一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，所述方法包括步驟：（1）將膜片加至具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架上；（2）在膜片上加軟骨細胞懸液；（3）在步驟（2）產(chǎn)生的軟骨細胞懸液上加膜片；（4）重復(fù)步驟（2）和（3），得到復(fù)合物；（5）體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
【專利說明】一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用預(yù)制具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架構(gòu)建組織工程軟骨。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨是一種無血管的組織，因其自我修復(fù)能力低下，所以軟骨損傷或畸形一直以來都是臨床治療的一大難題。組織工程技術(shù)為軟骨缺損修復(fù)提供了一種全新的治療手段。軟骨構(gòu)建中除了解決細胞、材料這兩個關(guān)鍵問題以外，如何構(gòu)建具有三維精細結(jié)構(gòu)的軟骨組織是一難點。機體軟骨的缺損形態(tài)多種多樣，如關(guān)節(jié)軟骨的運動損傷性缺損，尤其是臨床上非常常見的先天性小耳畸形，這就要求組織工程軟骨也能預(yù)制成不同的形狀。目前臨床修復(fù)先天性小耳畸形的主要手段是利用肋軟骨進行雕琢形成人耳樣結(jié)構(gòu)修補損傷位置，其往往是拆東墻補西墻，且容易造成氣胸或軟骨缺損引起的呼吸反常等缺點。傳統(tǒng)方法是先將材料預(yù)制成特定的三維形狀，然后接種細胞，從而實現(xiàn)特定形狀組織的構(gòu)建。而膜片本身不具備三維結(jié)構(gòu)，如何應(yīng)用膜片實現(xiàn)具有三維結(jié)構(gòu)組織的構(gòu)建成為研究的重點。
[0003]因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的可實現(xiàn)特定形狀組織構(gòu)建的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種新的構(gòu)建組織工程軟骨的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，所述方法包括步驟:
[0006](I)將膜片加至具有三維結(jié)構(gòu)的形狀支架上；
`[0007](2)在膜片上加軟骨細胞懸液；
[0008](3)在步驟(2)產(chǎn)生的軟骨細胞懸液上加膜片；
[0009](4)重復(fù)步驟(2)和(3)，得到復(fù)合物；
[0010](5)體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述具有三維結(jié)構(gòu)的形狀支架的材質(zhì)選自鈦合金、金屬材料、或高分子合成材料。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述支架的特點是要有一定力學(xué)強度，可塑型，不變形，不對細胞產(chǎn)生毒副作用。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述具有三維結(jié)構(gòu)的形狀選自耳廓形狀、鼻翼或下頜。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述耳廓形狀可以是正常耳廓形狀，也可以是畸形耳廓形狀。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述膜片選自軟管脫細胞基質(zhì)膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90 ;更佳地，重量比為70: 30-30: 70;最佳地，為70: 30-50: 50。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7_12mm的圓形。[0018]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為10-30 ii m。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150 X 106/ml，每次所加軟骨細胞懸液為1-1Oii I。
[0020]在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中重復(fù)步驟(2)和(3) 5-15次。
[0021]在另一優(yōu)選例中，步驟(4)得到的復(fù)合物上覆蓋培養(yǎng)液后再進行體外培養(yǎng)。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述全身軟管組織是耳廓、肋骨、或關(guān)節(jié)等。
[0024]據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的可實現(xiàn)特定形狀組織構(gòu)建的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是鈦合金人耳廓支架大體觀(A)，軟骨脫細胞膜片大體觀(B)，Gelatin/PCL納米纖維電紡膜大體觀(C)以及軟骨細胞鏡下觀(D)。
[0026]圖2顯示了鈦合金人耳廓支架大體觀(A)，軟骨脫細胞膜片復(fù)合軟骨細胞構(gòu)建人耳軟骨即刻大體觀(B)以及Gelatin/PCL納米纖維電紡膜復(fù)合軟骨細胞構(gòu)建人耳軟骨即刻大體觀(C)。
[0027]圖3 軟骨脫細胞膜片(Acellular cartilage sheets, ACS)和 Gelatin/PCL 納米纖維電紡膜復(fù)合軟骨細胞構(gòu)建人耳軟骨體外培養(yǎng)2周大體觀(A)，植入體內(nèi)6周后大體觀(B，C)以及體內(nèi)6周HE染色(D)。
[0028]圖4組織工程構(gòu)建人耳軟骨與鈦合金支架激光掃描的結(jié)構(gòu)吻合度比較。
【具體實施方式】
[0029]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)利用膜片濕潤后柔軟的特性，先預(yù)制特定耳廓三維結(jié)構(gòu)的剛性材質(zhì)支架，以該支架為模板，將膜片與細胞復(fù)合，構(gòu)建立體結(jié)構(gòu)與預(yù)制模板一致的三維軟骨組織。同時發(fā)現(xiàn)，可以使用一定比例的Gelatin (明膠)/PCL(polycaprolactone,聚己酸丙酯)納米纖維材料作為組織工程支架材料,并且通過“三明治法”將Gelatin/PCL納米纖維材料(膜片形式)和軟骨細胞按“膜片_細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在培養(yǎng)皿中層層疊加所得到的復(fù)合物，經(jīng)過體外培養(yǎng)可以有效構(gòu)建組織工程軟骨。
[0030]本發(fā)明提供的構(gòu)建組織工程軟骨的方法是壓制得到具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架，然后將種子細胞接種于在該支架上的生物可降解材料上，形成種子細胞-材料-支架復(fù)合物，然后在體外培養(yǎng)條件下(例如在常規(guī)的含5%C02的37°C培養(yǎng)箱中)進行體外培養(yǎng)可以得到可用于移植的組織工程化軟骨。也可以進一步地，在體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)使進一步地生長。在本發(fā)明的一個實施例中，是在體外培養(yǎng)后植入哺乳動物皮下。
[0031]在本發(fā)明提供的上述組織工程軟管的構(gòu)建方法中，是以鈦合金為材料壓制出具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架。在一實施例中，CT掃描正常成人耳朵，根據(jù)掃描數(shù)據(jù)通過三維打印技術(shù)制備微縮版耳廓模具，以鈦合金為材料壓制出具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架。
[0032] 在本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，所使用的生物可降解材料優(yōu)選膜片，所述膜片選自軟管脫細胞基質(zhì)膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
[0033]如本文所用，“膜片”是指天然或合成的厚度在5-50 U m的膜狀材料。[0034]本發(fā)明所述軟管脫細胞基質(zhì)膜片可以使用常規(guī)方法獲得，例如但不限于，將動物耳廓軟骨，用角膜環(huán)鉆切成圓柱狀，冰凍切片機切成厚度8-12 μ m的圓形薄片，置入十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，震蕩，切片用水漂洗數(shù)次，凍干備用。
[0035]本發(fā)明所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜中，Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90，優(yōu)選 70: 30-30: 70，更優(yōu)選 70: 30-50: 50。
[0036]如本文所用，“Gelatin/PCL納米纖維電紡膜”是一種電紡納米纖維材料，由Gelatin和PCL構(gòu)成，成膜狀，厚度10-30 μ m，優(yōu)選橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0037]本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，所使用的種子細胞可以是成熟的軟骨細胞，也可以是具有成軟骨分化能力的干細胞。軟骨細胞可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲得，例如但不限于，酶消化法從軟骨組織塊中消化獲得細胞。
[0038]本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，種子細胞-材料-支架復(fù)合物的形成過程是將鈦合金耳廓支架凸面朝上至于培養(yǎng)皿中，將膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在鈦合金耳廓支架上層層疊加，均勻覆蓋支架。細胞懸液中軟骨細胞的濃度為50-150 X 106/ml，優(yōu)選為80-120 X 106/ml ;每層細胞懸液1_10μ 1，優(yōu)選為3-7 μ 1，每層細胞懸液量以濕潤每張膜片為準(zhǔn)；疊加層數(shù)為10-30層，優(yōu)選為15-25層。
[0039]在本發(fā)明的一個實施例中，通過上述層層疊加的方式獲得復(fù)合物后，靜置0.5-2小時，將含有5-15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復(fù)合物，再進行體外培養(yǎng)。
[0040]在本發(fā)明的一個實施例中，體外培養(yǎng)1-3周后植入哺乳動物皮下4-8周。
[0041]本發(fā)明提供的方法適用于構(gòu)建不同三維形狀的軟骨，不僅限于耳廓，并且支架形態(tài)決定構(gòu)建組織形態(tài)。
[0042]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0043]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0044]1、本發(fā)明利用膜片濕潤后柔軟的特性，先預(yù)制特定三維結(jié)構(gòu)的鈦合金耳廓支架，以鈦合金支架為模板，三明治法將膜片與細胞復(fù)合，經(jīng)過體外和體內(nèi)的培養(yǎng)，最終構(gòu)建出立體結(jié)構(gòu)與預(yù)制模板一致的三維軟骨組織。結(jié)果顯示該構(gòu)建方式得到的人耳廓軟骨三維形態(tài)維持良好，所形成的軟骨組織成熟均一。
[0045]2、本發(fā)明建立了一個全新的構(gòu)建特定形狀三維精細結(jié)構(gòu)軟骨的方法:利用膜片材料柔軟的特性，先預(yù)制特殊形態(tài)的三維支架模版(這一模版可以使用不同的材質(zhì))，然后以模板為支架貼付一定層數(shù)的膜片類生物可降解材料，層與層之間接種具有成軟骨能力的細胞(軟骨細胞、間充質(zhì)干細胞等)，最終可在體外和體內(nèi)構(gòu)建特定形狀的軟骨組織。
[0046]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計。
[0047]本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。[0048]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0049]實施例
[0050]材料和方法:
[0051]一、耳廓形狀鈦合金支架的制備
[0052]CT掃描正常成人耳朵，根據(jù)掃描數(shù)據(jù)通過三維打印技術(shù)制備微縮版(2:1)耳廓模具，以鈦合金為材料壓制出具有三維結(jié)構(gòu)的耳廓形狀支架(圖1A)，75%酒精消毒備用。
[0053]二、軟骨脫細胞基質(zhì)膜片制備
[0054]取新鮮成年豬耳廓軟骨，用角膜環(huán)鉆切成直徑9mm的圓柱狀，冰凍切片機切成厚度IOiim的圓形薄片，置入1%SDS (上海生工)溶液，于搖床震蕩過夜。切片用蒸餾水漂洗數(shù)次，用冷凍干燥機(Virtis，美國)凍干備用(圖1B)。
[0055]三、Gelatin/PCL納米纖維電紡膜的準(zhǔn)備
[0056]本實驗所用的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料中Gelatin:PCL比例為50:50，購自東華大學(xué)生物研究所。將該材料裁減成近橢圓形，大小比金屬耳廓支架略大，材料經(jīng)真空冷凍干燥24小時處理后備用(圖1C)。
[0057]四、耳廓軟骨細胞培養(yǎng)
[0058]取新生豬耳廓軟骨組`織，切成IX IX Imm大小，加入0.1%膠原酶消化過夜，用75 y m孔徑的濾網(wǎng)濾過后,加入高糖DMEM(Hyclone,美國)含10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,美國)的培養(yǎng)液，置于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至80%-90%融合后傳代(圖1D)。
[0059]五、三明治法構(gòu)建軟骨
[0060]用0.25%胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)的軟骨細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸至濃度100X 106/ml，將鈦合金耳廓支架凸面朝上至于培養(yǎng)皿中(圖2A)，將膜片和軟骨細胞按“膜片-細胞懸液-膜片-細胞懸液”的方式在鈦合金耳廓支架上層層疊加，均勻覆蓋支架(圖2B，C)，細胞懸液量以濕潤每張膜片為標(biāo)準(zhǔn)，共疊加15層膜片。靜置I小時后加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復(fù)合物，置于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液，體外培養(yǎng)2周后植入裸鼠皮下，體內(nèi)6周后取材。
[0061]六、構(gòu)建軟骨的組織學(xué)檢測
[0062]HE染色:將切片脫蠟至水后，蘇木素染色8分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗返藍30分鐘，伊紅染色2分鐘后乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0063]II型膠原免疫組織化學(xué)染色:切片脫蠟至水后，加入3%過氧化氫乙醇溶液室溫下放置10分鐘，(磷酸緩沖液)PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37°C消化30分鐘；PBS漂洗3次，山羊血清封閉30分鐘，吸去血清后加入1:200稀釋的一抗(abcam，美國)，4°C過夜后加入二抗，37°C溫箱I小時，后用3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺顯色。
[0064]Safranin’O染色:將切片脫臘至水后Safranin’O液染5分鐘；乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0065]甲苯胺藍染色:將切片脫蠟至水后甲苯胺藍染液5分鐘，乙醇脫水，二甲苯透明后封片觀察。
[0066]七、三維立體激光掃描[0067] 為了檢測所構(gòu)建的耳廓軟骨外形與鈦合金耳廓支架的吻合度，利用三維立體激光掃描系統(tǒng)(Konica Minolta, Tokyo, Japan)分別對鈦合金耳廓支架和以軟骨脫細胞膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構(gòu)建的耳廓軟骨進行立體掃描成像，掃描得到的數(shù)據(jù)經(jīng)系統(tǒng)處理后可以得出構(gòu)建所得的耳廓軟骨與鈦合金耳廓支架的吻合度情況。
[0068]結(jié)果
[0069]1.三明治法構(gòu)建耳廓形態(tài)軟骨
[0070]應(yīng)用CT掃描、三維打印和模壓技術(shù)，可以制備出特定人耳廓形狀的鈦合金支架(圖2A)，以此支架為模板應(yīng)，應(yīng)用軟骨脫細胞膜片或人工合成可降解Gelatin/PCL納米纖維電紡膜，以三明治法接種軟骨細胞后，可以得到與鈦合金支架立體結(jié)構(gòu)吻合的細胞-材料復(fù)合物(圖2B，C)，在鈦合金支架的依托下體外培養(yǎng)或移植裸鼠皮下，細胞-材料復(fù)合物均維持良好的三維結(jié)構(gòu)(圖3)，經(jīng)三維立體激光掃描成像檢測，以軟骨脫細胞膜片和Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構(gòu)建的耳廓軟骨與鈦合金耳廓支架和吻合度分別達到了84.1% 和 85.6% (圖 4)。
[0071]2.構(gòu)建軟骨的組織學(xué)檢測
[0072]經(jīng)過體外或體內(nèi)培養(yǎng)的組織切片顯示為軟骨組織，軟骨陷窩清晰可見，分泌細胞外基質(zhì)能力旺盛。組織中仍然可見未完全降解的脫細胞膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料但膜片和細胞交界模糊，多處可見細胞長入膜片內(nèi)部形成陷窩，連通了不同層膜片之間的細胞群體(圖3D)。
[0073]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)將膜片加至具有三維結(jié)構(gòu)的形狀支架上； (2)在膜片上加軟骨細胞懸液； (3)在步驟(2)產(chǎn)生的軟骨細胞懸液上加膜片； (4)重復(fù)步驟(2)和(3)，得到復(fù)合物； (5)體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有三維結(jié)構(gòu)的形狀支架的材質(zhì)選自鈦合金、金屬材料、或高分子合成材料。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜片選自軟管脫細胞基質(zhì)膜片或Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為90: 10-10: 90 ;優(yōu)選重量比為70: 30-30: 70 ;更優(yōu)選為70: 30-50: 50。
5.如權(quán)利要求3 所述的方法,其特征在于,所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7-12mm的圓形。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為 10-30 u m。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞懸液中的軟骨細胞濃度為50-150 X 106/ml，每次所加軟骨細胞懸液為1-10 yl。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中重復(fù)步驟(2)和(3)5-15次。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)得到的復(fù)合物上覆蓋培養(yǎng)液后再進行體外培養(yǎng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細胞來自全身軟骨組織。
【文檔編號】A61F2/00GK103622762SQ201210303600
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月23日
【發(fā)明者】張文杰, 薛繼鑫, 龔軼一, 鄭蕊, 周廣東, 劉偉, 曹誼林 申請人:上海國睿生命科技有限公司