專利名稱：重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VP1表達載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VPl表達載體及其制備方法、表達宿主及作為口服疫苗的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。CoxA16病毒的基因組為含有大約7400個核苷酸的單正鏈RNA，病毒顆粒大致呈球形，為二十面體立體對稱，無包膜和突起，病毒衣殼由60個亞單位相互連接而成，每個亞單位由病毒基因組編碼的衣殼蛋白VPI、VP2、VP3、VP4聚合而成，VPI、VP2、VP3三個蛋白暴露在病毒衣殼表面，VP4則包埋在病毒衣殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接。根據(jù)VPl的核酸序列差異可以分為A、B、C三個分支,90年代以前A、B兩系共同流行,且以B系為主。90年代末期C系出現(xiàn)，且逐步取代A、B成為優(yōu)勢株。 CoxA16和腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)同為引起兒童和嬰幼兒手足口病的常見病原體。CoxA16感染可導(dǎo)致腦炎心肌炎和頑固性休克等。目前還沒有有效的藥物和疫苗用來治療和預(yù)防CoxA16的感染，避免與感染者密切接觸被認為是有效地預(yù)防措施。由于CoxAie感染所帶來的危害日益嚴重，所以研發(fā)有效地疫苗保護易感人群，尋找合適的藥物治療患者顯得日趨重要。傳統(tǒng)的疫苗，如減毒的活病毒疫苗和滅活的病毒顆粒疫苗，在某些病毒疾病的預(yù)防上取得了顯著地成功。1954年，第一個滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗在美國被批準上市，這種疫苗是將脊髓灰質(zhì)炎病毒在37°C、PH=7的條件下，于1/10000的福爾馬林中孵化12到14天得到的。滅活疫苗成功之后，Sabin等人又研發(fā)出了用于預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎的口服減毒活疫苗并與1962年在美國投放上市。這兩種疫苗在全世界范圍內(nèi)極其有效地控制了脊髓灰質(zhì)炎的蔓延。CoxA16與脊髓灰質(zhì)炎病毒同屬小RNA病毒科腸道病毒屬,但與脊髓灰質(zhì)炎病毒相比，并沒有有效的滅活疫苗和減毒活疫苗得到應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體，及其制備方法。本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有表達重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的第三個目的是提供上述的重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VP表達載體或上述的宿主細胞在制備預(yù)防或治療CoxA16引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑中的用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體，載體為大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，其上裝載有CoxA16病毒的衣殼蛋白VPl的編碼基因，其序列如序列表中序列I所
/Jn o所述載體及CoxA16病毒的衣殼蛋白VPl的編碼基因均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的，在此不再贅述。所述的重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VPl表達載體的制備方法，包括以下步驟(I)調(diào)取載體蛋白基因(a) PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調(diào)控序列及編碼序列；(b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18T載體，測序；
(c)將測序正確的CotB片段雙酶切后連接到相同雙酶切的PDG1662上，得到質(zhì)粒 pDG1662-CotB ；(2)調(diào)取目的基因及構(gòu)建載體(a) PCR方法擴增柯薩奇病毒A16型衣殼蛋白VPl抗原序列；(b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18T載體，測序；(c)將測序正確的VPl片段雙酶切后連接到相同雙酶切的步驟(I)得到的質(zhì)粒pDG1662-CotB上，得到質(zhì)粒pDG1662-CotB_VPl，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體。詳細步驟如下 (I)調(diào)取載體蛋白基因(a) PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的(BGSC NO. 1A771株)CotB基因調(diào)控序列及編碼序列PCR 擴增的上游引物序列為5’ AGCGCCGgaattcACGGATTAGGCCGTTTGTCC 3’ ；下游引物序列為5’CAATCATCCaagcttGGATGAITGATCATCTGAAG3’；(如序列表中 2、3所示)位置兩端酶切位點分別為EcoR I、Hind III ；擴增條件是95°C4min,經(jīng) 95°C 30Sec、53°C 30Sec、75°C lmin 循環(huán)擴增 30 次；(b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18T載體PCR擴增產(chǎn)物測序正確后分別用EcoR I和Hind III雙酶切，電泳回收目的片段后，依次連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒PDG1662上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 a，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR既雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒pDG1662-CotB ；(2)調(diào)取目的基因及構(gòu)建載體(a) PCR方法擴增柯薩奇病毒A16型衣殼蛋白VPl抗原序列上游引物序列為5’AAGCTTGGGGATCCTAITGCAGACATGA3’ ；下游引物序列為5’GGATCCAGCGITGTTATCTTGTCTCTACT3’ ；位置兩端酶切位點分別為Hind III、BamH I ；擴增條件是95°C4min,經(jīng) 95°C 30Sec、52°C 30Sec、72°C lmin 循環(huán)擴增 30 次；(b )將上述PCR產(chǎn)物連接到步驟(I)得到的質(zhì)粒pDG1662_CotB上PCR產(chǎn)物測序正確后分別用HindIII和BamH I雙酶切，電泳回收目的片段后，依次連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒pDG1662-CotB上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 a，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR既雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒pDG1662-CotB-VPl，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體；(3)驗證枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體(a)擴增上述陽性克隆的大腸桿菌DH5a，試劑盒提取質(zhì)粒pDG1662-CotB_VPl，Nde I、Xba I雙酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，轉(zhuǎn)化方法為①挑取一環(huán)孢子接種于少量生長培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)種子液；②將種子以1/16的接種量接種于生長培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)，至0D600在
0.85 O. 95 ;③冰水浴冷卻培養(yǎng)物lOmin，4°C，5000 X g，離心5min收集菌體；④反復(fù)用冰冷的電擊緩沖液洗滌細胞收集物4次； ⑤用原培養(yǎng)液1/40體積的電擊緩沖液重新懸浮細胞收集物，使得細胞濃度在I
1.3X1010cfu/ml, _80°C保存(不需要液氮預(yù)凍)；⑥轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化條件為60 μ I感受態(tài)細胞+1 μ I (50ng/ μ I )DNA混勻并轉(zhuǎn)移到冰冷的電轉(zhuǎn)化杯(lmm gap)中，冰浴I I. 5min后，電擊一次；注意在電壓高于20kV/cm的時候，若電擊時間常數(shù)少于4. 2ms，轉(zhuǎn)化效率將急劇下降；這種情況下為了獲得較高的轉(zhuǎn)化效率就必須再次用電擊緩沖液洗滌或者稀釋細胞；⑦電擊完畢之后，立即加入Iml復(fù)蘇培養(yǎng)基，7°C搖床震蕩培養(yǎng)3h之后，將復(fù)蘇物涂氯霉素抗性平板篩選陽性克隆；(b)提取枯草芽孢桿菌基因組，進行PCR鑒定，以及應(yīng)用抗生素抗性鑒定質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組是否重組；取PCR鑒定為陽性，且質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組重組者，進行下一步操作；(C)取上述轉(zhuǎn)化成功的枯草芽孢桿菌，搖菌發(fā)酵，37°C培養(yǎng)96h，待枯草芽孢桿菌絕大部分轉(zhuǎn)變成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣殼蛋白，Western-Blot鑒定目的蛋白是否有效表達。所述步驟(I) Ca)中，擴增的枯草芽胞桿菌為BGSC NO. 1A771株。所述步驟(3) Ca)①中的生長培養(yǎng)基為LB+O. 5M山梨醇。所述步驟(3) Ca)②中的生長培養(yǎng)基為LB+O. 5M山梨醇。所述步驟(3) (a)④、⑤中的電擊緩沖液為LB+0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10%甘油。所述步驟(3) (&) 中的電擊條件為254 ，2000，4.5 5.01118。所述步驟(3) (a)⑦中的復(fù)蘇培養(yǎng)基為LB+0.5M山梨醇+0. 38M甘露醇。所述提取芽孢衣殼蛋白的方法為①IOOOOg離心IOmin收集菌體,用IOmL PBS洗沉淀3次,2min/次；②用IOmL SET buffer 重懸沉淀，加 10mg/mL 溶菌酶 ImL, 37°C孵育 lh, IOOOOg 離
心得沉淀；③用IOmL PBS 洗沉淀 3 次，2min/次，用 decoating buffer (O. IM NaOH O. IMNaC110%SDS O. IM DTT)重懸沉淀，300rpm 70°C孵育 Ih ；④12000g離心lOmin，上清即為衣殼蛋白。所述Western-Blot鑒定目的蛋白是否得到有效表達的方法為①50uL蛋白上清加50uL 2 X上樣緩沖液煮沸5min ；
②常規(guī)方法制備15%聚丙烯酰胺凝膠后上樣，IOuL/道；③80V 20min 后 120V 45min ；④轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，條件為IOOmA 3h ；⑤將硝酸纖維素膜用TBST洗3次，5min/次，加I : 100稀釋的陽性小鼠血清10mL，37°C孵育Ih，輕輕震動；⑥TBST洗膜3次，5min/次，加I :5000稀釋的酶標二抗10mL，37°C孵育lh，輕輕震動；⑦TBST洗膜3次，5min/次，加ECL發(fā)光底物顯色。一種含有重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體的宿主細胞，宿主為枯草芽孢桿菌。 —種預(yù)防或治療CoxA16引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑，該口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑是由重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體的宿主細胞培養(yǎng)液添加藥學(xué)上可以接受的輔料或輔助性成分制備而成的。所述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑的劑型為口服液、片劑或膠囊劑等常規(guī)劑型。本發(fā)明用CoxA16_VPl重組載體構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌口服疫苗的研究方案是“揚長避短”的一種新嘗試，即模擬病毒自然感染之道，研制“保護性抗原重組”疫苗。本發(fā)明中涉及使用的現(xiàn)有核苷酸序列均能在已發(fā)表的本領(lǐng)域?qū)W術(shù)刊物即GenBank中檢索而得，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員均能在參考本領(lǐng)域教科書或?qū)嶒炇謨缘幕A(chǔ)上完成本發(fā)明涉及的分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)試驗。本發(fā)明的有益效果如下I、安全高效，枯草芽孢桿菌對人類和家畜不致病，是一種食用菌，具有很高的安全性，用它做重組載體活疫苗的表達系統(tǒng)，不存在菌體產(chǎn)生外毒素、無致熱源和獨立返祖等潛在的治病危險，有利于直接把抗原表達在粘膜淋巴細胞表面而被識別和提呈。該疫苗安全性高，表達抗原肽亞單位沒有感染性，還可能發(fā)揮粘膜免疫增效劑和輔助治療作用。2、模塊化研制，模塊化組合，可將不同血清型的Cox流行株的VPl克隆到不同的枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建Cox的VPl亞單位疫苗庫，當臨床上出現(xiàn)不同的Cox流行株時，可根據(jù)實際情況，從菌種庫中調(diào)取相應(yīng)的VPl亞單位枯草芽孢桿菌疫苗，隨時組合出能夠有效應(yīng)對臨床需要的疫苗，使Cox亞單位疫苗的研制走向模塊化發(fā)展道路，改變當前沒有有效疫苗的困境。3、快捷重組，該方案使疫苗研制工作能夠及時根據(jù)臨床流行株的抗原變異而改變疫苗抗原的重組方式，達到以變應(yīng)變的主動效果，以現(xiàn)有的基因克隆和測序技術(shù)，一個星期就可以完成載體的構(gòu)建工作，使Cox重組口服活疫苗研制的理想方案。4、經(jīng)濟實惠，口服方便，與重組減毒活疫苗相比，本發(fā)明活疫苗發(fā)明具有經(jīng)濟適用的特點，發(fā)酵產(chǎn)品不需要進一步的純化，其研制費用低廉，而劑型可使用發(fā)酵品或膠囊等劑型，便于兒童服用。綜上所述，本發(fā)明枯草芽孢桿菌COXA16-VP1重組載體活疫苗效果好，安全性強，使用方便。成本低，具有很好的使用前途。


圖I為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl重組載體的構(gòu)建示意圖。圖2為雙酶切鑒定電泳圖，其中，A泳道為DNA MARKER，B泳道為pDG1662-CotB_VPl質(zhì)粒用BamHI、EcoRI雙酶切后。圖3為Western-blot鑒定pDG1662-CotB_VPl重組載體圖；其中，A泳道為pDG1662-CotB-VPl重組載體，B泳道為無重組載體對照，由圖可見pDG1662-CotB_VPl重組載體成功表達了 VP蛋白。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體，并進行驗證方法如下(I)調(diào)取載體蛋白基因(a) PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的(BGSC NO. 1A771株)CotB基因調(diào)控序列及編碼序列上游5-AGCGCCGgaattcACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3(位置-263/_244，含 EcoRI 酶切位點)下游5-CAATCATCCaagcttGGATGATTGATCATCTGAAG_3(位置+806/+825，含HindIII酶切位點)擴增條件是95°C4min,經(jīng) 95°C 30Sec、53°C 30Sec、75°C Imin 循環(huán)擴增 30 次；(b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18T載體(大連寶生物試劑盒)，反應(yīng)體系為5yL連接buf f er+0. 5 μ L pMD18T載體+4. 5 μ L目的片段；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，PCR擴增陽性的菌株送測序(C)測序正確的質(zhì)粒用EcoR I和Hind III雙酶切，電泳回收目的片段，連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒PDG1662上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 a，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR既雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒pDG1662-CotB ；(2)調(diào)取目的基因及構(gòu)建載體(a) PCR方法擴增柯薩奇病毒A16型衣殼蛋白VPl抗原序列上游引物序列為5’AAGCTTGGGGATCCTATTGCAGACATGA3’ ；下游引物序列為5’GGATCCAGCGTTGTTATCTTGTCTCTACT3’ ；位置兩端酶切位點分別為Hind III、BamH I ；擴增條件是95°C4min,經(jīng) 95°C 30Sec、52°C 30Sec、72°C Imin 循環(huán)擴增 30 次；(b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18T載體(大連寶生物試劑盒)，反應(yīng)體系為5yL連接buf f er+0. 5 μ L pMD18T載體+4. 5 μ L目的片段；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，PCR擴增陽性的菌株送測序(c)將CoxA16VPl基因接到步驟(I)得到的質(zhì)粒pDG1662_CotB上將上述測序正確的質(zhì)粒用Hind III和BamH I雙酶切，電泳回收目的片段后，連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒pDG1662-CotB上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 α，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR及雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒pDG1662-CotB-VPl，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體，其序列如序列表中序列I所示；(3)驗證枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體(a)擴增上述陽性克隆的大腸桿菌DH5 a，試劑盒提取質(zhì)粒pDG1662-CotB_VPl，Nde I、Xba I雙酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，轉(zhuǎn)化方法為①挑取一環(huán)孢子接種于少量生長培養(yǎng)基(LB+0. 5M山梨醇)中，過夜培養(yǎng)種子液；②將種子以1/16的接種量接種于生長培養(yǎng)基(LB+0. 5M山梨醇)中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)，至0D600在0. 85 0. 95 ；③冰水浴冷卻培養(yǎng)物10min，4°C，5000Xg，離心5min收集菌體；④反復(fù)用冰冷的電擊緩沖液(0. 5M山梨醇，0. 5M甘露醇，10%甘油)洗滌細胞收集物4次； ⑤用原培養(yǎng)液1/40體積的電擊緩沖液重新懸浮細胞收集物，使得細胞濃度在I I. 3X1010cfu/ml, _80°C保存(不需要液氮預(yù)凍)；⑥轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化條件為60 U I感受態(tài)細胞+1 U I (50ng/ U 1)DNA混勻并轉(zhuǎn)移到冰冷的電轉(zhuǎn)化杯(1_ gap)中，冰浴I I. 5min后，電擊一次(25ii F, 200 Q ,4. 5 5. Oms);注意在電壓高于20kV/cm的時候,若電擊時間常數(shù)少于4. 2ms,轉(zhuǎn)化效率將急劇下降；這種情況下為了獲得較高的轉(zhuǎn)化效率就必須再次用電擊緩沖液洗滌或者稀釋細胞；⑦電擊完畢之后，立即加入Iml復(fù)蘇培養(yǎng)基(LB+0. 5M山梨醇+0. 38M甘露醇)，7°C搖床震蕩培養(yǎng)3h之后，將復(fù)蘇物涂氯霉素抗性平板篩選陽性克??；(b)提取枯草芽孢桿菌基因組，進行PCR鑒定，以及應(yīng)用抗生素抗性鑒定質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組是否重組；取PCR鑒定為陽性，且質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組重組者，進行下一步操作；(c )取上述轉(zhuǎn)化成功的枯草芽孢桿菌，搖菌發(fā)酵，37 °C培養(yǎng)96h，待枯草芽孢桿菌絕大部分轉(zhuǎn)變成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣殼蛋白，Western-Blot鑒定，目的蛋白得到有效表達。所述提取芽孢衣殼蛋白的方法為①IOOOOg離心IOmin收集菌體，用IOmL PBS洗沉淀3次，2min/次；②用IOmL SET buffer重懸沉淀，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，37°C孵育lh，得沉淀；③用10mT, PBS 洗沉淀 3 次，2min/次，用 decoating buffer (0. IM NaOH 0. IMNaC110%SDS 0. IM DTT)重懸沉淀，300rpm 70°C孵育 Ih ；④12000g離心lOmin，上清即為衣殼蛋白。所述Western-Blot鑒定目的蛋白的方法為①50uL蛋白上清加50uL 2 X上樣緩沖液煮沸5min ；②常規(guī)方法制備15%聚丙烯酰胺凝膠后上樣，IOuL/道；③80V 20min 后 120V 45min ；④轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，條件為IOOmA 3h ；⑤將硝酸纖維素膜用TBST洗3次，5min/次，加I : 100稀釋的陽性小鼠血清10mL，37°C孵育Ih，輕輕震動；⑥TBST洗膜3次，5min/次，加I :5000稀釋的酶標二抗10mL，37°C孵育lh，輕輕震動；⑦TBST洗膜3次，5min/次，加DAB底物顯色。實施例2(一)以枯草芽孢桿菌的CotB基因(BSU36050cotB)的啟動子及部分編碼序列(位置-263 825nt)為載體蛋白與CoxA16VPl部分編碼序列一同連接到整合質(zhì)粒pDG1662(BGSCAccession ECE113) amyE 基因中間部位。具體步驟如下I.以BGSC 1A771菌株基因組為模板，pfu DNA聚合酶通過PCR擴增獲載體蛋白部分編碼序列及其啟動子。
引物序列如下上游5-AGCGCCGgaattcACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3(位置-263/_244，含 EcoRI 酶切位點)下游5-CAATCATCCaagcttGGATGATTGATCATCTGAAG-3(位置+806/+825，含HindIII酶切位點)PCR 擴增條件95°C 4min, (95°C 30sec,53°C 30sec,72°C lmin) X 30 個循環(huán)。結(jié)果獲得1088bp的包含CotB啟動子及部分編碼序列的DNA片段，進行T-A連接，測序正確后記作CotB保存。2.以CoxA16基因組為模板擴增CoxA16 VPl部分編碼序列。引物序列如下上游引物序列為5’AAGCTTGGGGATCCTATTGCAGACATGA3’ ；下游引物序列為5’GGATCCAGCGTTGTTATCTTGTCTCTACT3’ ；PCR 擴增條件95°C 4min, (95°C 30sec,53°C 30sec,72°C lmin) X 30 個循環(huán)。結(jié)果獲得824bp的CoxA16 VP蛋白編碼序列的DNA片段，進行T-A連接，測序正確后記作VPl保存。用BamHI 和 EcoRI 雙酶切 pDG1662 質(zhì)粒，EcoRI、HindIII 雙酶切 CotB, BamHI、HindIII雙酶切VP1，電泳回收目的片段后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在氯霉素抗性LB平板上挑取單克隆，搖菌后提取質(zhì)粒做PCR及雙酶切鑒定，陽性克隆命名為pDG1662-CotB-VPl，電泳圖如圖2示。(二)含pDG1662-CotB_VPl重組載體的枯草芽孢桿菌種子菌的制備轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的過程如下于第一天上午取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB平板，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。挑單菌落至3ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rmin培養(yǎng)過夜。第二天上午取160 μ I培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8mlSPI培養(yǎng)基中，37°C，250rmin培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(約4 5h)，取O. 2ml培養(yǎng)液至2mlSPII 培養(yǎng)基中，37°C，IOOrmin 培養(yǎng)90min，加入 20ul IOmmolL EGTA，再于 37°C，IOOrmin培養(yǎng)10分鐘。分裝成O. 5ml每管，加入5ul酶切線性化的目的DNA，再于37°C，250rmin培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布氯霉素抗性LB篩選平板，從而獲得轉(zhuǎn)CoxA16 VPl基因的枯草芽孢桿菌，抗生素抗性試驗、PCR、SDS-PAGE和Western-blot鑒定后的陽性克隆即為基因組中重組入目的序列的枯草芽孢桿菌種子菌。(SP 鹽0. 2% (NH4) 2S04, I. 4%K2HP04, O. 6%KH2P04, O. 02%MgS04 · 7H20, O. 1% 檸檬酸鈉；SP I培養(yǎng)基SP鹽溶液加入1%體積濃度為50%葡萄糖溶液，1%體積100 X CAYE溶液；SP II培養(yǎng)基SP I培養(yǎng)基加入1%體積50mmol/LCaC12溶液，1%體積250mmol/L MgCl2溶液)(三)種子菌的大規(guī)模液體接種擴增培養(yǎng)將(二)構(gòu)建的枯草芽孢桿菌種子菌復(fù)蘇后涂布于氯霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)20h,挑取單一的抗性菌落與抗性培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定VPl陽性的枯草芽孢桿菌再次涂抗性平板，如此反復(fù)集中培養(yǎng)至不低于15代時PCR鑒定VPl仍為陽性的克隆作為大規(guī)模接種擴增培養(yǎng)的種子菌，保藏備用。(四)枯草芽孢桿菌pDG1662-CotB_VPl重組載體滴鼻疫苗制劑的制備及該疫苗的藥效試驗I.枯草芽孢桿菌pDG1662-CotB-VPl重組載體滴鼻疫苗具體制備過程如下 a)配方將種子液按I :100接種到氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C 200rpm培養(yǎng)3d，顯微鏡觀察芽孢成率達95%以上時收獲菌體。4°C IOOOOg離心15min，用生理鹽水洗芽孢3次。用含5%蔗糖，0.5%明膠的磷酸緩沖液稀釋芽孢至1.0X10n/ml。可用單批原液或多批原液配置。b)包裝膠囊按0. 5g/支規(guī)格進行膠囊包裝，4°C保藏，既得。上述的枯草芽孢桿菌pDG1662-CotB-VPl重組載體滴鼻疫苗微生物指標活性枯草芽孢桿菌彡2\101°0 11/1111，大腸菌群數(shù)< 30cfu/100ml，致病菌不得檢出。2.滴鼻疫苗的藥效驗證a)試驗分組(24日齡雄性BALB/c小鼠40只，隨機分成下述4組)疫苗免疫組、無重組載體的枯草芽孢桿菌對照組、大腸桿菌不耐熱毒素(LT)陽性對照組和生理鹽水對照組。b) BALB/c小鼠滴鼻免疫試驗(IO9菌/只)無重組載體的枯草芽孢桿菌對照組用不含VPl的pDG1662轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌(50ul，制備方法同上，但枯草芽孢桿菌中的載體為不含VPl的pDG1662)在第0d，Id, 2d，3d，lid, 12d, 13d，21d，22d，23d 滴鼻；生理鹽水對照組:用生理鹽水(50ul)在第0d，ld，2d，3d，lld，12d，13d，21d，22d，23d滴鼻；疫苗免疫組用上述枯草芽孢桿菌pDG1662-CotB-VPl重組載體口服活疫苗(50ul)在第 0d, Id, 2d, 3d, lid, 12d, 13d, 21d, 22d, 23d 滴鼻。大腸桿菌不耐熱毒素(LT)陽性對照組用LT做為粘膜佐劑，LT與hlgG按250ug 3. 75mg_1 mL_1 混勻后為 LT 佐劑疫苗，在第 0d, Id, 2d, 3d, lid, 12d, 13d, 21d, 22d,23d 滴鼻(50ul/只)。第28d后檢測VPl特異性抗體。3.實驗結(jié)果疫苗免疫組10只(100%)小鼠VPl抗體均為陽性，而無重組載體的枯草芽孢桿菌對照組和生理鹽水對照組均為陰性；細胞免疫試驗中疫苗免疫組10只(100%)小鼠均產(chǎn)生對VPl特異性抗體，而無重組載體的枯草芽孢桿菌對照組和生理鹽水對照組均為陰性，并且與LT陽性對照組比較抗體水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表I)。上述結(jié)果證明本發(fā)明重組口服疫苗對CoxA16感染有較強的免疫效應(yīng)，優(yōu)于當前應(yīng)用的LT佐劑。表IVP特異性抗體水平檢測
權(quán)利要求
1.重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VPl表達載體，其特征在于載體為大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，其上裝載有C0XA16病毒的衣殼蛋白VPl的編碼基因。
2.權(quán)利要求I所述的重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VPl表達載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)調(diào)取載體蛋白基因 (a)PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調(diào)控序列及編碼序列； (b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接PMD18T載體，測序； (c)將測序正確的CotB片段雙酶切后連接到相同雙酶切的pDG1662上，得到質(zhì)粒pDG1662-CotB ； (2)調(diào)取目的基因及構(gòu)建載體 (a)PCR方法擴增CoxA16衣殼蛋白VPl抗原序列； (b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接PMD18T載體，測序； (c)將測序正確的VPl片段雙酶切后連接到相同雙酶切的步驟(I)得到的質(zhì)粒pDG1662-CotB上，得到質(zhì)粒pDG1662-CotB_VPl，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)調(diào)取載體蛋白基因 (a)PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調(diào)控序列及編碼序列 PCR 擴增的上游引物序列為5’ AGCGCCGgaattcACGGATTAGGCCGTTTGTCC 3’ ； 下游引物序列為5’ CAATCATCCaagcttGGATGATTGATCATCTGAAG 3’ ； 兩端酶切位點分別為EcoR I、Hind III ； 擴增條件是95°C 4min，經(jīng) 95V 30Sec、53°C 30Sec、75°C Imin 循環(huán)擴增 30 次； (b)將上述PCR擴增產(chǎn)物連接PMD18T載體PCR擴增產(chǎn)物測序正確后分別用EcoRI和Hind III雙酶切，電泳回收目的片段后，依次連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒PDG1662上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 α，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR既雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒 pDG1662-CotB ； (2)調(diào)取目的基因及構(gòu)建載體 (a)PCR方法擴增CoxA16衣殼蛋白VPl抗原序列 上游引物序列為5’ AAGCTTGGGGATCCTATTGCAGACATGA3’ ； 下游引物序列為5’ GGATCCAGCGTTGTTATCTTGTCTCTACT3’ ； 位置兩端酶切位點分別為Hind III、BamH I ； 擴增條件是95°C 4min，經(jīng) 95V 30Sec、52°C 30Sec、72°C Imin 循環(huán)擴增 30 次； (b)將上述PCR產(chǎn)物連接到步驟(I)得到的質(zhì)粒pDG1662-CotB上PCR產(chǎn)物測序正確后分別用Hind III和BamH I雙酶切，電泳回收目的片段后，依次連接到用相同雙酶切的質(zhì)粒pDG1662-CotB上，轉(zhuǎn)換大腸桿菌DH5 α，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR既雙酶切鑒定，從而得到質(zhì)粒pDG1662-CotB-VPl，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16_VPl表達載體； (3)驗證枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體 Ca)擴增上述陽性克隆的大腸桿菌DH5a，試劑盒提取質(zhì)粒pDG1662-CotB_VPl，NdeI、Xba I雙酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，轉(zhuǎn)化方法為 ①挑取一環(huán)孢子接種于生長培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)種子液； ②將種子以1/16的接種量接種于生長培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)，至0D600在.0.85 O. 95 ; ③冰水浴冷卻培養(yǎng)物lOmin，4°C，5000X g，離心5min收集菌體； ④反復(fù)用冰冷的電擊緩沖液洗滌細胞收集物4次； ⑤用原培養(yǎng)液1/40體積的電擊緩沖液重新懸浮細胞收集物，使得細胞濃度在I .1.3X1010cfu/ml, _80°C保存； ⑥轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化條件為60μ I感受態(tài)細胞+1 μ I DNA混勻并轉(zhuǎn)移到冰冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴I I. 5min后，電擊一次； ⑦電擊完畢之后，立即加入Iml復(fù)蘇培養(yǎng)基，7°C搖床震蕩培養(yǎng)3h之后，將復(fù)蘇物涂氯霉素抗性平板篩選陽性克隆； (b)提取枯草芽孢桿菌基因組，進行PCR鑒定，以及應(yīng)用抗生素抗性鑒定質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組是否重組；取PCR鑒定為陽性，且質(zhì)粒與枯草芽孢桿菌基因組重組者，進行下一步操作； (c)取上述轉(zhuǎn)化成功的枯草芽孢桿菌，搖菌發(fā)酵，37°C培養(yǎng)96h，待枯草芽孢桿菌絕大部分轉(zhuǎn)變成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣殼蛋白，Western-Blot鑒定目的蛋白是否有效表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述提取芽孢衣殼蛋白的方法為 ①IOOOOg離心IOmin收集菌體，用IOmLPBS洗沉淀3次，2min/次； ②用IOmLSET buffer重懸沉淀,加10mg/mL溶菌酶lmL,37°C孵育lh, IOOOOg離心得沉淀； ③用10mT, PBS 洗沉淀 3 次，2min/ 次，用 decoating buffer (O. IM NaOH O. IMNaC110%SDS O. IM DTT)重懸沉淀，300rpm 70°C孵育 Ih ； ④12000g離心lOmin,上清即為衣殼蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述Western-Blot鑒定目的蛋白是否得到有效表達的方法為 ①50uL蛋白上清加50uL2 X上樣緩沖液煮沸5min ； ②常規(guī)方法制備15%聚丙烯酰胺凝膠后上樣，IOuL/道； 80V 20min 后 120V 45min ； ④轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，條件為IOOmA3h ； ⑤將硝酸纖維素膜用TBST洗3次，5min/次，加I: 100稀釋的陽性小鼠血清10mL，37°C孵育Ih，輕輕震動； ⑥TBST洗膜3次，5min/次，加I:5000稀釋的酶標二抗10mL，37°C孵育lh，輕輕震動； ⑦TBST洗膜3次，5min/次，加DAB顯色。
6.一種含有權(quán)利要求I所述的重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VPl表達載體的宿主細胞，其特征在于宿主為枯草芽孢桿菌。
7.權(quán)利要求6所述的宿主細胞在制備預(yù)防或治療CoxA16引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑中的用途。
8.一種預(yù)防或治療CoxA16引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑，其特征在于是由重組枯草芽孢桿菌CoxAie-VPl表達載體的宿主細胞培養(yǎng)液添加藥學(xué)上可以接受的輔料或輔助性成分制備而成的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑，其特征在于所述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑的劑型為口服液、片劑或膠囊劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VP1表達載體，載體為大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，其上裝載有CoxA16病毒的衣殼蛋白VP1的編碼基因。構(gòu)建方法為(1)擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調(diào)控序列及編碼序列，連接到pDG1662上，得到質(zhì)粒pDG1662-CotB；(2)擴增CoxA16衣殼蛋白VP1抗原序列，連接到質(zhì)粒pDG1662-CotB上，得到質(zhì)粒pDG1662-CotB-VP1，即為重組枯草芽孢桿菌CoxA16-VP1表達載體。將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主細胞培養(yǎng)后，可用于制備預(yù)防或治療CoxA16引起的疾病的口服疫苗。
文檔編號A61P31/14GK102827864SQ201210350709
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者曹銀光, 李志會 申請人:聊城市人民醫(yī)院, 李志會