專利名稱：枳實(shí)在制備抗朊病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及枳實(shí)及其提取物在制備抗朊病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
朊病毒是一類能在動(dòng)物和人中引起可傳染性腦病(包括瘋牛病、羊搔癢癥、庫(kù)魯病、克雅氏病等)的病原體，其高度傳染性和致死性對(duì)整個(gè)社會(huì)造成了極大的危害。朊病毒(PrP)在體內(nèi)以兩種不同的構(gòu)象存在。正常構(gòu)象的朊病毒(PrPC)含有43%的α螺旋和3%的β折疊，在體內(nèi)以單體的形式出現(xiàn)，并行使正常的細(xì)胞功能，不具有致病性。而朊病毒一旦在某種條件下錯(cuò)誤折疊后形成致病性構(gòu)象(PrPSc)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，α螺旋降到了 30%，而β折疊的含量增至45%，大量的非常穩(wěn)定的β片狀折疊狀構(gòu)造能以自身為模板，誘導(dǎo)正常朊病毒的構(gòu)象發(fā)生致病性轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步在具有致病性構(gòu)象的朊病毒分子間通過“交聯(lián)β折疊片(cross-β sheet)”聚集,形成淀粉狀纖維(amyloid fiber)的有毒片斷，進(jìn)而以塊狀高聚體形式(plaque)出現(xiàn)，最終誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺死腦神經(jīng)細(xì)胞而導(dǎo)致一系列致死性疾病。酵母朊病毒和]的細(xì)胞中Sup35p以不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)存在，這與哺乳動(dòng)物朊病毒的典型特性相一致。在的細(xì)胞中，大多數(shù)的Sup35p呈聚集的纖維狀，對(duì)翻譯終止是無(wú)效的。而且，聚集的Sup35p會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)新生成的Sup35p也發(fā)生同樣的構(gòu)象改變，從而保證[/^T]的穩(wěn)定遺傳。同PrP —樣，當(dāng)正常的Sup35p與另一個(gè)朊病毒型的Sup35p相接觸時(shí)，它將由可溶型轉(zhuǎn)變成聚集型。在的細(xì)胞中，大多數(shù)的Sup35p采取了朊病毒構(gòu)象并參與到聚集物的形成中去而不能在翻譯終止過程中正確的與終止復(fù)合物結(jié)合而行使功能，于是導(dǎo)致了核糖體通讀終止密碼子的趨勢(shì)增加，從而生產(chǎn)出具有多余片段的蛋白質(zhì)，使[/^r]在蛋白質(zhì)合成的精確度上產(chǎn)生了可遺傳的改變。因此[/^r]能夠合成adel (或ade2)蛋白質(zhì)，并正常合成出腺嘌呤,從而能夠在SD-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而在[psi_]細(xì)胞中，Sup35p處于正常狀態(tài)，能夠使核糖體由信使RNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程通常結(jié)束于終止密碼子，即發(fā)生了無(wú)義突變，所以細(xì)胞不具有adel酶，而不能合成自身的腺嘌呤，因而不能在SD-Ade培養(yǎng)基上生存。如果菌株生長(zhǎng)在1/2YPD培養(yǎng)基，被阻斷的生物合成途徑就導(dǎo)致了一個(gè)中間產(chǎn)物AIR的積累，這個(gè)中間產(chǎn)物可以經(jīng)過轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生紅色素，因?yàn)榫哂卸拘远患?xì)胞排出體外。這為監(jiān)控Sup35p的狀態(tài)提供了很方便的通過顏色辨別[/^T]的方法——[PSI+]菌株是白色的，或者是有些偏粉紅色，而L^i_]菌株是紅色的。基于Wickner等發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞攜帶[/^T+]、[URE3]等與動(dòng)物朊病毒聚集、傳播機(jī)制相似的朊病毒，這些朊病毒具有各自的表型特征，Lindguist等進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母朊病毒對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞及個(gè)體的安全性，并發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞具有與哺乳類細(xì)胞相似的朊病毒形成的胞內(nèi)環(huán)境。2003年Blondel等利用野生型酵母朊病毒[/^T]、[URE3]細(xì)胞為模型，在2500多種化學(xué)藥物中篩出了 6種抗酵母朊病毒聚集的化合物，并證明這些化合物在動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)于動(dòng)物朊病毒同樣有抗聚集作用。2007年Tessier P.和Lindquist S.博士進(jìn)一步利用基因重組的酵母朊病毒[PSI+]核心片斷建立了一個(gè)細(xì)胞外的抗朊病毒藥物篩選模型。2008年Blondel Μ.博士利用前期建立的酵母細(xì)胞篩選方法又篩選出了兩種有效的抗酵母朊病毒的化合物，并證實(shí)其中一種對(duì)抗哺乳動(dòng)物朊病毒同樣有效。這些研究強(qiáng)烈地暗示著建立在酵母細(xì)胞上的抗朊病毒藥物篩選模型完全可以取代動(dòng)物細(xì)胞模型，而且在操作的安全性上有強(qiáng)大的保障。以該模型為核心建立的抗朊病毒藥物篩選平臺(tái)，相對(duì)于傳統(tǒng)的建立在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上藥物篩選平臺(tái)，在篩選藥物效率上具有高效性；對(duì)操作者及周圍環(huán)境具有極高的安全性；對(duì)于藥物的廣譜篩選具有靈敏性；對(duì)于反效藥物具有可識(shí)別性；對(duì)于藥物篩選中的假陽(yáng)性、假陰性具有較高的辨別能力；而且更有利于大規(guī)模生產(chǎn)推廣，具有經(jīng)濟(jì)性。因此，利用酵母抗朊病毒篩選平臺(tái)是得到有效治療朊病毒藥物的新方法。基于朊病毒具有高度傳染性和致死性，篩選和研發(fā)具有預(yù)防和治療朊病毒引發(fā)疾病的藥物，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種枳實(shí)及其提取物的應(yīng)用，其具有顯著的抗朊病毒的效
果O本發(fā)明采用的技術(shù)方案是枳實(shí)或其提取物在制備抗朊病毒藥物中的應(yīng)用。枳實(shí)提取物的制備枳實(shí)經(jīng)過粉碎后，加入蒸餾水，于95°C回流提取3小時(shí)，抽濾并回收濾液；濾液減壓濃縮，干燥，得枳實(shí)提取物。枳實(shí)，為蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果。含有酸橙果實(shí)含檢皮式，新橙皮式，油皮式，辛弗林，N-甲基酪胺等。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
I.植物體生物利用率高，效果顯著，本發(fā)明采用水提法進(jìn)行提取，枳實(shí)的活性
成分溶出率高。通過應(yīng)用現(xiàn)代藥理試驗(yàn)方法對(duì)枳實(shí)提取物的活性進(jìn)行檢測(cè)，該提取物具有顯著的抗朊病毒作用，可以作為制備抗朊病毒的藥物。2.原料來源廣泛,安全性高。枳實(shí)主產(chǎn)于主產(chǎn)于四川、江西、福建、江蘇等地，因此資源豐富。3.發(fā)展前景廣闊，開辟了一條利用天然植物的提取物治療朊病毒或病毒性疾病的新途徑。并且可以通過進(jìn)一步分離純化提取物中的活性成分，為設(shè)計(jì)開發(fā)出更高效的治療朊病毒或病毒性疾病的藥物奠定基礎(chǔ)。


圖I是枳實(shí)提取物作用第3天后觀察ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞菌落顏色變化照片。圖2是枳實(shí)提取物作用第5天后觀察ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞菌落顏色變化照片。
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I
(一)枳實(shí)提取物的制備
枳實(shí)經(jīng)過粉碎后，準(zhǔn)確稱量枳實(shí)粉末10 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，在95°C回流提取3小時(shí)，抽濾并回收濾液；濾液減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮液置于潔凈小瓶中，于60°C過夜干燥，得枳實(shí)提取物。將枳實(shí)提取物30°C放置至恒重并稱量。用盡可能少量的蒸餾水溶解枳實(shí)提取物，得藥液。計(jì)算藥液的濃度為含枳實(shí)提取物I. 26 g/ml，供以下實(shí)驗(yàn)。(二)實(shí)驗(yàn)
I、ERG6 Δ \_psn酵母細(xì)胞的活化在無(wú)菌操作條件下，挑取3個(gè)以上的ERG6 Δ [PSH酵母細(xì)胞放入裝有1/2YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C振蕩過夜培養(yǎng)。2、ERG6 Δ [PSH酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試取上述培養(yǎng)的ERG6 Δ {PSH酵母細(xì)胞懸液放入比色杯中，使用紫外分光光度計(jì)，用1/2YH)液體培養(yǎng)基調(diào)零，UV設(shè)置在600nm，測(cè)量酵母細(xì)胞懸液的OD值，加入酵母細(xì)胞懸液或1/2YPD液體培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)OD值至O. 5。
3、實(shí)驗(yàn)取3支無(wú)菌凍存管，分別加入上述調(diào)試好的ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞懸液各ΙΟΟμ 1，上述制備的含有枳實(shí)提取物1.26g/ml的藥液50 μ I (終濃度為O. 063g/ml)、100 μ I (終濃度為 O. 126g/ml)U50y I (終濃度為 O. 189g/ml)，及 1/2YH)培養(yǎng)液 850 μ I、800μ 1、750μ I。陰性對(duì)照為(IOOul細(xì)胞懸液+900ul 1/2YPD);陽(yáng)性對(duì)照為(IOOul細(xì)胞懸液+895ul l/2YPD+5ul Imol/LGuHcl );在24°C的條件下，振蕩培養(yǎng)5天。每天定時(shí)稀釋ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，即取前一天凍存管中的ERG6 Δ [PSH酵母細(xì)胞100 μ I放入新的裝有和上述同樣含量的1/2YPD培養(yǎng)液和藥液的無(wú)菌凍存管中。4、檢測(cè)取第三天和第五天培養(yǎng)的凍存管中的ERG6A酵母細(xì)胞懸液適量，稀釋IO4倍后，取100 μ I稀釋液在1/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞懸液的培養(yǎng)皿置于24°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，觀察ERG6 Δ [PSI+]酵母細(xì)胞菌落的顏色變化。結(jié)果見圖I和圖2。5、檢驗(yàn)假陽(yáng)性隨機(jī)選取枳實(shí)提取物治愈酵母朊病毒效果最佳平板上出現(xiàn)的紅色顏色的菌落，劃線于1/2YPD固體平板上，然后影印到SD-Ade平板上，于24°C培養(yǎng)3天。6、結(jié)果鹽酸胍為已知的具有抗朊病毒作用的藥物，從圖I和圖2可見，其菌落顏色為紅色。菌落為紅色表示該藥物具有抗朊病毒的作用，菌落仍為粉色表示該藥物對(duì)于朊病毒無(wú)作用。從圖I和圖2可見，含有枳實(shí)提取物的藥液在培養(yǎng)3天之后，菌落大部分為白色，有少部分菌落為粉色；在培養(yǎng)5天之后，菌落大部分為紅色，極少部分為白色和粉色；隨機(jī)選取的紅色菌落在SD-Ade固體培養(yǎng)基上并沒有生長(zhǎng)。說明枳實(shí)提取物在培養(yǎng)5天之后對(duì)朊病毒具有療效。對(duì)朊病毒ERG6 △ 的治愈率公式愈率=變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)X 100%ο結(jié)果見表I。
權(quán)利要求
1.枳實(shí)或其提取物在制備抗朊病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述的枳實(shí)提取物的制備方法如下枳實(shí)粉碎后，加入蒸餾水，于95°C回流提取3小時(shí)，抽濾，回收濾液，濾液減壓濃縮，干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及枳實(shí)在制備抗朊病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)植物體生物利用率高，采用水提法進(jìn)行提取，枳實(shí)的活性成分溶出率高，提取物具有顯著的抗朊病毒的作用；原料來源廣泛，安全性高。本發(fā)明開辟了一條利用天然植物的提取物治療朊病毒或病毒性疾病的新途徑。
文檔編號(hào)A61K131/00GK102940712SQ201210521908
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者宋有濤, 李輝, 沈曼莉, 卜祥龍 申請(qǐng)人:遼寧大學(xué)