專利名稱：一種葉酸修飾殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)應(yīng)用領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種葉酸修飾殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法。
背景技術(shù)：
肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第三位。原發(fā)性肝癌在我國屬于高發(fā)病，一般男性多于女性。目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的一大殺手。早期肝癌以手術(shù)治療為主，但由于起病隱匿，早期癥狀不典型且診斷困難，確診時(shí)大多數(shù)患者已達(dá)到晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肝癌對(duì)放化療均不敏感，目前主要依賴介入(TACE)或藥物輔助治療，預(yù)后極差。目前已知肝癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移和多種基因突變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和新生血管增生異常密切相關(guān)，這些發(fā)病機(jī)理為分子靶向治療提供許多有利的靶點(diǎn)，逐漸成為新的研究靶點(diǎn)。在肝癌的過繼免疫治療方面，腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL)被作為治療研究領(lǐng)域之一，治療的方向放在誘導(dǎo)T細(xì)胞及NK細(xì)胞分泌IFN-Y及促進(jìn)CTL成熟，并且誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗血管效應(yīng)。但這種療法也有其缺陷性，原因是靶向到腫瘤局部的特異性CTL細(xì)胞數(shù)量有限，影響到免疫治療的效果。故人們開始研究一種基于趨化因子干擾素誘導(dǎo)蛋白10 (IP10)，作為促進(jìn)T細(xì)胞的定向趨化和活化增殖的促進(jìn)劑。
IPlO具有強(qiáng)大的趨化淋巴細(xì)胞和活化功能，可以定向募集T淋巴細(xì)胞并促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化和增殖，引起腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，并且具有抑制腫瘤新生血管生成的作用，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用。在借助IPlO的趨化作用下，CTL即可從注射部位靶向富集到腫瘤周圍特別是侵潤的腫瘤細(xì)胞周圍，故目前主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或者直接腫瘤局部多點(diǎn)注射等方法使腫瘤局部富集IP10。但這些方法存在靶向性、濃度以及體內(nèi)降解等問題，不能很好的富集到腫瘤細(xì)胞局部。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對(duì)現(xiàn)有肝癌的過繼免疫治療中藥物靶向性較差的缺陷，提供一種葉酸修飾殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子及其制備方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是構(gòu)造一種葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，包括以下步驟SI、將脫乙酰度大于95%的殼聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制備成5mg/mL的殼聚糖溶液，并調(diào)節(jié)PH值至4. 9-5. 2 ;在持續(xù)勻速攪拌作用下，將2mg/mL的三聚磷酸鈉溶液按照I. O: (I. 2-2. O)的體積比逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，形成物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液；
S2、在持續(xù)勻速攪拌作用下，將5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的體積比逐滴加入到所述物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液中，37° C水浴震蕩過夜，得到化學(xué)交聯(lián)后的殼聚糖溶液，并加入過量的NaBH4粉末；S3、對(duì)步驟S2制得的殼聚糖溶液進(jìn)行透析純化，得到殼聚糖納米粒子懸浮液；S4、用磷酸緩沖液將葉酸配成5mg/ml的葉酸溶液；將所述葉酸溶液、殼聚糖納米粒子懸浮液以及I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽按質(zhì)量比為10:1:5混合，在勻速攪拌作用下，室溫反應(yīng)30min ;透析去除未反應(yīng)的葉酸,得到葉酸修飾的殼聚糖納米粒子懸浮液；S5、將IPlO質(zhì)粒用25mmol/L的Na2SO4溶液稀釋至lmg/ml后與所述殼聚糖納米粒子懸浮液分別置于55° C水浴5-20min，按質(zhì)量比為10:1迅速混合后，在渦輪振蕩器上以2000rpm的震蕩速率震蕩30-50秒，室溫下靜置30min ;并在4° C下>10，OOOg離心20min， 然后用磷酸緩沖液重懸，形成乳白色懸液，制得葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子。在根據(jù)本發(fā)明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法中，所述步驟SI中用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 9-5. 2，所述持續(xù)勻速攪拌為500rpm，所述逐滴滴入為I滴/秒的速率。在根據(jù)本發(fā)明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S2中所述水浴震蕩的震蕩速率為120rpm。在根據(jù)本發(fā)明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S3中透析純化使用的透析袋的截留分子量為8000-14000，透析時(shí)間為2小時(shí)。在根據(jù)本發(fā)明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S4中所述勻速攪拌的速度為200rpm ;所述透析去除未反應(yīng)的葉酸使用截留分子量為8000-14000的透析袋。本發(fā)明還提供了一種葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子，采用前述的制備方法制得。實(shí)施本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子及其制備方法，具有以下有益效果本發(fā)明采用葉酸修飾殼聚糖納米粒子，并對(duì)IPlO質(zhì)粒進(jìn)行包裹，制得葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子，本發(fā)明通過適當(dāng)?shù)闹苽錀l件獲得的納米粒子粒徑適中，形態(tài)好，產(chǎn)量高，通過靜脈注射給藥后，經(jīng)血液循環(huán)途徑直接靶向腫瘤局部，由于材料的體積優(yōu)勢(shì)，在體內(nèi)可以降低粒子被網(wǎng)狀上皮系統(tǒng)清除速率，延長粒子在血液循環(huán)系統(tǒng)中的停留時(shí)間。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中圖I所示為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖納米粒子的制備過程化學(xué)反應(yīng)原理圖；圖2所示為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法流程圖；圖3所示為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的粒徑分布圖；圖4A所示為未采用葉酸修飾的殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的掃描電鏡圖，圖4B為葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的掃描電鏡圖5所示為葉酸、殼聚糖和本發(fā)明所述葉酸修飾殼聚糖納米粒子的傅里葉變換紅外光譜表征；圖6所示為葉酸、殼聚糖和本發(fā)明所述葉酸修飾殼聚糖納米粒子的X射線衍射表征；圖7所示為本發(fā)明的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖8A-圖8F所示為H22細(xì)胞吞噬本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9所示為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子給藥效果檢測(cè)中小鼠腫瘤生長曲線；圖10所示為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子給藥效果檢測(cè)中小鼠 生存率；圖IlA-圖IlD所示為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO納米粒子對(duì)小鼠腫瘤的治療效果照片。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。請(qǐng)參閱圖1，為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖納米粒子的制備過程化學(xué)反應(yīng)原理圖。本發(fā)明利用葉酸對(duì)殼聚糖進(jìn)行修飾，制備葉酸修飾的殼聚糖納米粒子。如圖I中所示，葉酸的羧基在I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的作用下被激活后與殼聚糖的氨基發(fā)生脫水縮合形成穩(wěn)定的酰胺鍵。請(qǐng)參閱圖2，為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法流程圖。如圖2所示，本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法包括以下步驟首先，在步驟SI中，采用三聚磷酸鈉制備物理交聯(lián)的殼聚糖納米粒子。步驟SI具體包括S1-1、將脫乙酰度> 95%的殼聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制備成5mg/mL的溶液，并用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 9-5. 2，制備成殼聚糖溶液A ；S1-2、將三聚磷酸鈉用蒸餾水配置成2mg/mL的三聚磷酸鈉溶液B ；S1-3、在500rpm持續(xù)勻速攪拌作用下，按照溶液A:溶液B= (I. 2-2. O) : I. O的體積比將三聚磷酸鈉溶液B按照I滴/秒的速率逐滴加入到殼聚糖溶液A中，形成物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液C。隨后，在步驟S2中，加入戊二醛進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。步驟S2具體包括S2-1、將戊二醛配置成5wt%的戊二醛溶液D ；S2-2、在持續(xù)勻速攪拌作用下，按照溶液D:溶液C=I: 12-15的體積比將所述戊二醛溶液D加入到物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液C中，以120rpm的震蕩速率37° C水浴震蕩過夜，形成化學(xué)交聯(lián)后的殼聚糖溶液E ;S2-3、在化學(xué)交聯(lián)后的殼聚糖溶液E中進(jìn)一步加入過量的NaBH4粉末，以還原殼聚糖的氨基與戊二醛形成的希夫氏堿。
隨后，在步驟S3中，對(duì)所述化學(xué)交聯(lián)后的殼聚糖溶液E進(jìn)行透析純化，得到殼聚糖納米粒子懸浮液F。步驟S3具體為使用截留分子量為8000-14000的透析袋，透析時(shí)間為2小時(shí)。隨后，在步驟S4中，用葉酸對(duì)殼聚糖納米粒子進(jìn)行修飾，其中，葉酸的羧基在I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的作用下被激活后與殼聚糖的氨基發(fā)生脫水縮合形成穩(wěn)定的酰胺鍵。步驟S4具體包括S4-1、細(xì)胞培養(yǎng)基級(jí)別的葉酸用磷酸緩沖液配成5mg/ml的葉酸溶液G ；S4-2、將葉酸溶液G、殼聚糖納米粒子懸浮液F、I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽按質(zhì)量比為10:1:5混合、在200rpm勻速攪拌作用下，室溫反應(yīng)30min ；S4-3、使用截留分子量為8000-14000的透析袋透析去除未反應(yīng)的葉酸，得到葉酸修飾的殼聚糖納米粒子懸浮液H?！るS后，在步驟S5中，采用Na2SO4誘導(dǎo)的復(fù)凝聚沉淀法制備含IPlO質(zhì)粒的葉酸修飾的殼聚糖納米粒子。步驟S5具體包括S5-1、將IPlO質(zhì)粒用25mmol/L的Na2SO4溶液稀釋至lmg/ml后與葉酸修飾的殼聚糖納米粒子懸浮液H分別置于55° C水浴5-20min，按質(zhì)量比為10:1迅速混合后，在渦輪振蕩器上以2000rpm的震蕩速率震蕩30-50秒，室溫下靜置30min ；S5_2、4° C下>10，OOOg離心20min，然后用磷酸緩沖液重懸，形成乳白色懸液，制得葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子。本發(fā)明還提供了采用上述制備方法制得的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子。葉酸(folic acid, FA)是人體必需的但又無法合成的一種維生素，自1986年B. A. Kamen發(fā)現(xiàn)葉酸是由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞并能與腫瘤細(xì)胞表面葉酸表達(dá)受體結(jié)合以來，人們開始了以葉酸作為靶向配體的研究。葉酸受體在許多腫瘤細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，有時(shí)可比正常組織高出100-300倍。此受體主要在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，在正常組織中沒有或很少表達(dá)，故具有很好的腫瘤組織特異性。在人類許多腫瘤中均有葉酸受體的高表達(dá)，靶向應(yīng)用的范圍很廣。葉酸受體系統(tǒng)有以下獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)(1)結(jié)構(gòu)比較簡單，容易合成，購買價(jià)格低廉；(2)體積較小，易修飾到納米級(jí)生物材料上，并在體內(nèi)易吸收；(3)具有很好的腫瘤組織特異性，在人類大多腫瘤上表達(dá)，靶向應(yīng)用的范圍很廣。甲殼素是一種天然有機(jī)高分子多糖，廣泛存在于甲殼素類動(dòng)物的外殼中，殼聚糖是甲殼素的衍生物，殼聚糖分子上存在大量的氨基，在水溶液中能解離成大量的正電荷，很容易進(jìn)行功能基團(tuán)的修飾。目前基因治療主要面臨的一大難題即是進(jìn)入體內(nèi)的穩(wěn)定性以及在體內(nèi)所停留的時(shí)間，殼聚糖作為一種非病毒載體具有良好的生物相容性、可降解、對(duì)細(xì)胞及組織無毒性，能有效保護(hù)負(fù)載的質(zhì)?；蚧蚱卧谶M(jìn)入體內(nèi)不被體液中核酸酶所降解。本發(fā)明采用離子模板法制備殼聚糖納米粒子，操作簡單，殼聚糖與葉酸原料易得低廉。主要通過三聚磷酸鈉為模板，在酸性條件下通過三聚磷酸鈉上的負(fù)電荷與殼聚糖上的正電荷相結(jié)合而形成納米粒子，再通過戊二醛的作用形成更緊密結(jié)合的納米粒子。通過控制三聚磷酸鈉與殼聚糖上氨基的比例、轉(zhuǎn)速、戊二醛的用量來控制粒徑的大小。離子模板法相較于傳統(tǒng)的制備方法具有操作簡便、能在溫和條件下迅速生成粒徑幾十至數(shù)百納米的殼聚糖納米粒，不需使用有機(jī)溶劑，反應(yīng)過程簡便迅速，所以具有很高的使用價(jià)值。雖然納米粒子的藥物控釋已經(jīng)得到一定程度的發(fā)展，但是針對(duì)不同的高分子載體材料以及被裝載的物質(zhì)，所需的制備工藝及參數(shù)也不同。本發(fā)明針對(duì)IPlO采用前述制備方法制得的葉酸修飾殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的粒徑適中，便于注射給藥，通過血液循環(huán)靶向性到達(dá)腫瘤部位。目前IP-10質(zhì)粒大多單獨(dú)治療、制備成融合蛋白或者聯(lián)合抗癌藥物使用，但是單獨(dú)使用的IPio具有一定的局限性，即使在腫瘤局部注射也是短暫停留，并不能長久發(fā)揮其作用。實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的關(guān)鍵是要使用高效安全的基因?qū)胂到y(tǒng)，本發(fā)明采用葉酸修飾的殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒能特異性的靶向至腫瘤局部并被腫瘤細(xì)胞所吞噬，殼聚糖納米粒子本身具有很好的生物相容性，從而將外源基因安全送至腫瘤細(xì)胞中。本發(fā)明用這種納米粒子生物材料對(duì)BALB/c荷瘤小鼠進(jìn)行尾靜脈注射,通過血液循環(huán)途徑直接靶向腫瘤局部，由于納米粒子材料的體積優(yōu)勢(shì)，在體內(nèi)可以降低粒子被網(wǎng)狀上皮系統(tǒng)清除速率，延長粒子在血液循環(huán)系統(tǒng)中的停留時(shí)間。請(qǐng)參閱圖3，為根據(jù)本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的粒徑分布圖。其中CS-IPlO為未采用葉酸修飾的殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子；FA-CS-IP10為葉 酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子?？梢钥吹?，葉酸修飾后殼聚糖水化粒徑的主峰從396nm 減小至 342nm。請(qǐng)參閱圖4A為未采用葉酸修飾的殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的掃描電鏡圖，圖4B為葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的掃描電鏡圖?？梢钥吹?，未采用葉酸修飾的殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子為空載殼聚糖，其透射電鏡形態(tài)大小均一，表面形貌有些粗糙；葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子不再呈現(xiàn)出圓球形的結(jié)構(gòu)，有些類似于方形，且粒徑變小。請(qǐng)參閱圖5，為葉酸、殼聚糖和本發(fā)明所述葉酸修飾殼聚糖納米粒子的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)表征。從FTIR吸收峰可以看到，葉酸的羧基與殼聚糖的氨基反應(yīng)形成的羧基。請(qǐng)參閱圖6,為葉酸、殼聚糖和本發(fā)明所述葉酸修飾殼聚糖納米粒子的X射線衍射(XRD)表征。從該XRD衍射圖譜可以看到，葉酸修飾殼聚糖(FA-CS)呈現(xiàn)出無定形相，葉酸(FA)和殼聚糖(CS)的特征峰均消失，這是由于葉酸分子結(jié)構(gòu)較氨基復(fù)雜得多，當(dāng)葉酸接枝在殼聚糖的氨基上時(shí)，阻礙了殼聚糖分子鏈的運(yùn)動(dòng)。請(qǐng)參閱圖7，為本發(fā)明的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體為IPlO質(zhì)粒、殼聚糖納米粒子、殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子和葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中第O泳道分子量標(biāo)準(zhǔn)品(marker)，第I泳道IP10質(zhì)粒，第2泳道殼聚糖納米粒子,第3泳道殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子,第4泳道葉酸修飾的殼聚糖包裹IPio質(zhì)粒納米粒子。由于殼聚糖帶正電荷在瓊脂糖膠上不出現(xiàn)條帶，從3、4泳道可以看出殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒成功。請(qǐng)參閱圖8A-C為H22細(xì)胞吞噬殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖8D-F為H22細(xì)胞吞噬葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖8A-F均為37° C下孵育4h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。其中圖8A和圖8D為DAPI染核顯藍(lán)色熒光，圖8B和圖8E為FITC修飾殼聚糖顯綠色熒光，圖8C為圖8A和圖8B的融合圖，圖8F為圖8D和圖SE的融合圖?？梢钥闯?，H22細(xì)胞吞噬殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子，可看見個(gè)別細(xì)胞吞噬現(xiàn)象但熒光不強(qiáng)；而H22細(xì)胞吞噬葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子，幾乎所有細(xì)胞均有吞噬現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)熒光較強(qiáng)，說明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子可被H22細(xì)胞特異吞噬。請(qǐng)參閱圖9，為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子給藥效果檢測(cè)中小鼠腫瘤生長曲線，實(shí)驗(yàn)組別包括PBS處理組、IPlO處理組、殼聚糖包裹IPlO納米粒子(CS-IPlO)處理組，葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO納米粒子(FA-CS-IPio)處理組，各組小鼠分別在第5、12、19天給與藥物治療?？梢钥吹剑現(xiàn)A-CS-IPlO處理組與對(duì)照組相比腫瘤生長速度較慢，表明FA-CS-IPlO可顯著減慢腫瘤生長速度。請(qǐng)參閱圖10，為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO質(zhì)粒納米粒子給藥效果檢測(cè)中小鼠生存率，實(shí)驗(yàn)組別包括PBS處理組、IPlO質(zhì)粒處理組、殼聚糖包裹IPlO納米粒子(CS-IPlO)處理組、葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO納米粒子(FA-CS-IPio)處理組?？梢钥吹?，F(xiàn)A-CS-IPlO處理組與對(duì)照組生存曲線有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小鼠生存率得到顯著提高。 請(qǐng)參閱圖IlA-C分別為本發(fā)明葉酸修飾殼聚糖包裹IPlO納米粒子(FA-CS-IP10)、殼聚糖包裹IPlO納米粒子(CS-IPlO)和IPlO質(zhì)粒給藥效果檢測(cè)中治療20天后小鼠腫瘤生長情況照片，圖IlD為PBS處理組。收集處于對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，對(duì)4_6周BALB/c小鼠進(jìn)行左下腹皮下種瘤，每只細(xì)胞數(shù)2X IO6/個(gè)。成瘤后分組予以不同處理，觀察腫瘤生長大小。在20天可觀察到葉酸修飾的殼聚糖IP-10納米粒子治療組較對(duì)照組有明顯抑制腫瘤生長的作用。本圖從直觀上說明葉酸修飾的殼聚糖ip- ο納米粒子通過血液循環(huán)作用直接靶向腫瘤抑制腫瘤生長。本發(fā)明是根據(jù)特定實(shí)施例進(jìn)行描述的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白在不脫離本發(fā)明范圍時(shí)，可進(jìn)行各種變化和等同替換。此外，為適應(yīng)本發(fā)明技術(shù)的特定場(chǎng)合或材料，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行諸多修改而不脫離其保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開的特定實(shí)施例，而包括所有落入到權(quán)利要求保護(hù)范圍的實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 51、將脫乙酰度大于95%的殼聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制備成5mg/mL的殼聚糖溶液，并調(diào)節(jié)PH值至4. 9-5. 2 ;在持續(xù)勻速攪拌作用下，將2mg/mL的三聚磷酸鈉溶液按照I. O: (I. 2-2. O)的體積比逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，形成物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液； 52、在持續(xù)勻速攪拌作用下，將5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的體積比逐滴加入到所述物理交聯(lián)后的殼聚糖溶液中，37° C水浴震蕩過夜，得到化學(xué)交聯(lián)后的殼聚糖溶液，并加入過量的NaBH4粉末； 53、對(duì)步驟S2制得的殼聚糖溶液進(jìn)行透析純化，得到殼聚糖納米粒子懸浮液； 54、用磷酸緩沖液將葉酸配成5mg/ml的葉酸溶液；將所述葉酸溶液、殼聚糖納米粒子懸浮液以及I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽按質(zhì)量比為10:1:5混合，在勻速攪拌作用下，室溫反應(yīng)30min ;透析去除未反應(yīng)的葉酸,得到葉酸修飾的殼聚糖納米粒子懸浮液； 55、將IPlO質(zhì)粒用25mmol/L的Na2SO4溶液稀釋至lmg/ml后與所述殼聚糖納米粒子懸浮液分別置于55° C水浴5-20min，按質(zhì)量比為10:1迅速混合后，在渦輪振蕩器上以2000rpm的震蕩速率震蕩30-50秒，室溫下靜置30min ;并在4° C下>10，OOOg離心20min，然后用磷酸緩沖液重懸，形成乳白色懸液，制得葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟SI中用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 9-5. 2，所述持續(xù)勻速攪拌為500rpm，所述逐滴滴入為I滴/秒的速率。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中所述水浴震蕩的震蕩速率為120rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中透析純化使用的透析袋的截留分子量為8000-14000，透析時(shí)間為2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中所述勻速攪拌的速度為200rpm ;所述透析去除未反應(yīng)的葉酸使用截留分子量為8000-14000的透析袋。
6.—種葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子,其特征在于,采用權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的制備方法制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子及其制備方法，該方法包括以下步驟S1、采用三聚磷酸鈉制備物理交聯(lián)的殼聚糖納米粒子；S2、加入戊二醛溶液進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；S3、殼聚糖納米粒子的透析純化；S4、殼聚糖納米粒子的葉酸修飾S5、Na2SO4誘導(dǎo)的復(fù)凝聚沉淀法制備含IP10質(zhì)粒的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子。本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖包裹質(zhì)粒納米粒子通過靜脈注射給藥后，經(jīng)血液循環(huán)途徑直接靶向腫瘤局部，由于材料的體積優(yōu)勢(shì)，在體內(nèi)可以降低粒子被網(wǎng)狀上皮系統(tǒng)清除速率，延長粒子在血液循環(huán)系統(tǒng)中的停留時(shí)間。
文檔編號(hào)A61K38/19GK102824306SQ20121033320
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者盧小玲, 趙永祥 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)