專利名稱：一種山豆根抗腫瘤有效組分提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及山豆根抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
目前由于環(huán)境污染的加劇，生活節(jié)奏的加快，生活壓力的增大，癌癥的發(fā)生率處于上升的趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，到2020年前，全球癌癥發(fā)病率將增加50%，尋找有效的抗腫瘤藥物與方法，徹底攻克腫瘤，是世界醫(yī)學界重要的研究課題。近幾年，我國癌癥發(fā)病率以每年2. 5%的速度增加，所以加快抗癌藥物的研究顯得更為緊迫。近些年來，中藥抗腫瘤制劑成為新藥研發(fā)的熱點，其中既有中藥提取的有效成分、有效部位制劑，也有傳統(tǒng)的中藥復方制劑。
山豆根為豆科植物越南槐Sophorae tomkinensis Gapnep.的干燥根及根莖,主要分布于廣西、貴州、廣東、江西等省，別名山大豆根、苦豆根。藥性苦寒，有毒，歸肺胃經(jīng)，具有清火、解毒、消腫、止痛之功效。山豆根在臨床上多用于咽喉腫痛、牙齦腫痛、病毒性肝炎、濕熱黃疸等多種疾病的治療。研究表明，山豆根主要含生物堿、黃酮及多糖類成分。目前從山豆根分離得到生物堿類成分有20多種，以苦參堿、氧化苦參堿為主，還有少量的臭豆堿、金雀花堿、槐氨、槐醇槐、果堿、甲基金雀花堿、氧化槐果堿等[參見竇金輝，李家實，閻文玫.山豆根生物堿成分的研究[J].中國中藥雜志，2006，(19)5:40]。從山豆根中分離得到的黃酮有高麗槐素、槲皮素、柔枝槐酮、柔枝槐素、紅車軸草苷、紫檀素、料木素、芒柄花素、金雀異黃素、山槐素、光甘草酚、槐定、槐多色烯、槐酮，baying等[參見鄧銀華，徐康平，章為等.山豆根化學成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17 (2): 172]。此外，從山豆根還分離得到的多糖組分有 8 種，分別為 SSa-1，SSa-2，SSa_3，SSb-1 FA, SSb-2, SSb-3, SSc_l，它們分屬于淀粉、類淀粉、半纖維素、果膠，其中淀粉的含量最多，其次為果膠類多糖[參見董群，方積年.山豆根多糖的性質(zhì)和化學組成[J].中國藥學雜志，2001，(36)2:85]。已有動物實驗表明，山豆根提取物對在體腫瘤生長有較好的抑制作用，其水提物能抑制多種腫瘤生長[參見Chui C H, Lau F Y, Tang J C，et al. Activities offreshjuice of Scutellaria barbata and warmed water extract of Radix SophoraeTonkinensison ant1-proliferation and apotosis of human cancer cell line[J].1nt J MolMed，2005，16(2):337]?？鄥A對人胰腺癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素癌等多種癌細胞株均有抑制和殺傷作用[參見Liu T, Song Y，Chen H，et al. Matrineinhibitsproliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells in vitroand in vivo [ j] . Biol Pharm Bull，2010，33 (10) : 1740] 氧化苦參堿對人結(jié)腸癌、食管癌等多種癌細胞株亦有殺傷作用[參見Zou Jj Ran Z H，Xu Q，et al. Experimental studyofthe killing effects of oxymatrine on human colon cancer cell line SW1116[J].Chin JDig Dis，2005，6 (I) : 15.]。此外，姚仲青等通過建立小鼠肉瘤S180、肝癌H22、艾氏實體型腫瘤(ESC)模型，從整體水平觀察山豆根總生物堿對腫瘤生長的影響，結(jié)果表明，山豆根總生物堿具有一定的體內(nèi)抗腫瘤作用，但腫瘤抑制率不高，且在用藥過程中發(fā)現(xiàn)動物有抽搐驚厥現(xiàn)象[參見姚仲青，朱虹，王光鳳.山豆根總生物堿抗腫瘤作用的初步研究[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2005，21 ⑷253]。中國專利申請?zhí)朇N200610136992.6《一種山豆根提取物的精制工藝》公開了一種山豆根提取物的精制工藝，該工藝是采用二次柱色譜法進行分離提純，收集40 60%乙醇洗脫液作為山豆根提取物。專利申請?zhí)朇N200910054292.6《山豆根總黃酮及黃酮鹽及其制備方法》涉及山豆根總黃酮及黃酮鹽及其提取方法。該提取方法是山豆根原料先用無機酸或有機酸水溶液提取，提取后的殘留物再用有機溶劑或無機堿溶液提取，得到總重量計80%總黃酮的山豆根總黃酮及黃酮鹽產(chǎn)物。以上專利均只涉及山豆根的部位提取，未涉及活性成分的篩選和抗腫瘤部分的制法。專利申請?zhí)朇N200710123268. 4《一種山豆根的有效組分及其制備方法與用途》涉及一種山豆根的有效組分及其制備方法與用途，該發(fā)明的山豆根有效組分，用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對山豆根進行提取，然后將提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液，再用制備液相色譜梯度洗脫，得到有效組分。該專利提取劑與本發(fā)明不同，亦未見提取物針對對U251細胞的體外抗腫瘤實驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是，提供山豆根抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法。本發(fā)明的目的之二是，提供所說有效組分提取物在制備抗腫瘤及相關(guān)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種山豆根抗腫瘤有效組分提取物，它是由山豆根粉碎后，用水于90-100°C加熱提取，提取液濃縮，醇沉，離心除去沉淀，減壓濃縮除去乙醇，得提取液；或者用40% 95%乙醇于80°C水浴加熱提取，冷卻，離心，濃縮除去乙醇，得提取液；用乙酸乙酯萃取提取液，乙酸乙酯萃取液進行硅膠柱分離，洗脫劑為不同體積比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為50 I比例的洗脫液，回收有機溶劑后即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。一種制備上述山豆根抗腫瘤有效組分提取物的方法，它包括如下步驟步驟1:將山豆根粉碎，用水回流提取，冷卻，離心，濃縮提取液，用95%乙醇進行醇沉，離心除去沉淀，濃縮除去乙醇，得提取液；或者用40% 95%乙醇于80°C水浴加熱提取，冷卻，離心，濃縮除去乙醇，得提取液；步驟2 :將步驟I的提取液依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯萃取液進行硅膠柱分離，洗脫劑為不同體積比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為50 I比例的洗脫液，回收有機溶劑后即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。本發(fā)明進一步提供了山豆根抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。以抑制U251增殖能力為活性指標進行抗腫瘤活性實驗。實驗結(jié)果表明，在體外細胞毒性實驗中，可以明顯抑制U251的增殖，具有細胞毒性作用，可用于制備抗腫瘤治療藥物。有益效果(I)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)山豆根水提液的乙酸乙酯萃取液具有抗腫瘤活性，并首次在U251 (膠質(zhì)瘤細胞)上進行藥效篩選，證明其具有體外抑制U251生長的活性，適宜開發(fā)成抗腫瘤中藥新藥。(2)本發(fā)明拓展了抗腫瘤藥物的原料渠道，擴大了山豆根的用途，使山豆根發(fā)展成為抗腫瘤藥物的新原料，可顯著提高山豆根的附加值。
具體實施例方式以下所列實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1.山豆根抗腫瘤有效組分提取物的制備
將山豆根干燥粉碎，取藥粉500g，用10倍質(zhì)量的水回流提取2h，離心后的殘渣重復提取I次，離心，合并二次水提取液，濃縮至300ml，加95%乙醇進行醇沉，藥液中乙醇的濃度約為60%，靜置過夜，離心，棄去沉淀，減壓回收乙醇，繼續(xù)濃縮至150ml，加等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并提取液，濃縮，真空干燥，得乙酸乙酯提取物約8. 21g。上述乙酸乙酯提取物過硅膠柱，配制不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液(100 1,50 1,20 I, 10 1,5 I, I I)各 300ml，收集比例為 50 I 的洗脫液，濃縮，真空干燥，得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。實施例2.山豆根抗腫瘤有效組分提取物的制備將山豆根干燥粉碎，取藥粉400g，用10倍量的水回流提取2h，離心后的殘渣重復提取I次，離心，合并二次水提取液，濃縮至300ml，加95%乙醇進行醇沉，藥液中乙醇的濃度約為60%，靜置過夜，離心，棄去沉淀，減壓回收乙醇，繼續(xù)濃縮至150ml。用等體積石油醚萃取3次，收集萃取后的水層，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并提取液，濃縮，真空干燥，得乙酸乙酯萃取物。將乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱分離，用不同比例的二氯甲烷-甲醇(100 1,50 1,20 1,10 1,5 1,1 I)洗脫，收集50 I比例的洗脫液，即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。通過薄層分析，該有效組分提取物與實例I中的有效組分提取物有相同斑點。實施例3.山豆根抗腫瘤有效組分提取物的制備將山豆根干燥粉碎，取400g藥粉，用10倍質(zhì)量的45%乙醇回流提取3h，離心后的殘渣重復提取I次，離心，合并二次醇提取液，濃縮至無醇味，加水至300ml，離心，棄去沉淀，繼續(xù)濃縮至150ml，加等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物過硅膠柱，配置不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液(100 1,50 1,20 I, 10 I, 5 I, I I)各 300ml，收集比例為 50 I 的洗脫液，濃縮，真空干燥，得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。通過薄層分析，該有效組分提取物與實例I中的有效組分提取物有相同斑點。實施例4.山豆根抗腫瘤有效部位提取物的制備將山豆根干燥粉碎，取500g藥粉，用10倍質(zhì)量的95%乙醇回流提取3h，離心后的殘渣重復提取I次，離心，合并二次醇提取液，濃縮至無醇味，加水至300ml，離心，棄去沉淀，繼續(xù)濃縮至150ml，用等體積石油醚萃取3次，收集萃取后的水層，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并提取液，濃縮，真空干燥，得得乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物過硅膠柱，配制不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液(100 1,50 1,20 I)各300ml，收集比例為50 I的洗脫液，濃縮，真空干燥，得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。
通過薄層分析，該有效組分提取物與實例I中的有效組分提取物有相同斑點。實施例5抗腫瘤活性實驗以實施例1和實施例3得到的山豆根有效組分提取物為受試藥物，體外培養(yǎng)U251，取指數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后，1500r . HiirT1離心5min，將細胞重懸于培養(yǎng)基中，細胞濃度調(diào)至2 X IO4個/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ I，放置細胞培養(yǎng)箱(37°C，5%C02)中培養(yǎng)24h，之后加入受試藥物20 μ 1，陰性對照組加入終濃度為O. 5%DMS0,各組均設(shè)3個復孔。在加藥48h后，每孔加入5mg .1iiL-1MTT試劑20μ 1，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)4h。每孔加入DMS0100 μ 1，振蕩混勻，測定各孔在波長570nm處的吸光度值。計算細胞增殖抑制率抑制率(％) = (1-實驗組吸光度/對照組吸光度)X 100%。表I山豆根提取物抗腫瘤活性實驗(U251)
權(quán)利要求
1.一種山豆根抗腫瘤有效組分提取物，其特征是它是由山豆根粉碎后，用水于 90-100°C加熱提取，提取液濃縮，醇沉，離心除去沉淀，減壓濃縮除去乙醇，得提取液；或者用40% 95%乙醇于80°C水浴加熱提取，冷卻，離心，濃縮除去乙醇，得提取液；用乙酸乙酯萃取提取液，乙酸乙酯萃取液進行硅膠柱分離，洗脫劑為不同體積比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為50 I比例的洗脫液，回收有機溶劑后即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的山豆根抗腫瘤有效組分提取物的方法，其特征是它包括如下步驟步驟1:將山豆根粉碎，用水回流提取，冷卻，離心，濃縮提取液，用95%乙醇進行醇沉， 離心除去沉淀，濃縮除去乙醇，得提取液；得提取液；或者用40% 95%乙醇于80°C水浴加熱提取，冷卻，離心，濃縮除去乙醇，得提取液；步驟2 :將步驟I的提取液依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯萃取液進行硅膠柱分離，洗脫劑為不同體積比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為50 I 比例的洗脫液，回收有機溶劑后即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。
3.權(quán)利要求1所述的山豆根抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征是所述抗腫瘤藥物為抗腫瘤細胞U251的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了山豆根提取物抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法，該提取物通過水提取，提取液濃縮，醇沉，離心除去沉淀，減壓濃縮除去乙醇，得提取液；或者用40%～95%乙醇于80℃水浴加熱提取，冷卻，離心，濃縮除去乙醇，得提取液；用乙酸乙酯萃取提取液，乙酸乙酯萃取液進行硅膠柱分離，洗脫劑為不同體積比的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為50∶1比例的洗脫液，回收有機溶劑后即得山豆根抗腫瘤有效組分提取物。本發(fā)明的山豆根抗腫瘤有效組分提取物，在體外細胞毒實驗中，具有明顯的抑制U251(膠質(zhì)瘤細胞)的作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號A61P35/00GK103006761SQ20121052085
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者余江南, 郭林豐, 徐希明, 童姍姍, 張輝云 申請人:江蘇大學