一種大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥類技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]心血管疾病是對人類健康構(gòu)成極大威脅的一類疾病。動脈粥樣硬化病變的形成和血管損傷后的血管再生都涉及到血管內(nèi)皮細胞的活化，血管內(nèi)皮細胞是血管病理研宄的理想工具細胞，因此如何容易、穩(wěn)定地獲得純化的血管內(nèi)皮細胞一直是一個熱門研宄方向。目前有大量的文獻資料報道人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法及其廣泛的運用于血管病理研宄，但由于人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞來源于靜脈而非動脈，所以限制了它的研宄價值；同期還有文獻資料報道來源于鼠類、眼球和肺部的血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)方法，但是大多數(shù)原代培養(yǎng)方法都要求特殊的儀器，例如磁珠、特異抗體、FACS select1n等。
[0003]長期以來，由于鼠胸主動脈管徑細小，肋間動脈分支多，雖然有采用酶消化和內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)等方法，但胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的原代分離培養(yǎng)仍存在細胞獲得率和純度較低等問題，使其應(yīng)用受到限制。消化過程中還需要翻轉(zhuǎn)血管，不僅增加污染的風(fēng)險，亦直接影響內(nèi)皮細胞的活力。內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)法為近些年被更多采用的方法，可以獲取較高純度的血管內(nèi)皮細胞原代分離培養(yǎng)方法，但該方法的關(guān)鍵點是需要將血管內(nèi)膜翻出。翻出過程中難以避免細胞間的摩擦，增加了細胞損傷和污染的幾率。160-220g大鼠主動脈管徑僅約2mm，加之血管壁自身厚度，因此內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)的操作成功率較低并且對取材血管亦未充分利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的:一種大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0006](I)取大鼠主動脈，用無菌PBS液進行沖洗，然后將其沉浸在含肝素的DMEM/F12培養(yǎng)液中以備用；
[0007](2)利用無菌針線將主動脈內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來，并在兩端打結(jié)；
[0008](3)將翻轉(zhuǎn)后的主動脈放在II型膠原酶中消化；
[0009](4)在37°C溫箱中培育后，將被消化的主動脈放入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，將主動脈兩端結(jié)點剪去使其成為中空管狀樣，沿縱向剪開并將其分割成小塊的主動脈薄片備用；
[0010](5)將主動脈薄片進行貼壁培養(yǎng)，所述主動脈薄片的主動脈內(nèi)膜部分浸入含肝素和血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每隔48h更換一次培養(yǎng)液；
[0011](6)第3-5天，移除主動脈薄片，之后每天更換培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液與步驟(5)相同，第9天即可獲得大量的血管內(nèi)皮細胞，第14天后可用于細胞傳代。
[0012]進一步，所述步驟(I)中的DMEM/F12培養(yǎng)液含1000U/ml肝素。
[0013]進一步，所述步驟(3)中膠原酶為II型膠原酶或I型膠原酶，所述膠原酶的濃度為 2g/Lo
[0014]優(yōu)選的，所述步驟⑷中37 °C溫箱中培育60分鐘。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟(4)的主動脈可分割為4 一 5塊主動脈薄片，所述主動脈薄片的大小為2cm*4cm，該大小得主動脈薄片非常適用于初級貼壁培養(yǎng)。
[0016]進一步，所述步驟(5)的DMEM/F12培養(yǎng)液中血清含量為20%、肝素含量為50ug/ml ο
[0017]優(yōu)選的，所述步驟(2)中利用無菌針線將主動脈內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來，并在兩端打結(jié)的具體方法為:用一根無菌細針系上4-0尼龍線，將無菌針線穿過主動脈內(nèi)腔，穿過后將無菌針剪下，利用尼龍線在主動脈一末端打結(jié)固定；利用眼科鑷固定尼龍線未打結(jié)的一端，然后利用另一個眼科鑷將分離的主動脈沿打結(jié)端翻轉(zhuǎn)，輕輕的拉扯主動脈外膜直到整個主動脈是主動脈內(nèi)膜朝外主動脈外膜朝內(nèi)，將翻轉(zhuǎn)后的主動脈未打結(jié)的一端打結(jié)。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟(5)中貼壁培養(yǎng)的方式為，將主動脈薄片平鋪在六孔板上，六孔板中每孔加入800ul含肝素和血清的DMEM/F12培養(yǎng)液以便僅僅使主動脈內(nèi)膜沉浸在培養(yǎng)液中，而不是包括主動脈外膜的整個主動脈沉浸其中。整個過程中，需保持主動脈薄片始終貼壁，更換培養(yǎng)液時也需要防止移動主動脈薄片。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟￠)中移除主動脈薄片后，每天更換培養(yǎng)液，加入量為3ml/孔。
[0020]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法具有以下優(yōu)勢:
1.操作簡單快捷，可重復(fù)性高，實驗所需時間短，大大減少污染和對內(nèi)皮細胞活性的影響；
2.所需血管量少，充分利用了取材血管，每次分離培養(yǎng)取一只大鼠胸主動脈即可分割成4-5小塊，一小塊組織可以穩(wěn)定容易的獲得大量血管內(nèi)皮細胞；3.利用血管內(nèi)皮細胞最先長出的特點，適時棄去組織塊，減少了成纖維細胞及平滑肌細胞的污染機會；4.加入定量的培養(yǎng)液，僅僅使內(nèi)膜與培養(yǎng)液接觸，避免外膜接觸培養(yǎng)液，可減少外膜細胞等的污染機會；5.培養(yǎng)液中無須加入促生長因子類物質(zhì)，使本方法更為經(jīng)濟實用；6.利用無菌針線將血管內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)出來，可以最大程度的避免細胞間的摩擦和損傷，同時因為針線都是無菌的，所以細胞污染的幾率非常低，而且此方法翻轉(zhuǎn)操作的成功率接近100%。
【附圖說明】
:
[0021]圖1為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第三天后，*100鏡下照片
[0022]圖2為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第三天后*200鏡下照片
[0023]圖3為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第三天后*400鏡下照片
[0024]圖4為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第四天后*100鏡下照片
[0025]圖5為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第四天后*200鏡下照片
[0026]圖6為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第四天后*400鏡下照片
[0027]圖7為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第五天后*100鏡下照片
[0028]圖8為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第五天后*200鏡下照片
[0029]圖9為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第五天后*400鏡下照片
[0030]圖10為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第七天后*100鏡下照片
[0031]圖11為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第七天后*200鏡下照片
[0032]圖12為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第七天后*100鏡下照片
[0033]圖13為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第九天后*100鏡下照片
[0034]圖14為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第九天后*200鏡下照片
[0035]圖15為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第九天后*400鏡下照片
[0036]圖16為原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第十四天后*100鏡下照片
[0037]圖17為⑶31抗體免疫細胞化學(xué)SABC顯色照片
[0038]圖18為⑶31抗體免疫細胞化學(xué)FITC熒光二抗分析照片
[0039]圖19為從大鼠胸主動脈分離的原代內(nèi)皮細胞及傳代培養(yǎng)細胞，在Matrigel基質(zhì)膠中培養(yǎng)2h后照片
[0040]圖20為從大鼠胸主動脈分離的原代內(nèi)皮細胞及傳代培養(yǎng)細胞，在Matrigel基質(zhì)膠中培養(yǎng)6h后照片
[0041]圖21為實施效果例4中1-3代細胞的生長曲線，其中系列I為血管內(nèi)皮細胞第一代；系列2為血管內(nèi)皮細胞第二代；系列3為血管內(nèi)皮細胞第三代
【具體實施方式】
[0042]實施例1
[0043]大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法包括如下步驟:
[0044]1、取大鼠主動脈，用無菌PBS液沖洗分離的主動脈兩次，然后將其沉浸在DMEM/F12含1000U/ml肝素培養(yǎng)液中以備用。
[0045]2、一根無菌細針系上4-0尼龍線備用，將無菌針線穿過主動脈內(nèi)腔，穿過后將無菌針剪下，利用尼龍線在主動脈一末端打結(jié)固定。利用眼科鑷固定尼龍線未打結(jié)的一端，然后利用另一個眼科鑷將分離的主動脈沿打結(jié)端翻轉(zhuǎn)，輕輕的拉扯主動脈外膜直到整個主動脈是主動脈內(nèi)膜朝外主動脈外膜朝內(nèi)，將翻轉(zhuǎn)后的主動脈未打結(jié)的一端打結(jié)。
[0046]3、將打結(jié)翻轉(zhuǎn)后的主動脈放在II型膠原酶中消化以便主動脈內(nèi)膜完全的接觸膠原酶，II