專利名稱：枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的提取分離方法及應(yīng)用，特別是一種從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α -葡萄糖苷酶(a -glucosidase)是一類能夠從含有α -葡萄糖苷鍵底物的非還原端催化水解α-葡萄糖基的酶的總稱，其廣泛分布于生物體中，參與食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖復(fù)合物的合成與分解代謝等許多生物代謝過程。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的復(fù)合糖質(zhì)，而糖尿病、肥胖癥、高血脂、炎癥、癌變、免疫反應(yīng)和病毒感染等都和細(xì)胞表面的復(fù)合糖質(zhì)有密切關(guān)系，因此，開發(fā)出適當(dāng)?shù)摩?-葡萄糖苷酶抑制 劑類藥物，可以治療很多疾病。枸杞(Lycium)是我國傳統(tǒng)的中草藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，之后歷代本草對其都有詳盡的記載。果實入藥稱枸杞子，味甘，性平。有滋補肝腎，益精明目功效。主治肝腎陰虛、頭暈?zāi)垦?、腰膝酸痛等證。現(xiàn)代免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)多項試驗表明枸杞果實及枸杞多糖可有效提高機體免疫調(diào)節(jié)功能，治療糖尿病及其并發(fā)癥，具有抗突變、抗腫瘤、抗疲勞、延緩衰老、明目養(yǎng)顏保肝降血糖等功效。而對枸杞籽的研究不多，一般主要用于提取具有醫(yī)療保健作用的枸杞油，提取后的殘渣則視為廢物，但枸杞籽和果是包含在一起的，且籽約占干果的四分之一重量，為了開發(fā)利用枸杞籽及其提取枸杞油后廢棄的殘渣，我們對其進行了化學(xué)成分及生物活性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的按照下述方案實現(xiàn)從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α -葡萄糖苷酶活性抑制劑的方法，其步驟為枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣經(jīng)甲醇超聲提取3次，合并提取液，減壓干燥得甲醇總提取物，將甲醇總提取物加水溶解后，分別用等體積的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，減壓回收溶劑，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水層經(jīng)大孔樹脂柱處理，甲醇洗脫，得甲醇洗脫物、水洗脫物，采取α-葡萄糖苷酶活性體系追蹤，發(fā)現(xiàn)正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脫物均表現(xiàn)出一定的α -葡萄糖苷酶抑制活性，將上述三種提取物經(jīng)硅膠柱色譜，ODS柱色譜以及高效液相制備色譜分離得到14個化合物，結(jié)構(gòu)和名稱見附圖
Io所述抑制劑的用途，是將其用作臨床治療II型糖尿病治療的首選藥和I型糖尿病的胰島素治療的輔助藥物；所述抑制劑的用途，是將其用作預(yù)防艾滋病的輔助藥物；
所述抑制劑的用途，是將其用作阻止腫瘤血管生長的抗腫瘤藥物。α -葡萄糖苷酶抑制活性的測定本發(fā)明以4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷(縮寫PNPG)為反應(yīng)底物，具體的反應(yīng)體系為25 μ L PNPG，加入25 μ L各種濃度的樣品溶液后，加入25 μ L α-葡萄糖苷酶，再加Λ 175 μ L磷酸鹽緩沖液，在混合器上混合10分鐘后。在37°C反應(yīng)15分鐘，加入IM Na2CO350 μ L終止反應(yīng)，在405nm波長處測定吸收值。通過不加樣品測定樣品空白，不加α -葡萄糖苷酶測定陰性對照。樣品的抑制率通 過以下公式計算抑制率) = (0DNegative control-0DB1
ank) (0Dsampie ODganlP^e blank) I ^^Negative controlIank^


附圖I是本發(fā)明從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取得到的14個化合物的名稱及結(jié)構(gòu)示意圖。附圖2是本發(fā)明枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣提取工藝流程圖，圖中，LB代表枸杞；M為甲醇；N為乙腈汀為O. 06%三氟乙酸；HAc為3%的醋酸；例如12% NT是12%的乙腈溶液(包含O. 06%三氟乙酸);IC50為半數(shù)致死率；HPLC為制備高效液相色譜法。單體化合物的IC50 (半數(shù)致死率)單位Mm
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明進行描述。但本發(fā)明的范圍并不僅限于此。I、提取與分離枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣各I. OOkg經(jīng)甲醇超聲提取3次，合并提取液，減壓干燥得甲醇總提取物8. 97g，該提取物具有抗α-葡萄糖苷酶活性，IC50為2. 33mg/mL。將甲醇總提取物加水溶解后，分別用等體積的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，減壓回收溶劑，得正己烷提取物I. 90g、乙酸乙酯提取物I. 30g。剩下的水層經(jīng)大孔樹脂柱處理，甲醇洗脫，得甲醇洗脫物0.52g、水洗脫物4.61g。采取α-葡萄糖苷酶活性體系追蹤，發(fā)現(xiàn)正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脫物均表現(xiàn)出一定的α -葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分別為2. llmg/mL, I. 57mg/mL, I. 89mg/mL。因此將上述三部分經(jīng)硅膠柱色譜，ODS柱色譜以及高效液相制備色譜等方法，分離得到14個化合物，其分離流程圖如附圖2所示。2、14種化合物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定化合物I :白色固體(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式為C17H17NO3。氫譜的低場區(qū)給出兩組AA' BB'偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號δ7. 39(1H，d，J=8.6Hz，H-2，6)，6.72(lH，d，J=8.6Hz，H-3，5)和 5 7. 05(1H, d,J=8. 6Hz,H-2/，6' ),6. 75(1H, d,J=8. 6Hz,H-3'，5')，推測該化合物中應(yīng)有兩個1，4 二取代的苯基片段；一組反式雙鍵質(zhì)子信號δ 7. 44 (1Η, d，J=15. 7Ηζ, Η_7)，6·38(1Η，d，J=15. 7，Hz, H_8);高場區(qū)給出一組 A2M2 偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號 δ3. 46(2H，t，J=7. 2Hz，H-8' ),2. 75 (2H, t, J=7. 2Hz, W~T )。碳譜給出17個碳信號，其中包括I個羰基碳信號δ 169. 3 (C=O)，兩個孤立的連氧芳香碳信號δ 160.5 (C-4)，157.0 (C-f );兩個反式烯碳信號 δ 141. 8 (C-7)，118. 6 (C-8);—個連氮碳信號S42.6(C-8');進一步說明該化合物為對羥基桂皮酸與對羥基苯乙胺?；撍傻孽０?。根據(jù)以上數(shù)據(jù)將該化合物鑒定為N-反式-香豆酰酪胺(N-(p-trans-coumaroyl)tyramine)化合物2 :白色固體(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式為C17H17NO3，氫譜的低場區(qū)給出兩組AA, BB'偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號δ 7. 36 (1Η, d, J=8. 6Hz, H-2,6), 6. 69 (1H, d,J=8. 6Hz，H-3，5)和 δ 7. 01(lH，d，J=8. 6Hz，H-2'，6' ) ,6. 72(lH,d, J=8. 6Hz,H-3/ ,5')，推測該化合物中應(yīng)有兩個1，4 二取代的苯基片段；一組順式雙鍵質(zhì)子信號δ6.61(1Η，d，J=12. 5Hz, H-7)，5· 79 (1H，d，J=12. 5，Hz, H_8);高場區(qū)給出一組A2M2偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號δ 3. 39 (2H，t，J=8. IHz，H-8' ),2. 69(2H, t, J=8. 1Ηζ,Η-7/ )。化合物 2 與化合物 I 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)很相似，差別在于化合物2的雙鍵為順式雙鍵。通過與化合物I比較，將該化合物鑒定為N-順式-香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl) tyramine)?；衔?:白色固體(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式為C18H19N04。氫譜的低場區(qū)給出一組AA' BB'偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號δ7.05(1Η，d，J=8. 5Hz，H-2' ,6')，6. 72(1H, d, J=8. 5Hz,H-3/，5')，推測該化合物中應(yīng)有一個1，4 二取代的苯基片段；一組ABX 偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號 δ 7. 12 (1Η，s’ H-2)，7. 02 (1H，d，J=8. OHz, H_6)，6 . 79 (1H，d，J=8. OHz, H-5)，推測該化合物中應(yīng)有一個1，3，4三取代的苯基片段；一組反式雙鍵質(zhì)子信號 δ 7. 43 (1Η, d, J=15. 6Hz, H-7), 6. 40 (1H, d, J=15. 6，Hz, H_8)。高場區(qū)給出一個甲氧基質(zhì)子信號 δ3. 88 (3Η, s，3-0CH3);一組 A2M2 偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號 δ 3. 47 (2H，t，J=7. IHz,H-8' )，2. 75 (2H，t，J=7. IHz, H_7')?；衔?與化合物I的碳譜數(shù)據(jù)很相似，差別在于化合物3比化合物I多了一個甲氧基碳信號δ 56. 5 (3-0CHs)。通過與化合物I比較，將該化合物鑒定為N-反式-對輕基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine)
O化合物4 :白色固體(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式為C36H36N2O815氫譜的低場區(qū)給出兩組AA' BBi偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號δ7.05(1Η，d，J=8. 5Hz，H-2'，6' ),6. 71 (1H, d, J=8. 5Hz, H-3 ;，5')和 δ 6. 84 (1H，d，J=8. 4Hz，H_2 " '，6"')，6. 59(lH，d，J=8. 4Hz，H-3" '，5"')，推測該化合物中應(yīng)有兩個1，4 二取代的苯基片段;兩組 ABX 偶合系統(tǒng)的芳香質(zhì)子信號 δ 7. 29 (1Η, d，J=2. IHz, H_2" ),7. 04 (1H, dd，J=8. 3，2.1Hz，H-6" )，6. 72(1H，d，J=8. 3Hz，H-5")和 δ 7. 23 (1H，d，J=L 8Hz，H_2)，7. 01 (1H，dd, J=8. 4,1.8Hz, H-6),6. 71 (1H, d，J=8. 4Hz, H_5)，推測該化合物中應(yīng)有兩個 1，3，4 三取代的苯基片段；一組反式雙鍵質(zhì)子信號5 7. 45 (1H, d，J=15. 9Hz, H_7 " ),6. 49 (1H, d，J=15.9Hz，H-8"); 一個孤立的烯氫信號δ7.23(1Η，s，Η_7)。高場區(qū)給出兩個甲氧基質(zhì)子信號δ3. 92 (3Η, s，3" -OCH3)，3. 66 (3Η，s，3_0CH3);兩組A2M2偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號δ 3. 47 (2H，t，J=7. 6Hz，H-8 " ' )，2· 75 (2H，t，J=7. 6Hz，Η_7 "')和 3· 46 (2Η，t，J=6. 9Hz，H-8' )，2. 64(2Η，t，J=6. 9Hz，H-7' ) (Τ。碳譜給出36個碳信號。低場區(qū)給出2個羰基碳信號δ 168. 9 (C=O)，δ 165. 6 (C=O);兩個孤立的連氧芳香碳信號δ 157.0 (C-4')，156.9(C-4"');兩對鄰二連氧取代的芳香碳信號δ 150.6(C-3" )，147. 6 (C_4 ")和149. 6 (C-4)，149. O (C_3) ;4 個烯鍵碳信號 δ 141. 7 (C-8)，141. I (C-7 " )，125. 4 (C-7)，121. I (C-8");高場區(qū)給出4個亞甲基碳信號5 42. 6,42. 2,35. 8,35. 6ο從氫譜、碳譜和分子量進一步說明化合物4應(yīng)為化合物3的二倍體。并且化合物4中只有3個烯氫信號，推測兩分子化合物3應(yīng)該在其中一組反式雙鍵處連接而成二倍體，這在HMBC相關(guān)譜中得到了證明。HMBC 譜中，δΗ δ7·23(Η-7)與 δ c 141. 7 (C_8)，168. 9 (C_9)，122. 3 (C-6)有遠(yuǎn)程相關(guān)，證明一分子化合物3的C-4" -OH與另一分子化合物3得8-H脫水而成醚。根據(jù)以上數(shù)據(jù)將該化合物鑒定為大麻酰胺己(cannabisin F),其推測結(jié)構(gòu)如下所示
權(quán)利要求
1.一種從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的方法，其提取步驟為枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣經(jīng)甲醇超聲提取3次，合并提取液，減壓干燥得甲醇總提取物，將甲醇總提取物加水溶解后，分別用等體積的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，減壓回收溶劑，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水層經(jīng)大孔樹脂柱處理，甲醇洗脫，得甲醇洗脫物、水洗脫物，采取α -葡萄糖苷酶活性體系追蹤，發(fā)現(xiàn)正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脫物均表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，將上述三種提取物經(jīng)硅膠柱色譜，ODS柱色譜以及高效液相制備色譜分離得到14個化合物，分別為N-反式-香豆酰酪胺(N- (p-trans-coumaroyl) tyramine) (I)、N-順式_香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl) tyramine) (2)、N-反式-對輕基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine) (3)、大麻酉先胺己(cannabisin F)(4)、大海米酸胺(grossamide) (5)、芥子醒(sinapaldehyde) (6)、阿魏醒(ferulaldehyde) (7)、對輕基苯甲醒(p-hydroxy benzaldehyde) (8)、香草酸(vanillic acid) (9)、對香豆酸(trans-p-hydroxycinnamic acid) (10)、3_ 輕基-1-(4-輕基-3-甲氧基苯基)丙-I-酮(3-hydroxy-l-(4-hydroxy-3_methoxyphenyl)propan-l-one) (11)、2, 3_ 二輕基-1_(4_ 輕基-3-甲氧基苯基)丙-I-酮(2,3-dihydroxy-l-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-l-one) (12)、東直菪素(scopoletine) (13),東直菪昔(scopoloside) (14)。
2.如權(quán)利要求I所述抑制劑在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用，是將其用作臨床治療II型糖尿病治療的首選藥和I型糖尿病的胰島素治療的輔助藥物。
3.如權(quán)利要求I所述抑制劑在制備預(yù)防艾滋病的藥物中的應(yīng)用，是將其用作預(yù)防艾滋病的輔助藥物。
4.如權(quán)利要求I所述抑制劑在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用，是將其用作阻止腫瘤血管生長的抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明是從枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制劑，其提取方法為枸杞籽及其提取枸杞油后的殘渣經(jīng)甲醇超聲提取3次，合并提取液，減壓干燥得甲醇總提取物，將甲醇總提取物加水溶解后，分別用等體積的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，減壓回收溶劑，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水層經(jīng)大孔樹脂柱處理，甲醇洗脫，得甲醇洗脫物、水洗脫物，采取α-葡萄糖苷酶活性體系追蹤，發(fā)現(xiàn)正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脫物均表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，將上述三種提取物經(jīng)硅膠柱色譜，ODS柱色譜以及高效液相制備色譜分離得到14個化合物。
文檔編號A61K31/343GK102872064SQ201210347818
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者李巍, 王英華, 小池一男, 付紅偉, 謝鵬 申請人:寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗所, 李巍