專利名稱：草烏活性成分的提取純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種草烏活性成分的提取純化工藝，特別是涉及用大孔樹脂純化草烏活性烏頭堿的純化工藝的方法。
背景技術(shù)：
草烏為毛茛科多年生野生植物北烏頭ia kusnezoffii Reichb.的塊根。性味辛、苦，熱。有大毒。歸心、肝、腎、脾經(jīng)。能祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，用于風(fēng)寒濕痹，關(guān)節(jié)疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛，跌打損傷疼痛，有麻醉止痛的作用。草烏發(fā)揮藥效的主要成分為其所含的總烏頭堿，2010版藥典規(guī)定用烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿控制生草烏的質(zhì)量，此三種雙酯型烏頭堿為其活性成分及毒性成分。因生草烏毒性很大，難以制成直接給藥制劑，2010版藥典規(guī)定用苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿控制草烏的質(zhì) 量，此三種單酯型烏頭堿為生草烏雙酯型烏頭堿的水解產(chǎn)物，毒性降低，可制成直接給藥制齊U。但在實(shí)際生產(chǎn)中由于雙酯型烏頭堿極易水解得到單酯型烏頭堿，因此六種活性烏頭堿往往同時(shí)存在，在以前的研究中，大都以總烏頭堿衡量其純度，不僅大孔樹脂的純化能力不高，使總烏頭堿純度不高，而且也沒有以此六種活性成分的純度進(jìn)行衡量。大孔樹脂為有機(jī)高聚物吸附劑，能選擇性的吸附有機(jī)物，近年來日益廣泛地用于中藥有效成分的提取分離。現(xiàn)在大孔樹脂的種類很多，由于極性和粒徑等性質(zhì)的不同，其對不同物質(zhì)的吸附與解吸附能力不同，為了提高產(chǎn)品質(zhì)量，對不同物質(zhì)應(yīng)優(yōu)選出大孔樹脂分離純化的工藝條件，為其新藥研制奠定一定的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高總烏頭堿含量且同時(shí)含有草烏六種活性成分的提取純化工藝。本發(fā)明的目的通過如下方案實(shí)現(xiàn)
(1)取草烏藥材，粉碎，用5-15倍體積量濃度為35%-95%乙醇超聲提取10_60min或回流提取l_7h，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏或濃縮液；
(2)將上述所得浸膏或濃縮液用乙醇溶解，上大孔樹脂，藥液按草烏總烏頭堿計(jì)與干樹脂的比例為2-10mg/lg，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用25%-55%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；用pH=2-10的65%-95%乙醇洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，得草烏總烏頭堿初提物。(3)以上總烏頭堿初提物浸膏用水溶解，調(diào)pH值范圍為8-12，經(jīng)萃取后得總烏頭堿提取物。步驟(I)中采用超聲提取時(shí)，提取物以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿為主的雙酯型總烏頭喊。采用回流提取時(shí)，提取物以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿為主的單酯型總烏頭堿。其中，步驟2中藥液濃度優(yōu)選l_8g生藥/ml。
步驟2中上樣速率和洗脫速率優(yōu)選l_6BV/h。步驟2中所用的大孔樹脂型號可以為D101，AB-8, S_8，HPD-750，HPD-722，X-5或NKA- II。步驟3中PH值優(yōu)選8-12。步驟3中萃取溶劑優(yōu)選乙酸乙酯、氯仿、或乙酸乙酯氯仿混合溶劑、乙醚等低極性有機(jī)溶劑。測定總烏頭堿提取物含量的液相質(zhì)譜聯(lián)用條件為
儀器LC-10ATvp高效液相輸液泵，2010EV單重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司)。色譜柱型號VenusilMP C18 色譜柱(150 mmX 2. 1 mm, I. 7 μ m)(安吉爾公司) 柱溫:室溫
流動相甲醇(A) ;10mmol/L醋酸銨(B, O. 1%甲酸)
梯度洗脫程序
時(shí)間(miη) 流速(ml/min) A% (甲酉享) B%冰相)
O. O —0.84555
15 —0.84753
27 —0.84753
30|θ· 8丨45丨55
由于草烏為藥典收載的劇毒性中藥，可以根據(jù)劑型需要得到烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭
堿或者毒性減弱的一級水解產(chǎn)物苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿。
如經(jīng)乙醇超聲提取可得到以雙酯型烏頭堿為主的總生物堿提取物；經(jīng)回流提取可得到以單
酯型烏頭堿為主的總生物堿提取物。本發(fā)明的有益效果是采用的大孔樹脂在優(yōu)化條件下對草烏中總烏頭堿的吸附量大，被解吸完全，所得草烏六種活性烏頭堿提取物純度可達(dá)60%，總烏頭生物堿的純度可達(dá)80%。同時(shí)可以根據(jù)制劑需要提取純化雙酯型烏頭堿和單酯型烏頭堿。因此，可以顯著提高草烏總烏頭堿的提取率，降低生產(chǎn)成本。草烏具有顯著的治療風(fēng)寒濕痹，關(guān)節(jié)疼痛等作用，可以用于制備治療風(fēng)濕寒痹等癥的藥物。


圖I為六種活性烏頭堿對照品的HPLC_MS(以氨基比林為內(nèi)標(biāo))
A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖2為實(shí)施方式2中的HPLC-MS圖
A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖3為實(shí)施方式3中的HPLC-MS圖
A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖4為實(shí)施方式4中的HPLC-MS圖
A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖5為實(shí)施方式5中的HPLC-MS圖 A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖6為實(shí)施方式6中的HPLC-MS圖A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿
圖7為實(shí)施方式7中的HPLC-MS圖
A氨基比林B苯甲酰新烏頭原堿C苯甲酰烏頭原堿D苯甲酰次烏頭原堿E新烏頭堿F次烏頭堿G烏頭堿。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
采用發(fā)明內(nèi)容中測定總烏頭堿提取物含量的液相質(zhì)譜聯(lián)用條件，測定烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，得色譜圖(圖I)。實(shí)施例2
取草烏藥材8g，粉碎，用40ml，95%乙醇超聲提取lOmin，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏。浸膏用95%乙醇溶解，以lBV/h上NKA-2大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用55%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用PH=2，95%乙醇以3BV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，得草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)乙酸乙酯萃取后，減壓濃縮，得草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度可達(dá)60%，總烏頭堿純度可達(dá)80%。進(jìn)行HPLC-MS分析，得色譜圖(圖2)。實(shí)施例3
取草烏藥材8g，粉碎，用120ml，35%乙醇超聲提取60min，過濾，回收乙醇，得草烏濃縮液。濃縮液用55%乙醇溶解，調(diào)PH值為10，以3BV/h上DlOl大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用25%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用PH=IO的65%乙醇以lBV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，得草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)氯仿萃取后，減壓濃縮，得草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度可達(dá)25%，總烏頭堿純度可達(dá)50% (圖3)。實(shí)施例4
取草烏藥材8g，粉碎，用80ml，35%乙醇超聲提取30min，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏。浸膏用55%乙醇溶解，以3BV/h上AB-8大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用25%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用pH=6的75%乙醇以lBV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，得草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)氯仿萃取后，減壓濃縮，得草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度可達(dá)35%，總烏頭堿純度可達(dá)55%(圖 4)。實(shí)施例5
取草烏藥材Sg，粉碎，用40ml，35%乙醇回流提取lh，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏。浸膏用75%乙醇溶解，以5BV/h上HPD-750大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用25%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用pH=2的85%乙醇以6BV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，的草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)乙酸乙酯氯仿(1:1)萃取后，減壓濃縮，的草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度可達(dá)38%，總烏頭堿純度可達(dá)58%。進(jìn)行HPLC-MS分析，得色譜圖(圖5)。實(shí)施例6
取草烏藥材8g，粉碎，用120ml，95%乙醇回流提取7h，過濾，回收乙醇，得草烏濃縮液。該濃縮液用85%乙醇溶解，以4BV/h上X-5大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用55%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用pH=4的75%乙醇以lBV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，的草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)乙醚萃取后，減壓濃縮，得草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度達(dá)35%，總烏頭堿純度可達(dá)55%。進(jìn)行HPLC-MS分析(圖6)。
實(shí)施例7
取草烏藥材8g，粉碎，用100ml，55%乙醇回流提取4h，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏。浸膏用85%乙醇溶解，以4BV/h上AB-8大孔樹脂，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用55%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；最后用pH=8的75%乙醇以lBV/h的流速洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，的草烏總烏頭堿初提物。初提物經(jīng)乙醚萃取后，減壓濃縮，得草烏總烏頭堿，其六種活性烏頭堿的總量純度達(dá)30%，總烏頭堿純度可達(dá)50%。進(jìn)行HPLC-MS 分析(圖 7)。
權(quán)利要求
1.一種草烏活性成分的提取純化工藝，其特征在于，包括以下步驟 (1)取草烏藥材，粉碎，用5-15倍體積量濃度為35%-95%乙醇超聲提取10_60min或回流提取l_7h，過濾，回收乙醇，得草烏浸膏或濃縮液； (2)將上述所得浸膏或濃縮液用乙醇溶解，上大孔樹脂，藥液按草烏總烏頭堿計(jì)與干樹脂的比例為2-10mg/lg，用水洗脫大孔樹脂至無色，水洗脫液棄去；用25%-55%乙醇洗脫大孔樹脂至無色，洗脫液棄去；用pH=2-10的65%-95%乙醇洗脫大孔樹脂，收集洗脫液，減壓干燥，得草烏總烏頭堿初提物； (3)以上總烏頭堿初提物浸膏用水溶解，調(diào)pH值范圍為8-12，經(jīng)萃取后得總烏頭堿提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，采用超聲提取時(shí)，提取物以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿為主的雙酯型總烏頭堿。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，采用回流提取時(shí)，提取物以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿為主的單酯型總烏頭堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所用的大孔樹脂選自D101，AB-8,S-8, HPD-750, HPD-722, X-5 或 NKA- II。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述藥液濃度為l_8g生藥/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)所述上柱流速為l_6BV/h。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)所述萃取溶劑為低極性有機(jī)試劑，選自乙酸乙酯、氯仿、乙醚或乙酸乙酯氯仿混合溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所得草烏六種活性烏頭堿提取物純度可達(dá)60%。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種草烏六種活性成分的提取純化工藝。草烏藥材，經(jīng)乙醇超聲提取得到以雙酯型烏頭堿為主的總生物堿提取物；或回流提取得到以單酯型烏頭堿為主的總生物堿提取物。過濾，回收乙醇，得浸膏或濃縮液，該浸膏或濃縮液經(jīng)乙醇稀釋后通過預(yù)先處理的大孔樹脂，用水洗脫至無色，再用低濃度乙醇洗脫，最后用高濃度乙醇洗脫，回收乙醇得總烏頭堿浸膏，浸膏調(diào)pH值至8-12，經(jīng)萃取后六種活性烏頭堿純度可達(dá)60%，總生物堿的純度可達(dá)80%。本發(fā)明經(jīng)濟(jì)環(huán)保，降低了生產(chǎn)成本，避免了使用乙醚，甲醇等有機(jī)溶媒在生產(chǎn)中不安全因素，工藝簡單，經(jīng)提取后，六種活性烏頭堿的總量純度高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P29/00GK102920797SQ20121045921
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者畢開順, 方亮, 李清, 劉晶晶, 劉然, 尹藝迪 申請人:沈陽藥科大學(xué)