本發(fā)明提供了一種滅活源自血液、血漿或者通過重組方法獲得的蛋白制劑中凝血因子的方法。引言凝血因子作為凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中接觸活化或內(nèi)源性凝血途徑的一部分，在血液凝固和血凝塊形成中發(fā)揮了重要作用。有證據(jù)表明，部分凝血因子，例如FXI，在藥品制造過程中可能會(huì)被激活，所以剔除或至少滅活這些激活的凝血因子顯得很有必要。更優(yōu)選從要用于靜脈內(nèi)或皮下應(yīng)用的醫(yī)療制劑中除去盡可能多的凝血因子，以避免在病人中發(fā)生不良和威脅健康的血凝塊形式的血栓事件。減少混有其他蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白或白蛋白的溶液中的FXIa或FXI的方法是已知的，但包括耗時(shí)的層析法，在使用特定的親和樹脂時(shí)，這還意味著大量的成本投入。Bouma等;J.Biol.Chem；1977；252（18）；6432-7教導(dǎo)了從不含可測(cè)量（小于0.01U/ml）FXIa的血漿中提純FXI的方法，該方法包括四個(gè)連續(xù)的層析步驟，首先為DEAE層析，接著為QAE-和SP層析，以及利用SP-葡聚糖凝膠的第二層析步驟。在某些情況中，利用刀豆蛋白A瓊脂糖親和凝膠進(jìn)行額外的層析純化來消除γ-球蛋白（免疫球蛋白G）。Komiyama等;Thromb.Res;1992;66;397-408描述了借助FXI的固定化抗體除去血小板濃縮物中FXI/FXIa的方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種光譜、高效、簡(jiǎn)單的去除凝血因子的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的目的提供從包含激活的凝血因子及其未激活的酶原的來源中滅活和/或除去這些蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明公開了從含有激活的和/或未激活的凝血因子，特別是凝血因子FXIa和FXI，但也包括FII，F(xiàn)VII，F(xiàn)VIIa，F(xiàn)IX，F(xiàn)IXa和FX的來源中滅活和/或去除這些凝血因子的方法。感興趣的來源包括血液或血漿或其諸組分，特別是血漿中主要含有免疫球蛋白或白蛋白作為治療活性蛋白的諸組分。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，將含凝血因子的免疫球蛋白G（IgG）溶液與有機(jī)酸或其鹽接觸，同時(shí)在約0℃至約40℃的溫度下、約3.5至約6.0的pH范圍下攪拌，不僅FXIa被滅活或去除，其他凝血因子同樣被滅活或去除。所述的有機(jī)酸可以是C4到C10，飽和的或不飽和的有機(jī)酸或其鹽，特別是堿土金屬的鹽，如鈉鹽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，有機(jī)酸為丁酸（C4），戊酸（C5），己酸（C6），庚（C7），辛酸（C8），壬酸（C9），和/或癸酸（CIO）或其鹽，如鈉鹽。優(yōu)選地，有機(jī)酸是辛酸，或它的鹽是辛酸鈉鹽，但戊酸和癸酸的鹽也認(rèn)為是非常適合的。有機(jī)酸或其鹽的施用濃度為5至50mmol/L。蛋白質(zhì)和有機(jī)酸或其鹽攪拌45至180分鐘，優(yōu)選地，55至120分鐘，隨后將產(chǎn)生的沉淀物與上清液分離。攪拌時(shí)可任選使用助濾劑如硅酸鹽，例如選自以下的天然產(chǎn)生或合成的硅酸鹽：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠巖或沸石。這種滅活或去除步驟的優(yōu)勢(shì)在于可以將其引入提純?cè)醋匝旱牡鞍踪|(zhì)的任何已知方法的合適之處。得到的蛋白質(zhì)溶液用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)一步處理。方法特別適合用來制造免疫球蛋白制劑。發(fā)明詳述本發(fā)明提供從包含凝血因子的來源中滅活和/或除去此類蛋白質(zhì)的方法。這種來源的例子有主要含有免疫球蛋白，特別是免疫球蛋白G（IgG抗體）或白蛋白的蛋白質(zhì)溶液。本發(fā)明可避免采用去除凝血因子FII，F(xiàn)VII，F(xiàn)VIIa，F(xiàn)IX，F(xiàn)IXa，F(xiàn)X，F(xiàn)XI和FXIa所用的層析操作。當(dāng)然，可以為其它原因而額外采用層析法純化步驟。出乎意料的是，本研究發(fā)現(xiàn)，將含有凝血因子的復(fù)雜混合物的溶液，特別是血漿分級(jí)的I+II+III組分或類似組分，與有機(jī)酸或其鹽，特別是鈉鹽，在1℃至40℃，特別是2℃到30℃的溫度下，在約4至約6，特別是4.2到5.6的較寬pH范圍內(nèi)接觸，能將所述的凝血因子滅活或去除到超出檢測(cè)限的水平。當(dāng)溶液與濃度至少為20mmol／L的辛酸或其鹽接觸時(shí)，還觀察到XI因子抗原（FXI：Ag）的值降低到低于5mIU／mgIgG。在用有機(jī)酸或其鹽處理期間，pH值可以在所述范圍內(nèi)變動(dòng)，或在該范圍內(nèi)維持基本恒定，其中與固定值的偏差為+/-0.3。有機(jī)酸或其鹽，特別是辛酸鈉的施用濃度范圍從5到50mmol/L，特別是從10到22mmol/L。在持續(xù)攪拌下，蛋白和有機(jī)酸或其鹽接觸45到180分鐘，特別是55到120分鐘。攪拌時(shí)可任選使用助濾劑，如硅酸鹽，例如選自下組的天然產(chǎn)生的或合成硅酸鹽：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠巖或沸石；并在接觸完成后與產(chǎn)生的沉淀物一起除去。沉淀物和上清液的分離可以使用通用已知的方法進(jìn)行，可通過過濾，離心或沉降進(jìn)行，這過程一般再需要60到120分鐘。通過沉降來分離可能需要更長(zhǎng)時(shí)間。一個(gè)沉淀和分離周期可能要持續(xù)5個(gè)小時(shí)，從開始沉淀到分離結(jié)束。特別是，如果第一次滅活或去除可能不足以完全滅活或去除有些凝血因子，這些凝血因子的殘留量仍在檢測(cè)限之上，可適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行第二次的滅活或去除步驟。將沉淀物和上清液分離的方法是眾所周知的，包含沉降，過濾或離心或它們的組合。因此，利用有機(jī)酸或其鹽進(jìn)行的第二滅活可納入作為備選項(xiàng)。該滅活或去除步驟可以引入提純?cè)醋匝旱牡鞍踪|(zhì)的任何已知方法的合適之處。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法做進(jìn)一步處理。常規(guī)處理包括用于去除殘留量的有機(jī)酸或其鹽的陰離子層析法，溶劑/去污劑處理（S/D處理），超濾和滲濾，制成制劑，無菌過濾和灌裝到最終容器中。產(chǎn)品還可任選進(jìn)行凍干處理。最終IgG產(chǎn)品的抗體濃度通常是在5-16%范圍內(nèi)，但抗體濃度最高約25%也是可能的。必須指出，由于靜脈內(nèi)施用時(shí)粘度的原因，濃度高于20%的產(chǎn)品需要特殊制成制劑。發(fā)現(xiàn)IgG抗體的回收能從下述處理中獲益：用一種有機(jī)酸或鹽在約2-8℃的低溫下處理，隨后用不同的有機(jī)酸或其鹽在20-40℃的室溫下處理。此類方法的一個(gè)例子為，先在2-8℃溫度下用辛酸鈉鹽處理，將沉淀物分離后用戊酸鈉鹽或癸酸鈉鹽在20-40℃下處理溶液。分析方法為了確保在生產(chǎn)過程中凝血因子不發(fā)生活化或濃縮，在整個(gè)過程中都會(huì)取出進(jìn)程中樣品(in-processsample)來分析上述的凝血因子。所有進(jìn)程中樣品以及最終容器中的產(chǎn)品都測(cè)試凝血因子存在與否。由于滅活或去除，最遲到第二次有機(jī)酸或其鹽處理后，不可能檢測(cè)到凝血因子。即使在濃縮的最終產(chǎn)品中也沒有達(dá)到或超過凝血因子的檢測(cè)限。此外，用NATEM和凝血酶生成分析（TGA）分析最終產(chǎn)品中促凝活性，所有最終產(chǎn)品都沒有檢測(cè)到凝血活性。促凝活性基于血栓彈性描記法(thrombelastography)的原則，采用購(gòu)自公司的凝血分析儀與測(cè)試和購(gòu)自的試劑來測(cè)定缺乏XI因子的血漿的促凝活性測(cè)定。所有試驗(yàn)都是對(duì)最終產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)（IgG濃度5％，10％和16％），超過3000秒（50分鐘）后終止，顯示沒有促凝活性。凝血酶生成分析利用Technoclone公司的TGA，對(duì)XI因子缺乏的血漿以及合并的正常血漿作凝血酶生成分析（TGA）。測(cè)定了時(shí)滯(Lag-time)，即凝血酶形成的起始，測(cè)定了凝血酶峰值和TTP（即到峰值時(shí)間）。結(jié)果匯總在表1，結(jié)果顯示，，XI因子缺乏血漿（FXI-PD）中，有一定長(zhǎng)度延長(zhǎng)的時(shí)滯和TTP，并且凝血酶峰值減少至血漿合并值的10%左右。表1：分析因子FII,FVII,FVIIa,FIX,FIXa,FX,FXI和FXIa除了FIXa和FXIa，使用Werfen集團(tuán)ACL10000血凝儀和相關(guān)的檢測(cè)試劑盒測(cè)定所述凝血因子的凝血活性，而FIXa和FXIa的測(cè)定是使用因子檢測(cè)試劑盒(BioMed)及其改進(jìn)版。FXIa的凝血活性是基于因子檢測(cè)試劑盒測(cè)定的，試劑盒附加了重組FIX并用FXIa濃縮液來校準(zhǔn)。雖然FIXa的初始校準(zhǔn)曲線只允許作1.0mIU/ml的較低檢測(cè)限分析，第二校準(zhǔn)曲線（“低校準(zhǔn)濃度曲線”）允許作0.32mIU/ml的較低檢測(cè)限分析。因此，在分析結(jié)果的表中兩個(gè)檢測(cè)限都能體現(xiàn)。結(jié)果匯總在表2。以“<”給出的值表明未達(dá)到檢測(cè)限，在表2中部分平均值顯示為低于檢測(cè)限的值，這表明并不是所有的值均低于檢測(cè)限，這些平均值計(jì)算為“＜”所示結(jié)果的檢測(cè)限的一半和高于檢測(cè)限的那些結(jié)果的實(shí)測(cè)值之和。對(duì)于含所述檢測(cè)限一半的計(jì)算值的另一種選擇是用檢測(cè)限的值進(jìn)行計(jì)算作為最壞情況模擬(worstcasescenario)，表現(xiàn)為0.015IU/mlFVII,8.4mIU/mlFVIIa,0.016IU/mlFIX,1.12mIU/mlFIXaand1.0mIU/mlFXIa。萬一有少許殘留的FII因子的存在濃度低于0.014IU/mL的檢測(cè)限，應(yīng)理解為，該量是在0.001至0.014IU/mlFII的范圍內(nèi)。其他因子同樣如此，F(xiàn)VII檢測(cè)限是0.015IU/mL和范圍是0.001至0.015IU/ml，F(xiàn)VIIa檢測(cè)限8.4mIU/ml和范圍0.1至8.4mIU/mL，F(xiàn)XI檢測(cè)限0.016IU/mL和范圍0.001至0.016IU/ml范圍，F(xiàn)IXa檢測(cè)限1.12mIU/mL和范圍0.01至1.12mIU/mL，F(xiàn)X檢測(cè)限0.015IU/ml和范圍0.001至0.015IU/ml，F(xiàn)XI檢測(cè)限0.014IU/ml和范圍0.001至0.014IU/ml。同樣對(duì)于FXIa，用低濃度校準(zhǔn)曲線測(cè)定，檢測(cè)限0.32mIU/mL和范圍0.01至0.32mIU/ml，而初始使用的校準(zhǔn)曲線只允許1mIU/ml檢測(cè)限，因此相應(yīng)的范圍是0.01至1mIU/ml。實(shí)施例1將來自血漿分級(jí)的I+II+III組分溶解，并冷卻至2-8℃，將pH保持恒定的4.80-4.95范圍內(nèi)，此時(shí)自該溶液抽取樣品A。辛酸鈉加入至終濃度20mmol/L，并將溶液攪拌90分鐘，然后過濾。抽取樣品B后，將過濾后的溶液加熱至21-27℃，將pH保持恒定在約4.9的給定范圍，再次加入辛酸鹽至20mmol/L的濃度。攪拌60分鐘，離心，從上清液中抽取樣品C，對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)。將上清液作進(jìn)一步處理：陰離子層析、病毒滅活（S/D處理）、超濾和滲濾、制成制劑、無菌過濾和灌裝到最終產(chǎn)品中。實(shí)施例2進(jìn)行基本上與實(shí)施例1相同的步驟，除了在第二步的沉降中每升溶液的辛酸鹽加入量為10mmol/L，而非調(diào)整為20mmol/L。實(shí)施例3和4：利用戊酸和癸酸的鈉鹽進(jìn)行與實(shí)施例2相同的步驟。上述實(shí)施例結(jié)果匯總為下列表格：表2：實(shí)施例1和實(shí)施例2所述的方法中，沒有觀測(cè)到凝血活性的顯著差異：雖然之后的實(shí)驗(yàn)（見表4至表7）顯示，在加入沉淀劑之前，源材料中的凝血因子濃度顯著較高，但本文所示的本發(fā)明方法設(shè)法去除了這些凝血因子。即使在IgG濃度為10％時(shí)也沒有檢測(cè)到凝血因子。表2表2（續(xù)）表3：根據(jù)實(shí)施例3和4的步驟：表4：pH值保持不變沉降表4（續(xù)）：pH值保持不變沉降表4（續(xù)）：pH值保持不變沉降表4（續(xù)）：pH值保持不變沉降表4（續(xù)）：pH值保持不變沉降表4（續(xù)）：pH值保持不變沉降表5：隨pH值增加的沉降表5（續(xù)）：隨pH值增加的沉降表6：隨pH值降低的沉降表6（續(xù)）：隨pH值降低的沉降表7：癸酸/鹽沉降表8：相同的起始材料進(jìn)行的辛酸沉降，pH值和濃度的影響