專利名稱：Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物新用途技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的年發(fā)病率約6 16/100000人，約占腦卒中總發(fā)病率的6 8%，顱內(nèi)動脈瘤破裂是自發(fā)性SAH的主要原因。近年來的研究認為，自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的早期腦損傷(early brain injury,EBI)是影響自發(fā)性SAH患者預(yù)后的主要因素。但目前國內(nèi)外關(guān)于EB I的研究較少，且EBI的病理機制尚未闡明。
蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)急危重癥，影響SAH患者預(yù)后的主要因素是早期腦損傷和血管痙攣等并發(fā)癥。越來越多的國內(nèi)外學者認為蛛網(wǎng)膜下腔出血后存在的早期腦損傷(Early brain injury,EBI)是SAH早期致死致殘的主要原因；認為EBI是多因素、多途徑的病理過程，其中神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡起重要作用。因此，對早期腦損傷的干預(yù)成為能夠改善蛛網(wǎng)膜下腔出血預(yù)后的主要研究方向。Cystatin C是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質(zhì)，分子量為13. 3KD,由120個氨基酸殘基組成，等電位9. 3，由CST3基因編碼，為半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員，也稱為胱抑素C，Y-微量蛋白及Y-后球蛋白，可由機體所有有核細胞產(chǎn)生，無組織學特異性，產(chǎn)生率恒定。Cystatin C廣泛存在于人類的體液中,在腦脊液中濃度最高,約占2 4%，是血液中的5. 5倍。Cystatin C在生理條件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。腦脊液中的Cystatin C主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和脈絡(luò)叢。Cystatin C因其分子量小，能自由通過腎小球濾過膜，幾乎完全被腎小管重吸收且不被分泌，其血中濃度不受炎癥、肌肉量、腎小管分泌因素的影響，因此，能替代肌酐成為一種新的反映GFR的理想標志物而在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。除此之外，Cystatin C在生理條件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。本發(fā)明因此而來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的新用途，揭示了一種蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的新治療途徑。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的藥物組合物中的應(yīng)用。優(yōu)選的,所述藥物組合物包含藥學上有效量的Cystatin C和藥學上可接受的載體。優(yōu)選的，所述藥物組合物中Cystatin C的含量大于等于藥學上最小有效量，小于等于藥學上的最大有效量。其中藥學上最小有效量為能引起藥理效應(yīng)的最小劑量。藥學上的最大有效量(或稱最大耐受量)為不引起治療對象死亡的最大劑量或濃度。從本發(fā)明的試驗方案可以看出本發(fā)明中藥學上的最大有效量小于最小中毒量；劑量增加到能引起中毒的最低量稱為最小中毒量。本發(fā)明的給藥劑量根據(jù)給藥動物以及給藥方式的不同而進行相應(yīng)的調(diào)整。本發(fā)明通過觀察Cystatin C干預(yù)后大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫指數(shù)、神經(jīng)功能缺損評分、血腦屏障通透性的變化及皮層腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化，初步探討Cystatin C在實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用。具體方法是采用成年雄性SD大鼠48只，隨機分為假手術(shù)組、SAH組、安慰劑組、藥物組(分為低濃度、中濃度、高濃度)。采用視交叉池注血技術(shù)建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。各組分別于建模成功后48h內(nèi)對各組大鼠神經(jīng)行為功能缺損進行評分，干濕法測定48h腦水腫指數(shù)，使用IgG檢測大鼠血腦屏障通透性的改變，通過透射電鏡觀察各組大鼠顳底腦皮層超微結(jié)構(gòu)變化情況。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，SAH組、安慰劑組大鼠神經(jīng)功能評分、腦水腫指數(shù)、大鼠腦皮層中IgG含量明顯增高，電鏡下神經(jīng)細胞明顯損傷；SAH組與安慰劑組之間無明顯差異；低濃度和中濃度Cystatin C干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能評分、腦水腫指數(shù)、大鼠腦皮層中IgG含量較SAH組、安慰劑組明顯降低，鏡下神經(jīng)細胞輕度損傷；高濃度Cystatin C組大鼠神經(jīng)功能評分、腦水腫指數(shù)、大鼠腦皮層中IgG含量較SAH組、安慰劑組增高，鏡下神經(jīng)細胞明顯損傷。本發(fā)明中，可將本發(fā)明中的Cystatin C采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成適用于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選將Cystatin C制備成適用于胃腸道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊劑或控釋、緩釋制劑。在本發(fā)明中CystatinC藥物組合物的藥物制劑中，根據(jù)不同的制劑形式或制劑規(guī)格，所述組合物在制劑中的含量可以為質(zhì)量計為1°/Γ99%，優(yōu)選為109Γ90%;本發(fā)明所述的藥學上可接受的載體為組合物中制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明活性成分發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提，所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進行制備。本發(fā)明中，組合物的制備方法沒有限制，Cystatin C直接做成制劑，或者分別或/和輔料混合后做成制劑，然后安裝本領(lǐng)域常規(guī)的方式進行包裝，與其他輔料混合制成制劑。本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進行適當?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在哺乳動物體內(nèi)能夠達到有效的血藥濃度為前提。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明通過實驗證實，低濃度和中濃度(O. 2、· 5ug/ml)的Cystatin C能夠改善SAH后大鼠神經(jīng)行為功能缺損、降低腦水腫、減輕血腦屏障的破壞，提示一定濃度的Cystatin C可以減輕實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠的早期腦損傷,但過高濃度的CystatinC不能減輕SAH后大鼠早期腦損傷，且可能具有一定的毒性。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖I為假手術(shù)組、SAH組、安慰劑組、低濃度Cystatin C組、中濃度Cystatin C組、高濃度Cystatin C組腦組織神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果；
圖2為假手術(shù)組、SAH組、安慰劑組、低濃度Cystatin C組、中濃度Cystatin C組、高濃度Cystatin C組腦組織的腦水腫指數(shù)結(jié)果；圖3為假手術(shù)組、SAH組、安慰劑組、低濃度Cystatin C組、中濃度Cystatin C組、高濃度Cystatin C組腦組織中IgG陽性細胞表達結(jié)果；其中A-假手術(shù)組，B-SAH組*，C-安慰劑組#，D-低濃度Cystatin C組* * , E-中濃度Cystatin C組##, F-高濃度CystatinC組&;圖4為假手術(shù)組、SAH組、安慰劑組、低濃度Cystatin C組、中濃度Cystatin C組、高濃度Cystatin C組腦組織的投射電鏡超微結(jié)構(gòu)圖片；A_假手術(shù)組，B/C/D-SAH組，E-低濃度 Cystatin C 組，F(xiàn)/G-中濃度 Cystatin C 組，H-高濃度 Cystatin C 組。
具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做 進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例Cystatin C對SAH后早期腦損傷的影響I.材料I. I常規(guī)試劑及設(shè)備Cystatin C(北京博奧森生物公司)、IgG(北京博奧生物公司)、生理鹽水、蒸餾水、安爾碘消毒液、10%水合氯醛、10%福爾馬林溶液、lml、2ml、20ml注射器，32G留置套管針，勻衆(zhòng)玻璃皿、精密電子稱、電子烘箱、光學顯微鏡，透射電子顯微鏡，顯微手術(shù)器械一套，手術(shù)縫合針線。I. 2實驗對象成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物研究中心提供，雄性，體重280 350g。術(shù)前單籠飼養(yǎng)，保持室溫18 22°C，自由飲食飲水，安靜、避光環(huán)境中飼養(yǎng)。2.實驗方法2. I實驗動物分組SD大鼠48只，隨機分為以下四組，具體如下(I)假手術(shù)組8只，對照組顱骨頂部開骨窗但不注入動脈血；(2) SAH組8只，通過視交叉前池一次注血O. 3ml構(gòu)建SAH后活體EBI模型；(3)安慰劑組8只，建模方式同SAH組，注血前30分鐘相同途徑向交叉池內(nèi)注入
O.Iml生理鹽水；(4) Cystatin C 組24 只，治療組又分為 O. 2ug/ml,O. 5ug/ml, I. Oug/ml 三個亞組(每個亞組8只)，建模方式同SAH組，注血前30分鐘相同途徑向交叉池內(nèi)注入
O.ImlCystatin C。2. 2大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的制作將大鼠用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉成功后，俯臥固定于操作臺上，頭頂部備皮，安爾碘常規(guī)消毒。根據(jù)文獻[Prunell GF, Mathiesen T, Diemer NH, et al.Experimental sub—arachnoid hemorrhage subarachnoid blood volume, mortalityrate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in threediferent rat models [J]. Neurosurgery, 2003, 52 (I) 165一176.]，米用視交叉前池一次注血建SAH模型。大鼠顱骨頂部前囟前方7. 5mm開骨窗，骨窗直徑約2mm，出血較多時可用骨蠟壓迫止血，翻轉(zhuǎn)大鼠，使其仰臥位，大鼠腹股溝處備皮消毒，解剖并分離出股動脈，Iml注射器不抗凝下抽取股動脈血O. 35ml，采血后迅速結(jié)扎股動脈止血。翻轉(zhuǎn)大鼠，矢狀面進針，方向與冠狀面呈45度角，進針約10-12mm至視交叉前池，20s內(nèi)注入O. 3ml的非肝素化動脈血，注血后穿刺點壓迫2min，縫合切口。假手術(shù)組骨頂部開骨窗但不注入動脈血。安慰劑組建模方式同SAH組，注血前30分鐘相同途徑向交叉池內(nèi)注入O. Iml生理鹽水。CystatinC組建模方式同SAH組，注血前30分鐘相同途徑向交叉池內(nèi)注入0. ImlCystatin C。各組大鼠建模成功后背部皮下注射IOml生理鹽水防止術(shù)后脫水，保溫燈照保溫至清醒后單籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。2. 3.標本留取
各組動物在SAH后48h再次以10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死，迅速開顱行大體觀察并快速切取顳底皮層腦組織三份，一份即刻用于檢測腦水腫指數(shù)，一份存于福爾馬林液中，用于檢測腦組織IgG含量分析血腦屏障變化，一份存于2. 5%戊二醛中用于透射電鏡觀察。 2. 4神經(jīng)行為功能評分按照表I評分標準，對各組大鼠SAH后48h內(nèi)大鼠的進食量、活動力和功能缺損三項行為活動分別評分。表I神經(jīng)行為功能評分標準
項目_行為活動_m_
進食量吃完所給食物O
吃了所給食物的一部分I
_沒有吃_2_
活動力在籠子內(nèi)自由行走O
在刺激下才走I
_幾乎不動_2_
功能缺損無功能缺損 O 行走不穩(wěn)定 I _不能行走_2_2. 5腦水腫指數(shù)測定各組大鼠于蛛血蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h水合氯醛麻醉，開顱取全腦，切取顳底腦皮質(zhì)迅速放入預(yù)先稱好重量的玻片上稱重，此重量減去玻片重量即為濕重，隨后放入烤箱中在100° C條件下烘72h后再次稱重，此重量減去玻片重量即為干重，腦水腫指數(shù)即可用下述公式求得。腦水腫指數(shù)=[(濕重-干重)/濕重]X 100%。2. 6IgG檢測血腦屏障的變化
各組大鼠于蛛血蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h水合氯醛麻醉，開顱取全腦，切取顳底腦皮質(zhì)組織，保存于10%福爾馬林溶液中，使用免疫組化方法IgG抗體處理標本，檢測各組皮層腦組織中IgG含量，光學顯微鏡下觀察各組標本IgG陽性細胞表達情況。顯微鏡下觀察并攝像，每張切片隨機選取10個高倍鏡(X100)視野進行觀察。細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。判斷標準隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)其中陽性細胞的比率進行評估〈25%為I分，25% 49%為2分，>50%為3分。2. 7透射電鏡標本的制作及觀察各組大鼠于蛛血蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h大鼠麻醉后快速斷頭處死，剪開頭皮，咬開并去除顱骨取出顳底腦皮質(zhì)組織。標本切取后立即置于預(yù)冷的2. 5%戊二醛中固定，并置于冰箱中保存?zhèn)溆?。?jīng)戊二醛固定的標本用O. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗4次，每次15分鐘，再用1%鋨酸(4°0固定1-2小時，再用O. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次15分鐘，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂浸泡包埋，恒溫箱內(nèi)70°C聚合16小時后修塊，半薄切片定位后超薄切片，透射電鏡下觀察并拍片。
3.統(tǒng)計學分析本實驗所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土SD表示，采用SPSS 17. O統(tǒng)計軟件，行單因素方差分析或t檢驗，P〈0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果如下I)動物存活情況假手術(shù)組全部存活；SAH模型組死亡率27%(3/11大鼠)，I只在注血后呼吸、心跳停止而死亡，I只在SAH后30h死亡；安慰劑組死亡率33%(4/12大鼠)，2只在注血后呼吸、心跳停止而死亡，2只分別在SAH后24h、35h死亡；Cystatin C組死亡率12%(3/26大鼠)中注血后當場死亡2只，I只于建模后18h后死亡，余存活。死亡動物后隨機增補動物至各組。2)大鼠的神經(jīng)功能評分假手術(shù)組大鼠精神、食欲正常。SAH組大鼠精神萎靡，攝食減少，呈頭低位蜷縮狀，活動明顯減少，小部分可出現(xiàn)球結(jié)膜下出血。Cystatin C組大鼠攝食、活動尚可，未見肢體功能缺損。各組神經(jīng)功能評分如表2所示和圖I所示。與假手術(shù)組比，SAH組神經(jīng)功能明顯受損(*Ρ〈0·01);安慰劑組與SAH組無明顯差異(#Ρ>0. 05);與SAH組相比，Cystatin C組(O. 2ug/ml) ( * * Ρ〈0· 05)、Cystatin C 組(O. 5ug/ml) (##Ρ〈0· 05)干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能損傷減輕；Cystatin C組(I. Oug/ml)與SAH組比,神經(jīng)功能損傷加重(&P〈0. 05)。表2各組神經(jīng)功能評分
權(quán)利要求
1.一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的藥物組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物組合物包含藥學上有效量的Cystatin C和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的藥物組合物中的應(yīng)用。通過實驗證實，一定濃度的Cystatin C能夠改善SAH后大鼠神經(jīng)行為功能缺損、降低腦水腫、減輕血腦屏障的破壞，提示一定濃度的Cystatin C可以減輕實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠的早期腦損傷。
文檔編號A61K38/17GK102895653SQ20121030139
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者王中, 陳罡, 劉一之, 李建珂 申請人:蘇州大學附屬第一醫(yī)院