads的過度活化而設(shè)計。將轉(zhuǎn)錄因子AP-1的2種經(jīng)典順式作用元件(TGACTCA和TTACCTCA)和轉(zhuǎn)錄因子Smads的2種經(jīng)典順式作用元件(AGCCAGACA和ATGCAGACA)以不同的先后順序融合成交錯重疊的正義和反義的寡核苷酸，競爭結(jié)合AP-1和Smads，抑制AP-1和Smads的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)含AP-1和Smads增強子基因的表達，從而抑制成纖維細胞的增殖、生長和細胞外基質(zhì)的分泌，達到治療病理性瘢痕和組織纖維化的目的。例如:藥物AFODNl是由33個核苷酸的序列I和序列2配對形成的雙鏈線性寡核苷酸。藥物AF0DN2是由33個核苷酸的序列3和序列4配對形成的雙鏈線性寡核苷酸。藥物AF0DN3是由34個核苷酸的序列5和序列6配對形成的雙鏈線性寡核苷酸。藥物AF0DN4是由34個核苷酸的序列7和序列8配對形成的雙鏈線性寡核苷酸。上述8種核苷酸序列中均包含AP-1的經(jīng)典順式作用元件(TGACTCA和TTACCTCA)和Smads的經(jīng)典順式作用元件(AGCCAGACA和ATGCAGACA)。誘騙核酸藥物經(jīng)DNA全自動合成儀合成，硫代化，脫保護，純化和凍干，溶于水中，定性定量測定分析后，進行體外篩選和藥效試驗，用L929成纖維細胞作為篩選體系，將細胞加入96孔培養(yǎng)板，用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，加入脂質(zhì)體和上述誘騙核酸，繼續(xù)于37°C，5% CO2中培養(yǎng)48h。用ATP生物素熒光法測定細胞的增殖。篩選結(jié)果表明4種誘騙核酸對L929細胞均有較強的抑制作用，其中AF0DN4的抑制作用最大。這些誘騙核酸均可開發(fā)成為抗瘢痕和組織纖維化藥物。具有上述核苷酸核心序列結(jié)構(gòu)的寡聚誘騙DNA可同時與AP-1和Smads結(jié)合，并抑制AP-1和Smads與其順式作用元件的結(jié)合,從而抑制AP-1和Smads的轉(zhuǎn)錄活性，即抑制AP-1和Smads調(diào)控各種含其順式作用元件的靶基因表達。此種結(jié)構(gòu)寡聚誘騙DNA既可以以DNA形式單獨存在，也可與其它核酸和多肽融和，或被甲基化、硫代化、鎖核酸化和硼烷磷酸酯化等修飾，或進行個別堿基的突變、缺失或替代，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu)DNA的物質(zhì)可能表現(xiàn)出同時與AP-1和Smads結(jié)合，并抑制AP-1和Smads生物學活性的作用。本發(fā)明通過細胞增殖試驗驗證，證實上述4種寡聚雙鏈DNA不僅能夠競爭性阻斷AP-1與其順式作用元件的結(jié)合，也能夠抑制Smad與其順式作用元件的結(jié)合，進而抑制含AP-1和Smads順式作用元件的靶基因的表達，具有抗瘢痕和組織纖維化的功能，因而可以成為新的靶向AP-1和Smads的抗瘢痕和組織纖維化藥物或藥物前體。本發(fā)明的DNA可以用于治療各種瘢痕和組織纖維化相關(guān)疾病?？梢詫⑵渥鳛樗幬锘钚猿煞种苽涑伤幬锝M合物，該組合物根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的載體，可以采用制劑學常規(guī)技術(shù)制備該組合物，本發(fā)明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟膏形式。本發(fā)明的誘騙DNA可通過化學方式合成，也可將含此序列的核苷酸與其它核酸或多肽融合或進行化學修飾，用于抑制AP-1和Smads活性為目的的各種瘢痕相關(guān)疾病、各種纖維化疾病以及其它相關(guān)疾病的治療，這對于設(shè)計和研制同時靶向AP-1和Smads的高效特異抗 瘢痕和組織纖維化藥物具有重要意義。本發(fā)明的優(yōu)點:與反義核酸和SiRNA相比，無論是作用機理還是作用效率，誘騙核酸均有著明顯的差異:結(jié)構(gòu)存在明顯差異，反義核酸和siRNA為單鏈線性寡聚核酸，誘騙核酸是具有二級結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA ;作用位點也存在明顯的差異，反義核酸和siRNA互補于靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的某段序列，而誘騙核酸則直接結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))上；另外，用量上也存在明顯的差異，一個拷貝基因可轉(zhuǎn)錄出200-300條mRNA，且mRNA具有瞬時性，需要大量的反義核酸和siRNA才能達到抑制靶基因表達的目的。相反，一種轉(zhuǎn)錄因子可控制多種效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，且可被循環(huán)利用轉(zhuǎn)錄生成多拷貝的效應(yīng)基因mRNA，然而一個拷貝的轉(zhuǎn)錄因子僅需要一個拷貝誘騙分子即能封阻轉(zhuǎn)錄因子的活性，因此相對而言，誘騙核酸藥的用量較反義核酸和siRNA的用量將少1-2個數(shù)量級。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有本發(fā)明誘騙核酸藥物的藥物組合物。本發(fā)明的誘騙核酸藥物可以將其作為藥物活性成分制備成藥物組合物，該組合物根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的藥用載體，制備成任何藥用劑型。其中，所述藥物活性成分占制劑總重量的0.1-99.9%，所述藥學上可接受的載體以重量計可以是制劑總重量的
0.1-99.9%。所述藥用載體包括生理鹽水等常用載體和緩沖液、脂質(zhì)體、聚合物等，可以采用制劑學常規(guī)技術(shù)制備該組合物。本發(fā)明的組合物可以口服，也可以非胃腸道給藥，優(yōu)選的組合物是單位劑量的納米型噴霧劑、注射劑和軟膏形式。本發(fā)明所述的祀向AP-1和Smad的誘騙核酸藥物對纖維細胞的增殖、生長和胞外基質(zhì)分泌均有抑制作用，在制造抗瘢痕和組織纖維化藥物中具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。


圖1為AFODN系列誘騙核酸對TGF- β I和TGF- β 2誘導(dǎo)的L929成纖維細胞的生長抑制結(jié)果。圖2Α為ELISA方法檢測AFODN系列誘騙核酸對AP-1與其順式作用元件結(jié)合競爭性抑制實驗的結(jié)果。圖2B為ELISA方法檢測AFODN系列誘騙核酸對Smad與其順式作用元件結(jié)合競爭性抑制實驗的結(jié)果。表I為流式細胞儀檢測AFODN系列誘騙核酸對TGF- β I誘導(dǎo)的成纖維細胞細胞周期影響的實驗結(jié)果表2為流式細胞儀檢測AFODN系列誘騙核酸對TGF- β 2誘導(dǎo)的成纖維細胞細胞周期影響的實驗結(jié)果圖3Α熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測誘騙核酸對Ap-1反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達的抑制效應(yīng)。圖3Β熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測誘騙核酸對Ap-1反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達的抑制效應(yīng)。圖4 (A-F)生物傳感器實驗檢測誘騙核酸與AP-1和Smad間的相互作用。:AP-ldsODN, AP-1陽性對照誘騙核酸！Scramble dsODN,隨機誘騙核酸陰性對照。圖5免疫印 跡實驗檢測誘騙核酸對L929成纖維細胞表達纖維化介質(zhì)的抑制作用。圖6急性創(chuàng)面動物實驗檢測誘騙核酸局部應(yīng)用對組織纖維化介質(zhì)表達的抑制效應(yīng)。
具體實施例方式實施例1、誘騙核酸藥物的制備和分析合成四種下述硫代雙鏈寡聚誘騙核酸藥物:AF0DN1:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2等量于PBS緩沖液中混合，94°C變性5分鐘后，退火成的雙鏈寡聚DNA ；AF0DN2:SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4等量于PBS緩沖液中混合，94°C變性5分鐘后，退火成的雙鏈寡聚DNA ;AF0DN3:SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6等量于PBS緩沖液中混合，94°C變性5分鐘后，退火成的雙鏈寡聚DNA ;AF0DN4:SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8等量于PBS緩沖液中混合，94°C變性5分鐘后，退火成的雙鏈寡聚DNA。Scramble 陰性對照序列正義鏈:5 ' -GACGCAAGCAGTAGCTATTGCTCAGTCTACCATC-3/反義鏈:5'-GATGGTAGACTGAGCAATAGCTACTGCTTGCGTC-3'AP-1 陽性對照序列正義鏈:5' -GTGTCTGACTCATGTACTGTCTTACCTCATGTC-3'反義鏈:5'-GACATGAGGTAAGACAGTACATGAGTCAGACAC-3'Smad 陽性對照序列正義鏈:5' -GTCTGAGCCAGACATAGTGATGCAGACATACTC-3'反義鏈:5'-GAGTATGTCTGCATCACTATGTCTGGCTCAGAC-3'應(yīng)用美國PE公司391型DNA合成儀，以亞磷酰胺固相合成法合成所設(shè)計的硫代誘騙核酸。主要原料有:四種二異丙基β -氰乙基亞磷酰胺單體:腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)和胸苷⑴；四種控制孔徑玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、G、C、T)。蓋帽試劑分別為:乙酸酐/ 二甲基卩比唳/四氫呋喃和1-甲基咪唑/四氫呋喃；硫代反應(yīng)試劑:Beaucage試劑/乙腈；脫三苯甲基試劑:三氯乙酸/ 二氯甲烷；液體溶劑:乙腈和三氯甲烷。合成規(guī)模為100D。堿基單體溶于無水乙腈中，濃度為100豪摩爾，其它試劑濃度及用量按照儀器操作手冊進行。合成過程由儀器程序自動控制。合成產(chǎn)物置于裝有29%濃氨水的密封耐壓玻璃瓶中，于55°C處理15小時，脫去核酸分子上各種堿基保護基團和氨基保護基團。脫保護結(jié)束后，揮發(fā)脫去大部分氨氣，凍干得白色粉末狀粗制品，重溶于緩沖液中，用Pharmacia Source 30Q層析及AKTA層析系統(tǒng)進行純化。純化樣品經(jīng)G-15分子篩葡聚糖凝膠層析柱除鹽，后凍干得到白色絮狀核酸純品，儲存于_20°C，并取少量樣品進行純度和分子量分析。用毛細管電泳法和高效液相層析法測其純度及分子量，要求純度均大于90%，DNA測序法測定序列完全正確，核磁共振法測硫代化程度大于98.5%。實施例2、四種AFODN系列誘騙核酸對L929成纖維細朐的牛長抑制復(fù)蘇并接種L929成纖維細胞于細胞培養(yǎng)瓶，在37°C、5% CO2條件下，用含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞；待細胞匯合至70% -80%時，胰酶消化細胞，活細胞計數(shù)后并將細胞濃度調(diào)整至2 X IO5個/ml ;于96孔板以每孔100 μ L細胞懸液接種細胞，培養(yǎng)12小時；后更換成無血清培養(yǎng)液，將細胞隨機分成空白對照組、陽性對照組、陰性對照組和四種AFODN藥物組，且每組設(shè)3復(fù)孔，其中空白對照組僅加入0.6 μ I/孔脂質(zhì)體，其余均加入0.6 μ I/孔脂質(zhì)體和終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉(zhuǎn)染5小時后，更換成含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μ L，同時加入終濃度5ng/ml的TGF- β I或TGF- β 2誘導(dǎo)細胞增殖，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)72h ;每孔加入ATP提取液100 μ L，混勻后室溫下放置30min,取50 μ L細胞提取液于檢測板中，加入熒光素_熒光素酶50 μ L,混勻后置于熒光分析儀進行檢測，測定每孔樣品的熒光值。并計算細胞生長抑制率，作為誘騙核酸抑制L929細胞增殖的評價指標，細胞生長抑制率=(空白對照組熒光值-藥物組熒光值)/空白對照組熒光值。細胞生長抑制實驗結(jié)果表明，較隨機誘騙核酸相比，本發(fā)明的四種AFODN序列藥物以及AP-1和Smad陽性對照誘騙核酸均對L929細胞的生長均有明顯的抑制作用，其中AF0DN4對L929細胞的生長的抑制作用最強，明顯強于AP-1和Smad陽性對照誘騙核酸，見圖1。實施例3、ELISA方法檢測誘騙核酸對AP_1和Smad與其順式作用元件結(jié)合的競爭抑制實驗分別將IOpmol的AFODN系列藥物稀釋于30 μ I完全結(jié)合緩沖液，并以每孔30 μ I量加入包被了 Ap-1或Smad順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Active Motif公司的TransAM Transcription factor assay kits)中;再將 5yg TPA誘導(dǎo)的 K-562 細胞核抽提物(針對Smad則用TGF-β I誘導(dǎo)的L929成纖維細胞核抽提物)稀釋于20 μ I完全結(jié)合緩沖液中，后依次加入96孔酶聯(lián)板中混勻，室溫孵育lh。注以3復(fù)孔進行各種樣品的檢測，實驗分組如下:空白陰性對照僅加入不含AFODN藥物和細胞核抽提物的50 μ I完全結(jié)合緩沖液；空白陽性對照則為加入不含AFODN藥物，只含5 μ g核抽提物的50 μ I完全結(jié)合緩沖液；陰性對照則為加入同等濃度陰性對照誘騙核酸和5 μ g細胞核抽提物的50 μ I完全結(jié)合緩沖液；陽性對照則為加入同等濃度陽性對照誘騙核酸和5 μ g細胞核抽提物的50 μ I完全結(jié)合緩沖液；實驗組則為加入含IOpmol的AFODN系列藥物，以及5 μ g細胞核抽提物的50 μ I完全結(jié)合緩沖液。以200 μ I/孔加入洗脫液洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；以1: 500稀釋度用抗體結(jié)合緩沖液稀釋c-fos抗體或Smad3抗體，后以100 μ I/孔加入稀釋的抗體，室溫孵育Ih;再以200μ1/孔加入洗脫液洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；以1: 1000稀釋度用抗體結(jié)合緩沖液稀釋羊抗兔IgG-HRP 二抗，后以100 μ I/孔加入稀釋的二抗，室溫孵育Ih ;再以200 μ I/孔加入洗脫液洗滌4次，每次4min，去除洗滌液；以100 μ I/孔加入底物反應(yīng)液，室溫孵育2-20min，待陽性對照液變深藍色后，以100 μ I/孔加入終止液終止反應(yīng)；于450nm和655nm雙波長檢測OD值。AFODN系列藥物對AP-1或Smad與其順式作用元件結(jié)合的抑制百分數(shù)計算公式為:(空白陽性對照OD-AFODN藥物OD)/空白陽性對照0D。結(jié)果表明，與隨機誘騙核酸對照相比，本發(fā)明的四種AFODN系列誘騙藥物即能明顯抑制AP-1的DNA結(jié)合活性，又能抑制Smad的DNA結(jié)合活性。然而AP-1陽性對照核酸僅能抑制AP-1的DNA的結(jié)合活性，而對Smad的DNA結(jié)合活性則無抑制作用。于此相似，Smad陽性對照核酸僅能抑制Smad的DNA結(jié)合活性，而對AP-1的DNA結(jié)合活性則無抑制作用，如圖2A和2B所示。實施例4、流式細胞儀檢測誘騙核酸對成纖維細胞細胞周期的影響將L929細胞以I X IO5個/平板接種于6CM平板中，在37°C、5 % CO2條件下，用含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞12小時；后更換成無血清培養(yǎng)液，將細胞隨機分成空白對照組、陽性對照組、隨機誘騙核酸對照組以及AFODN系列藥物組，且每組設(shè)3復(fù)孔，其中空白對照組僅 加入12 μ I/孔脂質(zhì)體，其余均加入12 μ I/孔脂質(zhì)體和終濃度為IOOnM的不同誘騙核酸；轉(zhuǎn)染5小時后，更換成含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，同時加入終濃度5ng/ml的TGF-β I或TGF-β 2誘導(dǎo)細胞，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24h ;收獲細胞，300g離心5min，棄上清，后將細胞團重懸于殘留液體中；緩慢滴加200 μ 170%的乙醇進行細胞固定，在滴加乙醇的同時注意旋渦震蕩細胞。后將細胞于4°C放置30min ;用2ml含2% BSA的PBS洗細胞一次，300g離心5min，棄上清，后將細胞團重懸于殘留液體中；于細胞懸液中加入0.5ml的PI/Rnase溶液，混勻，分析前室溫孵育15min，最后進行流式細胞儀分析。如表I和表2顯示，與隨機誘騙核酸相比，AP-1陽性誘騙核酸、Smad陽性誘騙核酸、AFODNl、AF0DN2、AF0DN3和AF0DN4藥物處理的細胞，無論是TGF- β I還是TGF- β 2誘導(dǎo)細胞均被明顯阻滯于S期，特別是對TGF-β 2誘導(dǎo)細胞阻滯效應(yīng)最為明顯。與AP-1和Smad的陽性誘騙核酸相比，AFODNl、AF0DN2、AF0DN3和AF0DN4藥物對細胞的阻滯效應(yīng)明顯增強，特別是AF0DN4的阻滯能力最強。表I 誘騙核酸對TGF-β I誘導(dǎo)的L929細胞細胞周期的影響
權(quán)利要求
1.核酸藥物，其特征在于所述的核酸藥物的序列包含TGACTCA、TTACCTCA、AGCCAGACA和ATGCAGACA核酸序列或其功能等價物，這四種核心核酸序列包含于雙鏈核苷酸的正義鏈或者反義鏈中，其中所述的功能等價物是指核苷酸序列中的至少一個或者多個或者全部為硫代或者甲基取代的喊基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸藥物，其特征在于，所述核酸藥物包含SEQID N0.1或SEQ ID N0.2 ；SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 ；SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6 ；SEQ ID N0.7 或SEQ ID N0.8中的一種或者多種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所屬的核酸藥物，所述核酸藥物的序列為SEQID N0.1和SEQ IDN0.2 ；SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 ；SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 ；SEQ ID N0.7 和 SEQ IDN0.8所形成的雙鏈寡聚核苷酸中的一種或者多種的組合。
4.一種藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求1-3任意一項所述的核酸藥物，任選的，包括藥學上可接受的載體。
5.權(quán)利要求1-3所述的任何一項核酸藥物在制備抗AP-1和/或Smad轉(zhuǎn)錄活性藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物用于治療AP-1和/或Smad異常表達或活化引起的瘢痕化和和/組織纖維化相關(guān)疾病的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于治療纖維化疾病、異常傷口愈合、異常骨生成、免疫/炎癥相關(guān)疾病和/或抗青光眼濾過性手術(shù)后抗愈合的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，含有藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙功能抗瘢痕和組織纖維化雙鏈寡聚核苷酸藥物，所述的核酸藥物的序列包含TGACTCA、TTACCTCA、AGCCAGACA和ATGCAGACA核酸序列或其功能等價物，這四種核心核酸序列包含于雙鏈圈套核苷酸的正義鏈或者反義鏈中。
文檔編號A61P43/00GK103223175SQ20131008930
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者徐祥, 郭韡, 邢偉, 黃宏, 李向云, 羅安雄, 陳東風 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院