專利名稱：體外培養(yǎng)的組織工程血管的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種I型膠原及組織細(xì)胞在血管生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)生成的組織工程血管。有較強(qiáng)的力學(xué)性能，能夠承受跨壁壓カ和血流對血管壁的順應(yīng)力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。生物相容性較好。用于心腦血管疾病的血管移植物。屬于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病為代表的動(dòng)脈缺血性疾病是引起人類死亡的主要原因之一。其治療方法主要是進(jìn)行動(dòng)脈移植手木。另外先天性心臟病是一種常見的先天性畸形，需進(jìn)行手術(shù)矯治，一些復(fù)雜先心病手術(shù)也需應(yīng)用血管移植物。從前我們用的血管移植物多為高分子人工材料，如滌綸、聚四氟こ烯等，均表現(xiàn)出各自利弊?，F(xiàn)在國內(nèi)外采用最多的為同種血管，但同種血管來源有限，同時(shí)同種血管經(jīng)冷凍保存，雖祛除了大部分抗原物質(zhì)，但移植入體內(nèi)后，仍會(huì)產(chǎn)生一定的排異反應(yīng)，移植5-10年后鈣化、失去功能比例較高。異種血管來源方便，但因其移植后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排異反應(yīng)，而至今未能在臨床上應(yīng)用。自身血管臨床上應(yīng)用較多，但由于來源和強(qiáng)度的限制，仍不能達(dá)到滿意的效果。有鑒于此，開發(fā)構(gòu)建具有組織相容性好、具有生長潛能、不易鈣化和血栓形成、不易感染的組織工程血管變的尤為重要。由于天然血管主要有三層結(jié)構(gòu)且膠原為血管壁細(xì)胞外基質(zhì)中主要的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，占血管壁干重的20% _50%，故本公司利用膠原為基質(zhì)，結(jié)合天然血管主要細(xì)胞體外培養(yǎng)生長的特點(diǎn)，采用逐層構(gòu)建血管三層結(jié)構(gòu)的方法制得。此方法制得的組織工程血管有較強(qiáng)的力學(xué)性能，能夠承受跨壁壓カ和血流對血管壁的順應(yīng)力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。為血管移植術(shù)提供了安全有效的移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本材料選用了 I型膠原及組織細(xì)胞在血管生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的方法制成。能夠滿足天然血管的要求，達(dá)到很好的血管移植效果。主要操作步驟如下1、膠原溶液的制備市售I型膠原，浸泡于0. 001mol/L 1. Omol/L的醋酸溶液， 制得濃度為0.1 % 1. 0% (w/w)的膠原溶液。2、膠原溶液涂層根據(jù)所需血管的尺寸的不同，選擇不同尺寸的玻璃管道，將膠原溶液加入滾筒式攪拌器的玻璃管道中進(jìn)行滾動(dòng)涂層，直至形成均勻的膠原膜，然后倒去多余的膠原溶液。3、聚こニ醇涂層市售聚こニ醇用生理鹽水稀釋至濃度為0.1 % 1.0% (w/w),均勻滴在膠原膜上，然后滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。4、平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的種植受體骨髄中分化、提取平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，1. 25X 105個(gè)/ml的濃度加入平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d后同時(shí)按同樣的濃度種植成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。5、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子的種植在平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞種植完畢后將受體骨髓中提取的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子按5. Ong/ml 10. Ong/ml的濃度滴加進(jìn)滾筒攪拌器的玻璃管道內(nèi)，連續(xù)種植3d。6、組織工程血管的形成將組織細(xì)胞種植完畢的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)性能，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7d 21d。即可植入受體進(jìn)行使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、取市售I型膠原0. lg，浸泡在IOOml濃度為0. 2mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化 平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按9. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7d。實(shí)施例2、取市售I型膠原0. 2g，浸泡在IOOml濃度為0. 5mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14d。實(shí)施例3、取市售I型膠原1. Og，浸泡在IOOml濃度為0. Olmol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1.25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按10. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14d。實(shí)施例4、取市售I型膠原0. 5g，浸泡在IOOml濃度為0. 05mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇1. Og倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1.25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間Id0實(shí)施例5、取市售I型膠原0. 5g，浸泡在IOOml濃度為0. 05mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 2g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1.25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分 化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間21d。實(shí)施例6、取市售I型膠原0. 8g，浸泡在IOOml濃度為0. 9mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 8g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按6. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間15d。實(shí)施例7、取市售I型膠原0. 6g，浸泡在IOOml濃度為0. lmol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 3g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按8. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14d。實(shí)施例8、取市售I型膠原0. 2g，浸泡在IOOml濃度為0. 02mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進(jìn)滾筒式攪拌器的玻璃管道內(nèi)滾動(dòng)涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。按1.25X 105個(gè)/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細(xì)胞，連續(xù)種植2d，然后再同時(shí)按1. 25X 105個(gè)/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按10. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細(xì)胞的膠原膜取出放進(jìn)血管 生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間IOcL
權(quán)利要求
1. 一種I型膠原及組織細(xì)胞在血管生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的方法制成。此產(chǎn)品組織相容性好、具有生長潛能、不易感染、有較強(qiáng)的力學(xué)性能，能夠承受跨壁壓力和血流對血管壁的順應(yīng)力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。其特征包括下列步驟 (1)、市售I型膠原，浸泡于O.OOlmol/L 1. Omol/L的醋酸溶液，制得濃度為O. 1%~.1.0% (w/w)的膠原溶液。
(2)、根據(jù)所需血管的尺寸的不同，選擇不同尺寸的玻璃管道，將膠原溶液加入滾筒式攪拌器的玻璃管道中進(jìn)行滾動(dòng)涂層，直至形成均勻的膠原膜，然后倒去多余的膠原溶液。形成初步的膠原基質(zhì)層。
(3)、市售聚乙二醇用生理鹽水稀釋至濃度為O.1 % 1. O % (w/w)，均勻滴在膠原膜上，然后滾筒式攪拌器滾動(dòng)涂層。完成為平滑肌細(xì)胞的粘附增長提供保障。
(4)、將從受體骨髓中分化提取的平滑肌細(xì)胞按1.25 X IO5個(gè)/ml的濃度種植在涂了聚乙二醇的膠原膜上，連續(xù)種植2d后同時(shí)按同樣的濃度種植從受體骨髓中分化提取的成纖維細(xì)胞。分別連續(xù)種植3d。完成血管外圍兩層結(jié)構(gòu)的組織細(xì)胞的種植。
(5)、將受體骨髓中提取的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子按5.Ong/ml .10.Ong/ml的濃度滴加進(jìn)滾筒攪拌器的玻璃管道內(nèi)，連續(xù)種植3d。完成血管內(nèi)層組織細(xì)胞的種植。
(6)、將組織細(xì)胞種植完畢的膠原膜取出放進(jìn)血管生物反應(yīng)器中，模擬人體血管所應(yīng)承受的力學(xué)參數(shù)，及血液流動(dòng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7d 21d。形成了體外培養(yǎng)的組織工程血管?？芍踩胧荏w進(jìn)行使用。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種可用于臨床血管移植手術(shù)的血管移植物及其制備方法。屬于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域。主要解決目前臨床中自體血管取材受限，手術(shù)繁雜；異體血管風(fēng)險(xiǎn)高和高分子材料植入體內(nèi)順應(yīng)性差或者鈣化等問題。通過根據(jù)天然血管不同結(jié)構(gòu)不同組織細(xì)胞的特點(diǎn)，分三層種植受體自身組織細(xì)胞，最終模擬體內(nèi)血管所應(yīng)承受力學(xué)參數(shù)及血流情況制備而成，達(dá)到自體血管修復(fù)的目的。通過此方法制備所得的材料是I型膠原及受體自身組織細(xì)胞在血管生物反應(yīng)器培養(yǎng)而成，接近自體血管，生物相容性好，具有生長潛能，不易感染、有較強(qiáng)的力學(xué)性能，能夠承受跨壁壓力和血流對血管壁的順應(yīng)力，有較好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，有利于血管移植手術(shù)的血管修復(fù)。
文檔編號(hào)A61F2/06GK103006349SQ20121058960
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者萬力, 張春紅 申請人:天津市賽寧生物工程技術(shù)有限公司